龔 高，李曉凱，喬 賢，王鳳紅，張 磊，張令天，嚴(yán)曉春，凌智聰，王志英，2，3，王瑞軍，2，3，劉志紅，2，3，王志新，2，3，范一星，何利兵，張燕軍，2，3，李金泉，2，3，蘇 蕊，2，3

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉羊遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術(shù)研究中心，呼和浩特 010018；4.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866；5.內(nèi)蒙古金萊牧業(yè)科技有限責(zé)任公司，呼和浩特 010018)

內(nèi)蒙古絨山羊是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期選育形成的絨肉兼用型優(yōu)良畜種，其被毛屬于異質(zhì)毛被，皮膚中初級(jí)毛囊產(chǎn)生有髓的粗毛、次級(jí)毛囊產(chǎn)生無(wú)髓的絨毛，絨毛是一種價(jià)高質(zhì)優(yōu)的紡織原料[1]。山羊的絨毛品質(zhì)檢測(cè)工作存在勞動(dòng)強(qiáng)度大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，而粗毛長(zhǎng)度易于觀察鑒定，王志英[2]、李金泉[3]研究發(fā)現(xiàn)粗毛和絨毛具有較強(qiáng)的表型相關(guān)和遺傳相關(guān)，其中毛長(zhǎng)和絨長(zhǎng)呈較高的正遺傳相關(guān) (0.51)、毛長(zhǎng)和絨細(xì)呈負(fù)遺傳相關(guān)(-0.28)。因此，毛長(zhǎng)對(duì)絨毛品質(zhì)性狀的間接選擇具有一定的參考價(jià)值，有助于加快絨山羊的遺傳改良進(jìn)展。

在中國(guó)絨山羊生產(chǎn)及選育工作中，粗毛纖維性狀多樣性的研究較為豐富。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，娜清等[4-5]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古絨山羊不同個(gè)體之間的粗毛長(zhǎng)度存在較大差異，變幅為5～34 cm，根據(jù)粗毛毛長(zhǎng)測(cè)量值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將其分為長(zhǎng)毛型(毛長(zhǎng)>22 cm)、短毛型(毛長(zhǎng)≤13 cm)和中間型(13 cm<毛長(zhǎng)≤22 cm) 3種類型，為不同毛被類型的劃分提供了依據(jù)，并通過(guò)表型相關(guān)和遺傳相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)毛長(zhǎng)與其他絨毛品質(zhì)性狀(絨厚、產(chǎn)絨量、抓絨后體質(zhì)量、絨長(zhǎng)、毛細(xì)和絨細(xì))均有極顯著相關(guān)(P<0.01)。其中典型的長(zhǎng)毛型具有毛長(zhǎng)而光亮，絨毛長(zhǎng)而潔白等特征；典型的短毛型具有粗毛粗糙、毛稀短、光澤欠佳等特征[6]。李學(xué)武等[7-9]發(fā)現(xiàn)毛細(xì)和絨細(xì)隨毛長(zhǎng)的增加而降低，絨長(zhǎng)隨毛長(zhǎng)的增加而增加，在3種類型中，長(zhǎng)毛型毛細(xì)和絨細(xì)最細(xì)，絨長(zhǎng)最長(zhǎng)；長(zhǎng)毛型個(gè)體產(chǎn)絨量和體質(zhì)量的表型值最高，遺傳力最高，遺傳相關(guān)也最大，選擇長(zhǎng)毛型個(gè)體可以對(duì)體質(zhì)量、產(chǎn)絨量和絨細(xì)等其他絨毛品質(zhì)性狀進(jìn)行選育，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其他重要經(jīng)濟(jì)性狀的間接選擇。范一星[10]利用RNA-seq的方法，比較1年12個(gè)月份中長(zhǎng)毛型絨山羊和短毛型絨山羊皮膚組織基因的表達(dá)情況，共檢測(cè)到448 個(gè)差異基因，GO生物學(xué)功能富集分析主要富集到中間絲、中間絲細(xì)胞骨架和細(xì)胞骨架部分，其中角蛋白基因家族被顯著富集，該家族基因可能與不同毛被類型相關(guān)。

羊毛纖維主要由角蛋白(KRTs)和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(KAPs)構(gòu)成，角蛋白的組成與絨毛纖維品質(zhì)有密切關(guān)聯(lián)，通過(guò)對(duì)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)絨山羊遺傳資源保護(hù)與利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)前期RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)KRT74基因在不同毛被類型中為差異表達(dá)基因。KRT74基因是角蛋白家族成員之一，屬于 Ⅱ 型內(nèi)根鞘角蛋白，又名K6irs4，該蛋白是負(fù)責(zé)上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的中間絲蛋白，在內(nèi)根鞘赫胥黎層特異表達(dá)。目前，已有研究證實(shí)KRT74基因的突變與人常染色體顯性遺傳性羊毛狀發(fā)(ADWH)這一疾病有關(guān)，發(fā)現(xiàn)KRT74基因?qū)S持毛發(fā)生長(zhǎng)和穩(wěn)定毛發(fā)形態(tài)起著重要作用[11-14]。但該基因?qū)q山羊羊毛生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制尚不明確，本試驗(yàn)運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析不同毛被類型山羊KRT74的基因表達(dá)和蛋白結(jié)構(gòu)特征，探究毛被類型的分子機(jī)制及相關(guān)調(diào)控基因，為絨山羊的選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源于內(nèi)蒙古金萊牧業(yè)科技有限責(zé)任公司，根據(jù)2018年毛長(zhǎng)測(cè)量數(shù)據(jù)選取體型相似的長(zhǎng)毛型(粗毛毛長(zhǎng)為23～26 cm)、短毛型(粗毛毛長(zhǎng)為7～13 cm)內(nèi)蒙古絨山羊阿爾巴斯型2歲母羊各7只。于9月(生長(zhǎng)期)、12月(退行期)和次年3月(休止期)采集體側(cè)肩胛骨后一掌處 1 cm2的皮膚組織，立即放于液氮中，隨后保存于 -80 ℃超低溫冰箱，用于后續(xù)總RNA的提取。內(nèi)蒙古絨山羊毛長(zhǎng)測(cè)定方法：在絨山羊體側(cè)肩胛骨后一掌處，將羊毛拉直后測(cè)得的羊毛自然長(zhǎng)度為毛長(zhǎng)[3]。

1.2 試驗(yàn)試劑

Trizol Reagent(Invitrogen)，氯仿，異丙醇，體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精，TAE電泳緩沖液，瓊脂糖，核酸染料，無(wú)菌無(wú)酶水，DL2000 DNA marker(TAKARA)，DL500 DNA marker(TAKARA)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A，TAKARA)，PremixTaq酶(RR901A,TAKARA)，熒光定量試劑盒(RR820A，TAKARA)等。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1KRT74基因信息的獲取 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載山羊capra hircusKRT74基因(登錄號(hào)：XM_005701851.3)的編碼區(qū)序列和氨基酸序列，同時(shí)下載綿羊Ovisaries、牛Bostaurus、人Homosapiens、馬Equuscaballus、豬Susscrofa、大熊貓Ailuropodamelanoleuca、雙峰駝Camelusferus、獼猴Macacamulatta、旱獺Marmotamarmotamarmota的KRT74基因的編碼區(qū) 序列。

1.3.2 山羊KRT74基因生物信息學(xué)分析 通過(guò)DNAstar軟件中MegAlign進(jìn)行基因的同源性比對(duì)；用Mega 6.0軟件構(gòu)建KRT74基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；使用ExPASy網(wǎng)站中ProtParam和ProtScale分別分析KRT74蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性；通過(guò)SignalP 4.1預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；通過(guò)TMHMM預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；通過(guò)Smart預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；通過(guò)PSORTⅡprediction和TargetP 1.1進(jìn)行亞細(xì)胞的定位；利用Hopfield和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。具體分析工具及相應(yīng)網(wǎng)址見(jiàn)表1[15-23]。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.4.1 總RNA的提取及cDNA合成 根據(jù)Trizol法提取皮膚樣品總RNA。通過(guò)NanoDrop 2000測(cè)定總RNA質(zhì)量濃度，并用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。以皮膚組織總RNA為模板，使用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，保存于-20 ℃ 冰箱，備用。

1.4.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊KRT74基因序列，GAPDH和β-actin基因的mRNA序列，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程公司合成，引物序列見(jiàn)表2。

1.4.3 檢測(cè)KRT74基因相對(duì)表達(dá)量 以皮膚組織cDNA為模板，使用PCR儀擴(kuò)增目的基因片段驗(yàn)證引物的特異性。PCR產(chǎn)物使用25 g/L瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增片段大小，并確定最佳退火溫度。

表1 生物信息學(xué)分析工具及相應(yīng)網(wǎng)址Table 1 Bioinformatic analysis tool and website

表2 KRT74及內(nèi)參基因引物序列Table 2 Primer sequence of KRT74 and housekeeping gene

隨后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為10 μL：TB Green Premix ExTaqⅡ 5 μL、cDNA模板1 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、ddH2O 3 μL。三步法擴(kuò)增程序：預(yù)變性 95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)(95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s)共45個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析(95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、97 ℃ 15 s)；冷卻37 ℃ 30 s。陰性對(duì)照用無(wú)酶水代替cDNA模板，每個(gè)樣品做3個(gè)技術(shù)重復(fù)。對(duì)定量結(jié)果做溶解曲線分析，檢測(cè)擴(kuò)增片段的特異性，通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算KRT74基因的相對(duì)表達(dá)量[24-26]。

雙內(nèi)參基因的Cq值計(jì)算：

2-△△Ct法計(jì)算公式：

F=2-(Cq目的基因-Cq內(nèi)參基因)-(Cq校正組目的基因-Cq校正組內(nèi)參基因)

差異倍數(shù)比值R：

R=F長(zhǎng)毛型/F短毛型

1.5 數(shù)據(jù)分析

計(jì)算基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與匯總，使用SAS 9.2 ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并使用CORR對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析，繪制基因相對(duì)表達(dá)圖。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1KRT74基因序列分析與同源性分析 山羊中KRT74基因位于5號(hào)染色體上，含有9個(gè)外顯子，mRNA的長(zhǎng)度為2 643 bp，其中編碼序列長(zhǎng)度為1 623 bp，共編碼540個(gè)氨基酸。通過(guò)DNAstar軟件中GeneQuest對(duì)山羊KRT74基因mRNA序列進(jìn)行堿基組成分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) A+T堿基數(shù)占43.7%，G+C堿基數(shù)占56.3%，比較穩(wěn)定。將下載的9個(gè)物種的KRT74編碼區(qū)序列和山羊的編碼區(qū)序列用DNAstar軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，山羊KRT74基因與綿羊和牛的同源性較高(圖1-a)。隨后利用Mega 6.0軟件的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)山羊、綿羊和牛聚為一類，大熊貓、旱獺、人和獼猴聚為一類(圖1-b)。

圖1 KRT74基因核苷酸序列同源性比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Homology alignment of nucleotide sequence and phylogenetic tree of KRT74

2.1.2 KRT74蛋白基本理化性質(zhì)分析 使用ProtParam預(yù)測(cè)山羊KRT74蛋白的基本理化性質(zhì)和組成成分。結(jié)果顯示，山羊KRT74蛋白分子式為C2514H4129N747O820S23；分子質(zhì)量為58.67 ku；理論等電點(diǎn)為8.16，偏堿性；共包含20種氨基酸(表3)，其中亮氨酸(Leu)和絲氨酸(Ser)含量高，占10.6%，色氨酸(Trp)含量最低，占 0.2%；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)(Asp和Glu)為70，帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)(Arg和Lys)為73；不穩(wěn)定系數(shù)為36.40(<40)，為穩(wěn)定蛋白；平均親水性(DRAVY)為-0.448，說(shuō)明該蛋白具有一定的親水性。使用ProtScale對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行親疏水性分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，發(fā)現(xiàn)該蛋白為親水性蛋白，大部分氨基酸表現(xiàn)為親水性，其中第62個(gè)氨基酸表現(xiàn)出最大的疏水性，為1.633，第524個(gè)氨基酸表現(xiàn)出最大的親水性，為-2.778，該結(jié)果與ProtParam預(yù)測(cè)相同。

表3 山羊KRT74氨基酸組成分析Table 3 Analysis of amino acid composition of KRT74 in goat

2.1.3 KRT74蛋白信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)SignalP 4.1預(yù)測(cè)山羊KRT74蛋白質(zhì)N-末端潛在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖3-a，該蛋白S的平均值為0.106，其中C-score、S-score、Y-score均未達(dá)到閾值，說(shuō)明山羊KRT74蛋白不存在N-末端信號(hào)肽序列，不具有信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。通過(guò)TMHMM預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見(jiàn)圖3-b，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白未形成跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖2 山羊KRT74蛋白疏水性預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of hydrophilicity/ hydrophobicity of KRT74 protein in goat

圖3 山羊KRT74蛋白信號(hào)肽與蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of signal peptide and prediction of transmembrane structure of KRT74 protein in goat

2.1.4 KRT74亞細(xì)胞定位與蛋白結(jié)構(gòu)域分析 蛋白質(zhì)功能與其亞細(xì)胞的定位緊密相關(guān)，通過(guò)PSORT II prediction和TargetP 1.1分析KRT74蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果見(jiàn)表4，該蛋白主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中；少量分布在過(guò)氧化物酶體和線粒體中；在分泌通路中信號(hào)肽比例較小，與SignalP 4.1分析結(jié)果一致；在線粒體靶向肽占比較高，不屬于分泌蛋白。

通過(guò)Smart分析蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見(jiàn)圖4，山羊KRT74蛋白包含4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，在第2～第141位氨基酸具有Pfam：Keratin_ 2_head結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域主要位于 Ⅱ 型角蛋白家族的N端區(qū)域，這種結(jié)構(gòu)域?yàn)樯掀ぜ?xì)胞提供重要機(jī)械支持；在第144～457氨基酸處具有Filament結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞骨架和核膜的原始成分；在第492～513和第463～484氨基酸處出現(xiàn)2個(gè)Low complexity結(jié)構(gòu)域。

表4 山羊KRT74蛋白亞細(xì)胞定位Table 4 Subcellular localization of KRT74 protein in goat

圖4 山羊KRT74蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.4 Protein domain of KRT74 in goat

2.1.5 KRT74蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用Hopfield工具中PHD算法預(yù)測(cè)山羊KRT74蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5-a，其中有279個(gè)(51.67%)氨基酸可能形成α螺旋，44個(gè)(8.15%)氨基酸可能形成延伸鏈，217(40.16%)個(gè)氨基酸可能形成無(wú)規(guī)則卷曲。使用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)KRT74蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖5-b。該蛋白主要由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，并呈現(xiàn)出一種從中心向外伸展的結(jié)構(gòu)，可能該蛋白為細(xì)胞骨架蛋白，這種結(jié)構(gòu)能起到一個(gè)支架的作用，利于維持細(xì)胞形態(tài)。

H(h).α螺旋； C(c).無(wú)規(guī)則卷曲E(e).延伸鏈

2.2 皮膚組織總RNA質(zhì)量檢測(cè)

總RNA提取質(zhì)量影響qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)NanoDrop 2000檢測(cè)顯示總RNA質(zhì)量濃度均在180 ng/μL以上，OD260/280均為 1.80～2.01；抽樣電泳檢測(cè)結(jié)果顯示樣品RNA條帶清晰完整，無(wú)降解，不含DNA條帶；提取皮膚總RNA質(zhì)量良好，符合要求，能夠用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試驗(yàn)。

2.3 KRT74的表達(dá)量分析

通過(guò)對(duì)基因引物特異性的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物片段大小與預(yù)測(cè)擴(kuò)增片段一致，退火溫度為60 ℃ 時(shí)擴(kuò)增效果較好。KRT74、β-actin和GAPDH的退火溫度選擇 60 ℃ 進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。

用GAPDH和β-actin作為雙內(nèi)參基因，對(duì)絨毛生長(zhǎng)的 3個(gè)時(shí)期的長(zhǎng)毛型和短毛型絨山羊皮膚組織中KRT74基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6。發(fā)現(xiàn)在 3 個(gè)時(shí)期中長(zhǎng)毛型絨山羊皮膚KRT74基因的表達(dá)量均顯著高于短毛型(P<0.05)，差異倍數(shù)在1.6左右。對(duì) 3個(gè)時(shí)期間進(jìn)行方差分析未發(fā)現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，但該基因在休止期的表達(dá)量最低。

2.4 KRT74基因表達(dá)量與毛長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析

內(nèi)蒙古絨山羊皮膚組織KRT74基因mRNA表達(dá)量與毛長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，KRT74基因表達(dá)量與毛長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.766 05。

3 討 論

絨毛纖維90%是由角蛋白(KRT)和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(KAPs)構(gòu)成，角蛋白在毛發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著機(jī)械支撐的作用，其組成與絨毛纖維品質(zhì)有密切關(guān)聯(lián)，研究角蛋白能夠從分子水平上解析絨毛品質(zhì)性狀形成機(jī)理[27]。

KRT71、KRT72、KRT73、KRT74基因均屬于 Ⅱ 型內(nèi)根鞘角蛋白基因，其編碼的蛋白均在毛囊內(nèi)根鞘中特異表達(dá)，共同參與毛囊的形態(tài)發(fā)生過(guò)程[14]。其中KRT71基因研究較為廣泛，已在多種哺乳動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)，并與毛發(fā)表型有關(guān)。KRT71基因的突變會(huì)導(dǎo)致毛囊內(nèi)根鞘 的Henle’s層和Huxley’s層形成絲狀聚集體，使毛干彎曲[28]；mRNA和蛋白表達(dá)量與羊駝毛囊纖維彎曲度成正相關(guān)[29-30]；并發(fā)現(xiàn)其與灘羊幼年時(shí)期卷曲被毛的形成有關(guān)[31]；第二外顯子錯(cuò)義突變(c.451C>T)和第7外顯子結(jié)構(gòu)變異(c.1266_1273delinsACA)均影響犬的卷毛性狀[32-33]。

*P<0.05

有研究表明KRT74基因能影響毛發(fā)的形態(tài)特征，該基因的突變能夠干擾中間絲的正確形成，導(dǎo)致毛囊崩潰，并與人類ADWH疾病有關(guān)，ADWH常在2歲前出現(xiàn)，臨床特征是毛發(fā)生長(zhǎng)緩慢，顏色灰白，毛發(fā)纖維脆弱易斷裂，緊密卷曲，呈羊毛狀外觀和彌漫性稀少。2010年Shimomura等[34]對(duì)1個(gè)巴基斯坦ADWH家系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)患者KRT74基因第一外顯子中均發(fā)生一個(gè)雜合性突變(c.444 C>G)，KRT74基因編碼內(nèi)毛根鞘特定上皮角蛋白K74，K74蛋白突變破壞角蛋白中間絲形成，因而影響毛發(fā)的生長(zhǎng)。隨后Wasif等[35]對(duì)2個(gè)受ADWH影響的家系進(jìn)行研究，在KRT74基因中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新突變，A家系中存在一個(gè)剪接受體突變(c.IVS8-1 G>A)，影響頭發(fā)的緊密卷曲；B家系中存在一個(gè)錯(cuò)義突變(c.1444 G>A)，攜帶該錯(cuò)義突變的臨床表現(xiàn)為頭皮毛發(fā)稀疏。2019年于聰?shù)萚36]分析1例常染色體隱性遺傳性羊毛狀發(fā)(ARWH)的患兒及其父母的基因突變，檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)KRT74的基因突變，但在LIPH基因中發(fā)現(xiàn)3處雜合突變，導(dǎo)致該ARWH家系的臨床表型。許鐘峯[37]研究黑白花陸川豬皮膚毛色形成的分子機(jī)制，對(duì)黑色和白色皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)GO功能極顯著富集在角蛋白中，在黑色皮膚中KRT74基因表達(dá)上調(diào)，推測(cè)黑色皮膚和白色皮膚中角蛋白構(gòu)成有所不同。

本研究發(fā)現(xiàn)，KRT74基因在山羊和綿羊之間較保守，與人類、獼猴、馬等相距較遠(yuǎn)，與物種間親緣關(guān)系相符；山羊KRT74蛋白在氨基酸組成中絲氨酸占比最高，絲氨酸和蘇氨酸易被磷酸化，其磷酸化可影響毛的組裝和結(jié)構(gòu)[38]；該蛋白為親水性穩(wěn)定蛋白，未發(fā)現(xiàn)存在跨膜結(jié)構(gòu)與信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，能夠穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)；其存在4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ilament結(jié)構(gòu)域?yàn)榧?xì)胞骨架和核膜的原始成分，Keratin_2_head結(jié)構(gòu)域?yàn)樯掀ぜ?xì)胞提供機(jī)械支持。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白可能與細(xì)胞形態(tài)、毛發(fā)的結(jié)構(gòu)和形成有關(guān)。本研究結(jié)果表明，首次在絨山羊的皮膚組織中發(fā)現(xiàn)KRT74基因的表達(dá)水平與毛長(zhǎng)相關(guān)，該基因在長(zhǎng)毛型絨山羊皮膚中的表達(dá)量顯著高于短毛型，差異倍數(shù)為1.6；并發(fā)現(xiàn)KRT74基因相對(duì)表達(dá)量與毛長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)，初步推斷KRT74基因的表達(dá)能夠促進(jìn)羊毛長(zhǎng)度的生長(zhǎng)，并調(diào)控其他的絨毛品質(zhì)性狀。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明KRT74基因在長(zhǎng)毛型絨山羊皮膚組織中的表達(dá)水平顯著高于短毛型絨山羊，該基因表達(dá)量與內(nèi)蒙古絨山羊毛長(zhǎng)性狀呈顯著正相關(guān)，可能與羊毛生長(zhǎng)性狀有關(guān)，通過(guò)生物信息學(xué)的方法研究山羊KRT74基因及編碼蛋白的基本性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能，為今后研究KRT74基因與絨山羊不同毛被類型及毛發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育提供資料，并為研究人類毛發(fā)疾病提供新的思路。