周 瑛 張瀝文 周芳芳 劉韻子 劉 劍 王偉銘

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病相關(guān)的微血管并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計，2019年全球糖尿病患病率為9.3%（4.63億人），預(yù)測到2045年將上升至10.9%（7億人）［1］，其中30%～40%將發(fā)展為DN［2］。既往研究［3-4］結(jié)果表明，雖然DN的病理生理學(xué)核心是代謝紊亂，但是慢性微炎癥狀態(tài)也是其疾病進展的重要機制。因此，抑制免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在DN的治療中至關(guān)重要。

霉酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）是一種可以有效治療CKD的免疫抑制劑。MMF常見的不良反應(yīng)主要發(fā)生于胃腸道，臨床癥狀包括腹瀉、惡心、嘔吐和腹痛等，常伴有胃、十二指腸的糜爛、潰瘍和壞死，病理檢測可見小腸絨毛萎縮與小腸結(jié)腸炎癥反應(yīng)［5］。低聚果糖（FOS）可以調(diào)節(jié)腸道菌群，減輕炎癥反應(yīng)［6］。本研究擬明確MMF在DN中的作用及其機制，并探討FOS增強MMF腎臟保護作用的機制，以及其減輕MMF腸道不良反應(yīng)的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選擇5周齡無特定病原體（SPF）級遺傳背景為C57BL／KSJ的雄性db／db小鼠共30只，均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，并由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核批準。實驗動物分籠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院動物房，每籠5只，環(huán)境溫度為18～24℃。實驗期間予自由進食、飲水，普通飼料喂養(yǎng)，不使用胰島素和其他降糖藥物。適應(yīng)性喂養(yǎng)3周，在8周齡時隨機分入DN組、MMF組、MMF＋FOS組，每組10只。分別給予藥物干預(yù)：均采用每天灌胃給藥模式，DN組給予0.9%氯化鈉溶液0.01 mL／（g·d），MMF組給予MMF 30 mg／（kg·d），MMF＋FOS組給予MMF 30 mg／（kg·d）＋FOS 100 mg／（kg·d），共16周。

1.2 主要實驗儀器與藥物、試劑 主要實驗儀器為：小鼠代謝籠（北京佳源興業(yè)科技有限公司）、羅氏血糖儀（美國羅氏公司）、電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，PL-203）、全自動生物化學(xué)分析儀（深圳雷杜生命科技公司，Chemray 240）、渦旋混勻器（武漢賽維爾生物科技有限公司，MXF）、離心機（武漢賽維爾生物科技有限公司，D1008E）、石蠟切片機（德國徠卡公司）、普通光學(xué)顯微鏡（德國徠卡公司）。主要藥物、試劑為：FOS（美國Sigma公司，F(xiàn)8052）、MMF（美國Sigma公司，Y0000489）、正常兔血清（武漢博士德生物工程有限公司，AR1010）、檸檬酸（p H 6.0）抗原修復(fù)液、兔抗CD8多克隆抗體、兔抗CD4多克隆抗體、兔抗IL-6多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG，武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.3 標本采集 每周測定3組小鼠的體重，并經(jīng)小鼠尾靜脈取血測血糖。藥物干預(yù)結(jié)束后，用代謝籠收集3組小鼠24 h尿液，用于測定24 h尿蛋白定量；使用1%戊巴比妥鈉麻醉后行眼眶采血測血糖與血肌酐；0.9%氯化鈉溶液灌注小鼠全身后，取雙側(cè)腎臟，分別稱重，并截取回腸2 cm，以0.9%氯化鈉溶液清洗去除糞便。

1.4 腎臟與腸道組織病理學(xué)檢測 腎臟組織病理學(xué)檢測：一側(cè)腎臟2／3組織以中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切4μm薄片，過碘酸-希夫（PAS）染色，光學(xué)顯微鏡下400倍觀察?；啬c組織病理學(xué)檢測：選取回腸上段1 cm組織，同樣以中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切4μm薄片，H-E染色，光學(xué)顯微鏡下400倍觀察。腎臟組織與回腸組織每張切片各選取10個視野計算平均每個視野下組織病理染色陽性面積占比。另外，選取回腸上段黏膜面組織1 mm×1 mm×1 mm泡入電子顯微鏡（簡稱電鏡）液，經(jīng)過1%四氧化鋨固定、梯度乙醇溶液脫水、Epon812包埋，半薄切片用甲苯胺藍染色，將組織塊修成適合超薄切片的大小，厚度50 nm，載于200目銅網(wǎng)上，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛電子染色后，使用透射電鏡（日本日立公司）觀察、攝片。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 將4μm腎組織切片脫蠟、水化，予檸檬酸抗原修復(fù)液行抗原修復(fù)15 min，3%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉30 min，各自加入一抗（CD8，比例1∶1 000；CD4，比例1∶100；IL-6，比例1∶300），4℃孵育過夜，后滴加相應(yīng)二抗，37℃孵育50 min，并用3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。蘇木精染細胞核為藍色，DAB的陽性表達為棕黃色。光學(xué)顯微鏡下400倍或200倍觀察，每張切片選取10個視野，計算平均每個視野下CD8＋、CD4＋T淋巴細胞浸潤個數(shù)和IL-6陽性面積占比。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間顯著性檢驗采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FOS增強MMF對db／db小鼠的腎臟保護作用 8周齡時，DN組、MMF組和MMF＋FOS組小鼠的體重分別為（45.6±2.8）、（45.1±3.8）和（45.2±3.9）g；血糖分別為（26.7±5.7）、（25.0±3.4）和（23.5±4.7）mmol／L，組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）。灌胃給藥16周后，MMF組小鼠體重顯著低于DN組；MMF＋FOS組小鼠體重顯著高于MMF組（P值均＜0.05），而與DN組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。MMF或MMF＋FOS聯(lián)合給藥16周均未改善db／db小鼠隨機血糖、血三酰甘油和血肌酐水平（P值均＞0.05）。與DN組相比，MMF組小鼠24 h尿蛋白定量無顯著變化（P＞0.05），而MMF＋FOS組小鼠24 h尿蛋白定量水平顯著降低（P＜0.05）。見表1。各組24周齡小鼠腎組織PAS染色檢測顯示：DN組小鼠腎小球發(fā)生嚴重的系膜基質(zhì)增生和腎小球硬化，而MMF組和MMF＋FOS組小鼠則僅表現(xiàn)為輕度系膜基質(zhì)增生，未見明顯的腎小球硬化。見圖1。DN組系膜增生指數(shù)（0.362±0.042）高于（MMF組（0.235±0.032）和MMF＋FOS組（0.203±0.046），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。

表1 24周齡db／db小鼠一般情況與腎臟疾病表現(xiàn)（N＝10，±s）

表1 24周齡db／db小鼠一般情況與腎臟疾病表現(xiàn)（N＝10，±s）

與DN組比較：①P＜0.05。與FOS＋MMF組比較：②P＜0.05

組別 體重（g）隨機血糖（mmol／L）血三酰甘油（mmol／L）血肌酐（μmol／L）24 h尿蛋白定量（mg ）DN組 58.7±2.0 25.2±4.4 2.40±0.67 115.3±42.7 1.15±0.11 MMF組 52.3±2.1①② 27.0±5.2 1.63±0.56 86.1±22.5 0.85±0.23 MMF＋FOS組 57.6±2.3 29.1±5.7 1.49±0.19 87.1±22.0 0.72±0.29①

圖1 24周齡db／db小鼠腎組織PAS染色（×400）

2.2 FOS聯(lián)合MMF減輕db／db小鼠DN的機制 24周齡時，DN組db／db小鼠腎間質(zhì)有較多CD8＋T淋巴細胞浸潤。與DN組相比，MMF組和MMF＋FOS組腎間質(zhì)CD8＋T淋巴細胞的浸潤數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。各組腎間質(zhì)CD4＋T淋巴細胞浸潤數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腎組織IL-6免疫組織化學(xué)染色顯示，MMF組db／db小鼠腎組織IL-6表達比DN組顯著下調(diào)（P＜0.05）；MMF＋FOS組小鼠IL-6表達量亦較DN組小鼠顯著降低（P值均＜0.05）。見圖2、表2。

2.3 FOS減輕MMF對db／db小鼠腸道屏障的損傷 對各組小鼠回腸組織進行H-E染色觀察。與DN組相比，MMF組小鼠回腸腸絨毛腫脹、絨毛間隙縮小、相互擠壓造成凹陷，MMF＋FOS組未見上述病理學(xué)改變。進一步通過透射電鏡觀察各組小鼠回腸上皮細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)，MMF組小鼠呈現(xiàn)細胞緊密連接結(jié)構(gòu)紊亂，DN組和MMF＋FOS組小鼠未見明顯的細胞緊密連接損傷。見圖3。

圖2 24周齡db／db小鼠腎組織T淋巴細胞浸潤和IL-6表達情況

表2 24周齡db／db小鼠腎臟組織T淋巴細胞浸潤數(shù)量和IL-6表達比較（N＝10，±s）

表2 24周齡db／db小鼠腎臟組織T淋巴細胞浸潤數(shù)量和IL-6表達比較（N＝10，±s）

與DN組比較：①P＜0.05

組別CD8＋T淋巴細胞數(shù)量（／高倍視野）CD4＋T淋巴細胞數(shù)量（／高倍視野）IL-6陽性面積占比（%）DN組43.50±9.60 8.3±3.3 0.58±0.22 MMF組 24.80±9.50① 6.5±3.1 0.06±0.02①FOS＋MMF組16.80±5.70① 6.4±2.5 0.12±0.04①

圖3 24周齡db／db小鼠回腸組織病理學(xué)改變

3 討 論

DN是一種較為嚴重的慢性疾病。長期的高血糖刺激和炎癥反應(yīng)，可促使DN患者腎臟病變逐步進展，最終發(fā)展為CKD甚至終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）。

DN前期的病理特征主要表現(xiàn)為腎小球系膜增生、毛細血管基底膜增厚，后期以腎小管間質(zhì)纖維化為主。腎臟局部代謝紊亂引起的足細胞損傷、炎癥因子激活，是DN進展的主要因素［4］。

機體長期的高血糖和（或）高血脂狀態(tài)會導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）和晚期蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物（advanced oxidation protein products，AOPPs）在腎臟組織累積，促進腎臟細胞產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），誘導(dǎo)細胞凋亡，并激活TGF-β、單核細胞趨化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、TNF-α、IL-1和IL-6等；炎癥介質(zhì)的激活是慢性、無菌性炎癥反應(yīng)驅(qū)動下腎臟組織纖維化和結(jié)構(gòu)重塑的經(jīng)典途徑［7］。MMF活性代謝產(chǎn)物霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）通過非競爭性抑制嘌呤從頭合成途徑的關(guān)鍵酶——肌苷腺苷脫氫酶（inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH）的活性，促使DNA合成受阻，從而抑制T和B淋巴細胞的增殖［8］；此外，研究［9］結(jié)果表明，MMF抑制腎小球系膜細胞的增殖、腎小管間質(zhì)單核巨噬細胞的浸潤，以及多種細胞因子的產(chǎn)生，包括TGF-β1、MCP-1和TNF-α。既往研究［10］發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠中使用MMF，可以降低尿微量白蛋白水平，改善腎功能，其機制可能與MMF抑制NF-κB、TNF-α、IL-6等表達水平有關(guān)。MMF聯(lián)合苯那普利能更有效地降低DN大鼠的尿蛋白和血肌酐水平，同時抑制了腎組織中的轉(zhuǎn)分化相關(guān)因子α平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）和TGF-β1的表達［11］。本研究中，雖然MMF組小鼠較DN組尿蛋白量有減少趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在病理學(xué)改變方面，MMF顯著改善了db／db小鼠腎臟系膜增生、毛細血管基底膜增厚等病變，且這些病理學(xué)改善不依賴于血糖值的改變。同時，MMF組腎間質(zhì)的CD8＋T淋巴細胞浸潤數(shù)量減少，腎組織IL-6表達水平顯著下調(diào)。既往研究［12］顯示，鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的1型糖尿病及其腎病后期主要表現(xiàn)是CD8＋而非CD4＋T淋巴細胞在腎臟間質(zhì)浸潤的增加；有學(xué)者認為，DN可能是由CD4＋T淋巴細胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)促發(fā)和驅(qū)動的，而隨著組織損傷程度的加重，CD8＋T淋巴細胞在疾病后期的作用更加顯著。本研究觀察了24周齡db／db小鼠，即2型糖尿病相關(guān)腎病較晚期的病變，結(jié)果表明，MMF治療可能通過減少DN后期CD8＋T淋巴細胞的浸潤比例，以及降低該細胞相關(guān)細胞因子（趨化因子）IL-6水平，進而改善腎臟病理學(xué)表型。MMF抑制免疫細胞向腎組織趨化，并減少促炎癥細胞因子和（或）趨化因子的分泌，從而減弱巨噬細胞的趨化和募集，以抑制DN后期的腎臟纖維化，并延緩疾病進展［13］。

雖然，已有研究［14］證實，拮抗炎癥等多種病理生理學(xué)機制可介導(dǎo)MMF對腎臟的保護作用，但該免疫抑制劑具有嚴重的消化道不良反應(yīng)，如腹瀉、胃腸道潰瘍等。一項為期7 d的短期、大劑量MMF［100 mg／（kg·d）］干預(yù)大鼠的觀察研究發(fā)現(xiàn)，MMF組大鼠體重下降程度顯著高于其他組，且該藥物作用的靶臟器主要為空腸和回腸，從而引起腸道損傷［15］。由于MMF顯著的腸道不良反應(yīng)，使該藥物在臨床的應(yīng)用范圍和治療劑量受到了限制［16］；因此，如何在不影響MMF腎保護作用的條件下，減少MMF的腸道不良反應(yīng)成為臨床研究亟須解決的問題。

本研究選擇了FOS作為MMF的輔助治療劑。一方面，F(xiàn)OS是多種益生菌的天然培養(yǎng)基，可以刺激腸道保護性菌群的生長，如雙歧桿菌和乳酸桿菌［17］。既往研究［18-19］發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的Wistar大鼠糖尿病模型中，使用FOS可以有效改善實驗動物體重，減少尿蛋白排泄量，也可改善糖尿病引起的腎臟組織病理學(xué)損傷。在poloxamer-407（PX-407）誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型中，加用FOS可以降低模型大鼠血肌酐、尿素氮和AGEs水平［20］。而在小鼠的系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型中觀察到，乳酸桿菌可以減少小鼠蛋白尿量［21］，降低脾細胞中IL-6水平［22］。另一方面，腸道微生物群失調(diào)，如纖毛菌屬增加，其抗原可通過激活CD8＋T淋巴細胞，加速糖尿病進展［23］。CKD患者常有腸道生態(tài)失調(diào)、腸道通透性增加和脂多糖循環(huán)水平增高的現(xiàn)象［24］，從而激活CD4＋和CD8＋T淋巴細胞，導(dǎo)致全身性炎癥［25］，進而加速CKD進展。本研究結(jié)果顯示，在MMF基礎(chǔ)上聯(lián)合使用FOS，不僅有效減少了MMF的消化道不良反應(yīng)，遏制了小鼠體重減輕，同時，更顯著減少了模型小鼠24 h尿蛋白定量，改善了小鼠腎臟系膜增生和毛細血管基底膜增厚等病理學(xué)改變；機制研究顯示，F(xiàn)OS聯(lián)合MMF的腎臟保護作用，主要通過抑制組織IL-6表達和減少CD8＋T淋巴細胞在腎臟浸潤數(shù)量介導(dǎo)。

FOS除了可有效改善機體炎癥反應(yīng)，對腸道結(jié)構(gòu)損傷也有一定的修復(fù)作用。在非酒精性脂肪肝模型中，小鼠回腸絨毛顯著縮短［26］，而維持腸道屏障功能至關(guān)重要的兩個蛋白質(zhì)閉合蛋白-1（occludin-1）和密蛋白-1（claudin-1）表達量亦顯著降低，上述病理改變考慮與p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路的磷酸化和激活有關(guān)；而加用FOS后可部分逆轉(zhuǎn)上述病理生理學(xué)改變［27］。對80%接受空腸切除的新生仔豬使用益生菌，可以增加仔豬回腸黏膜重量及其絨毛長度，其機制可能是益生菌促進了回腸上皮細胞的增殖［28］。對5／6腎切除大鼠使用益生菌，可提高結(jié)腸中被下調(diào)的緊密連接蛋白［如claudin-1、閉鎖小帶蛋白（ZO）-1等］表達水平，改善腸道的通透性，減輕全身炎癥反應(yīng)［29］。一項針對結(jié)直腸癌術(shù)后患者的meta分析［30］發(fā)現(xiàn)，使用益生菌改善了腸道黏膜屏障，主要表現(xiàn)為occludin-1表達水平的升高、細菌易位頻率的降低，以及分泌性免疫球蛋白Ig A水平的升高。Chung等［31］發(fā)現(xiàn)在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中加用FOS后，抑制了腸道黏膜細菌的殺傷活性，減少了細菌尤其是致病性肺炎克雷伯菌易位的發(fā)生率，降低了機體內(nèi)毒素水平。同樣，本研究證實，F(xiàn)OS一定程度上可逆轉(zhuǎn)MMF造成的回腸絨毛腫脹和細胞緊密連接結(jié)構(gòu)的紊亂，但其具體機制需進一步研究以揭示。

綜上所述，本研究證實MMF通過減少CD8＋T淋巴細胞在腎臟的浸潤數(shù)量，下調(diào)相關(guān)細胞因子和趨化因子IL-6的表達，以減輕DN的病理損傷程度，而其腎臟保護作用不依賴于血糖水平的下調(diào)。加用FOS后，不僅輔助了MMF對模型小鼠的腎臟保護作用，還有效減少了MMF相關(guān)的腸道結(jié)構(gòu)和屏障功能損傷等不良反應(yīng)。研究結(jié)果表明，F(xiàn)OS聯(lián)合MMF在DN的治療中具有有益作用，靶向拮抗炎癥反應(yīng)等機制可能是延緩DN向ESRD進展的新策略。