楊 康，王路逸，吳澤宇，童 蕾，馮 亮

(1.中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074；2.中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430074；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

湖泊污染會(huì)對(duì)湖泊水生生態(tài)系統(tǒng)和社會(huì)服務(wù)功能造成嚴(yán)重影響。由于多數(shù)湖泊與外部系統(tǒng)處于半連通甚至不連通狀態(tài)，物質(zhì)循環(huán)效率降低，大量污染物質(zhì)排放到湖泊后會(huì)產(chǎn)生富集，使湖泊水體的顏色和透明度發(fā)生改變，產(chǎn)生異味。宏觀上會(huì)引起生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)動(dòng)植物的死亡，降低物種多樣性，帶來惡性循環(huán)；微觀上會(huì)改變湖泊水體和沉積物中微生物的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步影響物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán)過程[1-3]。

自然作用輸入到湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的氮元素通過生物地球化學(xué)循環(huán)可以保持動(dòng)態(tài)的穩(wěn)定，其中30%～50%的氮可以通過微生物反硝化作用去除。反硝化過程大多發(fā)生在湖泊深水—底泥界面，主要因?yàn)榉聪趸?xì)菌多為異養(yǎng)兼性厭氧細(xì)菌，深水—底泥界面存在有氧—無氧的環(huán)境，有利于細(xì)菌的生長。隨著城鎮(zhèn)化發(fā)展，城市湖泊中人為輸入了大量的氮元素，造成水體和沉積物中氮元素富集，所以對(duì)污染湖泊沉積物中的反硝化過程和細(xì)菌群落特征的動(dòng)態(tài)變化有較多的研究，但在治理湖泊污染過程中，特別是加入外源反硝化細(xì)菌后，反硝化細(xì)菌在水體中的作用時(shí)間以及水體中細(xì)菌群落的變化特征還沒有明確的研究結(jié)果[14-16]。

為此，本試驗(yàn)利用江漢平原某湖泊現(xiàn)場(chǎng)治理項(xiàng)目，將地衣芽孢桿菌菌粉添加到湖水中設(shè)置的3根試驗(yàn)管中，利用基因定量和高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)外源菌種加入后的有效作用時(shí)間以及對(duì)湖水中原位細(xì)菌群落組成的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

本研究的污染湖泊位于江漢平原中南部，水域面積約0.24 km2，平均水深為2 m，蓄水量為40萬～54萬m3，屬平原淺水型湖泊，以泥沙沉積為主，水體較為獨(dú)立。湖泊北岸為生態(tài)公園和住宅區(qū)，南岸及西岸為耕種區(qū)和林區(qū)，通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)該湖泊主要污染源為生活廢水和農(nóng)業(yè)活動(dòng)。

1.2 樣點(diǎn)設(shè)置及采樣

于2018年8月份展開試驗(yàn)，以湖泊北岸作為試驗(yàn)區(qū)，區(qū)域內(nèi)平均水深為1.9 m，在湖水中插入3根長度為2 m、直徑為50 cm的波紋管(每根管中湖水體積約為0.37 m3)，于8月19日向其中分別添加地衣芽孢桿菌菌粉0 g、2 g、20 g，使加入菌數(shù)分別約為0 CFU/m3(A管)、5.4×1010CFU/m3(B管)、5.4×1011CFU/m3(C管)，分別于8月20日、22日、24日、26日取波紋管中的水樣樣品用于后續(xù)研究(A0表示20日在A管中采集的樣品，A2表示22日在A管中采集的水樣樣品，依此類推)。

根據(jù)《水質(zhì)采樣技術(shù)規(guī)程》(SL 187—96)，使用水樣采集器分別從3根試驗(yàn)管中采集表層(0.5 m處)水樣6 L左右，并使用正壓過濾器讓水樣通過6張直徑為100 mm、孔徑為0.22 μm的水系微孔濾膜(Whatman,英國)，將帶有細(xì)菌生物量的濾膜裝入50 mL無菌離心管中冷凍保存，之后運(yùn)往中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)地質(zhì)微生物實(shí)驗(yàn)室，于-80℃保存，用于后續(xù)分析。

1.3 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料有地衣芽孢桿菌菌粉(1×1010CFU/g，購自武漢科諾生物科技股份有限公司)、50 cm波紋管、正壓過濾器、0.22 μm水系微孔濾膜、50 mL康寧無菌離心管。

1.4 熒光定量PCR

按照Mag-BindSoil DNA Kit(OMEGA，美國)試劑盒的使用說明從3張濾膜提取樣品總DNA。試驗(yàn)選取細(xì)菌的napA和nosZ兩種反硝化基因進(jìn)行定量分析，其中引物設(shè)計(jì)為napA：F(5′-AAYATGGCVGARATGCACCC-3′)，R(5′-GRTTRAARCCCATSGTCCA-3′)[17]；nosZ： F(5′-CGCRACGGCAASAAGGTSMSSGT-3′)，R(5′-CAKRTGCAKSGCRTGGCAGAAT-3′)[18]。各基因定量均使用Power qPCR PreMix(GENEray，GK8020)試劑盒。

構(gòu)建15 μL的PCR反應(yīng)體系：1 μL DNA模板，各0.7 μL(10 μmol/L)上游引物和下游引物、7.5 μL 2×SYBR Green Mix (Takara)，5.1 μL超純水。熒光定量PCR儀(BIO-RAD MJ Mini TM，美國)程序?yàn)椋?5.0 ℃預(yù)變性5 min，94.0℃變性10 s，退火(napA57 ℃，nosZ58 ℃)30 s，72.0 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)后72.0 ℃延伸10 min。PCR儀聯(lián)機(jī)用CFX Manager Software進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集與分析，并依據(jù)文獻(xiàn)[19]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出目的基因的拷貝數(shù)(copies/μL)。

1.5 高通量測(cè)序

1.5.1 DNA提取與測(cè)序

按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(上海賽百盛公司)說明書從含生物量的3張微孔濾膜提取樣品總DNA，并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量，采用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA定量。以提取的總DNA為模板，對(duì)細(xì)菌16S rDNA基因的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)特異性引物520F(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)和802R (5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)，前引物設(shè)計(jì)一條7個(gè)堿基的寡核苷酸序列作為barcode用以區(qū)分同一文庫中的不同樣品。PCR反應(yīng)體系為：2 μL DNA模板，10 μL 5×PCR Buffer(Promega)，2 μL dNTPs，正、反向引物各1 μL，8.75 μL無菌水，0.25 μL高保真DNA聚合酶，共25 μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30 s，98℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)，循環(huán)完成后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后對(duì)目標(biāo)條帶使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen，美國)試劑盒進(jìn)行切膠回收、純化。

根據(jù)電泳初步定量結(jié)果，采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit藍(lán)色熒光試劑對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，儀器為Microplate reader(BioTek， FLx800)。通過Axyprep DNA Gel Extraction Kit對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，檢測(cè)合格的PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行16S rDNA基因高通量測(cè)序，由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。每個(gè)樣本獲得雙端序列數(shù)據(jù)為3萬～5萬個(gè)Reads。根據(jù)測(cè)序Reads之間Overlap關(guān)系進(jìn)行拼接(Merge)，同時(shí)對(duì)Reads質(zhì)量和Merge效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的Barcode和引物序列區(qū)分，優(yōu)化有效序列，并進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用Usearch 7.1(http://drive5.com/uparse/)平臺(tái)，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)劃分不同的可操作分類單元(operational taxonomic unit， OTU),得到OTU代表序列，并參照SILVA數(shù)據(jù)庫(v132 NR)進(jìn)行物種注釋[20-21]。將OTU表細(xì)化為每個(gè)樣本的等序數(shù)(n=24 805)，重復(fù)1 000次，并使用QIIME在97%的同一性水平上計(jì)算α多樣性和ANOSIM值，對(duì)樣本內(nèi)細(xì)菌群落多樣性變化和樣本組間差異顯著性進(jìn)行分析。使用R語言軟件Vegan包，Vegdist及Hclust進(jìn)行距離計(jì)算和聚類分析，并構(gòu)建Heatmap圖，距離算法為Bray-Curtis，聚類方法為Complete。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因定量分析

napA和nosZ兩種反硝化基因在環(huán)境中都廣泛存在，但因?yàn)閚osZ基因目前沒有在革蘭氏陽性細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，所以可以用這兩種基因表征投加了地衣芽孢桿菌后水體反硝化能力的變化趨勢(shì)。napA和nosZ反硝化基因在3組試驗(yàn)中的表達(dá)數(shù)量，見圖1。

圖1 napA和nosZ反硝化基因在3組試驗(yàn)中的表達(dá)數(shù)量Fig.1 Copy numbers of denitrification genes napA and nosZ in three experiments

由圖1可見，空白對(duì)照組中，napA基因的拷貝數(shù)遠(yuǎn)多于nosZ基因，而且通過連續(xù)取樣發(fā)現(xiàn)，nosZ基因拷貝數(shù)沒有明顯的變化趨勢(shì)，對(duì)比napA基因拷貝數(shù)的變化趨勢(shì)可以發(fā)現(xiàn)，其厭氧反硝化能力與投加地衣芽孢桿菌之間沒有明顯的相關(guān)關(guān)系，說明湖泊淺層水體中以好氧反硝化過程為主，厭氧反硝化過程在湖泊淺層水體中不占主導(dǎo)；加入2 g和20 g細(xì)菌菌粉后，湖泊淺層水體中napA基因拷貝數(shù)的增加與細(xì)菌菌粉投加量有關(guān)，其投加量越多，好氧反硝化基因的增加也越明顯；整體變化趨勢(shì)顯示，加入2 g和20 g細(xì)菌菌粉在穩(wěn)定水體中napA基因的拷貝數(shù)沒有太大差別，且隨著時(shí)間的推移，napA基因的拷貝數(shù)在后兩次取樣時(shí)已經(jīng)趨于平穩(wěn)，表明外源反硝化細(xì)菌在湖泊淺層水體中的存活時(shí)間約為4～6 d。

2.2 微生物群落多樣性及組成分析

不同水樣樣品的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)，見表1。

表1 不同水樣樣品的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 1 Diversity index of bacterial communities ofdifferent water samples

根據(jù)樣本組間差異性檢驗(yàn)(p<0.05)和表1可知：對(duì)照組中細(xì)菌群落多樣性最高，Simpson指數(shù)平均值為0.985，在加入外源反硝化細(xì)菌后，其細(xì)菌群落多樣性出現(xiàn)下降，其中加入2 g細(xì)菌菌粉試驗(yàn)組的Simpson指數(shù)最先降到最低值，第一次取樣時(shí)為0.91，加入20 g細(xì)菌菌粉試驗(yàn)組的Simpson指數(shù)降幅最大，第二次取樣時(shí)為0.89，表明群落中優(yōu)勢(shì)物種的多樣性在降低；Shannon指數(shù)的變化結(jié)果與Simpson指數(shù)一致，分別為6.24、5.59，表明群落的豐富度在減少，而且添加外源反硝化細(xì)菌的量越多，降低細(xì)菌群落多樣性的效果越明顯，這在Chao1指數(shù)中也有所體現(xiàn)。

圖2顯示了在加入地衣芽孢桿菌菌粉后湖泊水體中細(xì)菌群落在綱水平上的相對(duì)豐度變化。

圖2 加入地衣芽孢桿菌菌粉后湖泊水體中細(xì)菌 群落在綱級(jí)別上的相對(duì)豐度變化Fig.2 Relative abundance change of bacterial community at class level in the lake after adding Bacillus licheniformis powder

由圖2可以看出：

(1) Gammaproteobacteria雖然隨時(shí)間的延長占比逐漸下降，但對(duì)比3組試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)投加的細(xì)菌菌粉越多，其在細(xì)菌群落中的占比越高，相比之下，投加地衣芽孢桿菌菌粉則會(huì)抑制Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria的生長，而且其投加量越多，它們?cè)诟髯匀郝渲械恼急仍缴伲籄cidimicrobiia和Actinobacteria在對(duì)照組中的占比最高，投加細(xì)菌菌粉降低了它們?cè)诩?xì)菌群落中的相對(duì)豐度，而且添加的細(xì)菌菌粉量越多其降低的也越多。雖然投加的地衣芽孢桿菌屬于Bacilli，但Bacilli的相對(duì)豐度在投加細(xì)菌菌粉后并沒有隨細(xì)菌數(shù)量的增多而上升，后面其相對(duì)豐度雖有上升，但沒有表現(xiàn)出與細(xì)菌菌粉投加量的相關(guān)性。

(2) 不同的細(xì)菌類群在投加細(xì)菌菌粉后的相對(duì)豐度隨取樣時(shí)間的變化表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。加入2 g細(xì)菌菌粉后，Gammaproteobacteria的相對(duì)豐度由76.3%下降到39.6%和6.3%，之后上升到59.7%，表現(xiàn)為先下降后增長；Betaproteobacteria的相對(duì)豐度由5.67%上升到10.47%和11.97%，之后下降到2.27%；Alphaproteobacteria的相對(duì)豐度由0.27%增長到1.3%，隨后又下降到0.63%，表現(xiàn)為先增長后下降；Acidimicrobiia的相對(duì)豐度由24%下降到0.2%，之后上升到1.1%；Actinobacteria的相對(duì)豐度由14%下降到0.13%，之后上升到0.97%和1.67%；Bacilli的相對(duì)豐度由7.63%下降到3.13%和1.83%，之后增長并保持在2.0%的水平，都表現(xiàn)為先下降后增長的變化趨勢(shì)。

(3) 加入20 g細(xì)菌菌粉后，Gammaproteobacteria的相對(duì)豐度表現(xiàn)出與前一個(gè)試驗(yàn)組相反的變化趨勢(shì)，其由69.83%增長到77.13%，隨后下降到18.93%和3.17%，表現(xiàn)為先增長后下降；Betaproteobacteria的相對(duì)豐度由8.63%下降到5.07%，隨后增長到10.2%和11.23%；Alphaproteobacteria的相對(duì)豐度由3.4%下降到0.43%，隨后上升到1.13%和13.8%，表現(xiàn)為先下降后增長；Actinobacteria的相對(duì)豐度下降到0.07%，之后增長到0.17%、0.47%和15.87%；Actinobacteria的相對(duì)豐度下降到0.13%，之后增長到1.07%和25.77%；Bacilli的相對(duì)豐度下降到3.67%和0.23%，之后增長并保持在2%的水平，均表現(xiàn)為先下降后增長的變化趨勢(shì)。

2.3 細(xì)菌群落代謝功能預(yù)測(cè)

在了解了外源反硝化細(xì)菌對(duì)表層湖水細(xì)菌群落的影響后，進(jìn)一步探究湖水細(xì)菌群落所具備的代謝功能對(duì)了解外源反硝化細(xì)菌帶來的湖水細(xì)菌群落代謝功能變化具有重要的指示意義。

圖3 湖泊細(xì)菌群落功能類群聚類豐度熱圖Fig.3 Heatmap of cluster analysis of bacterial community metabolism functions

通過對(duì)湖水細(xì)菌群落豐度前50位的功能類群分布進(jìn)行聚類并制作豐度熱圖(見圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在加入2 g細(xì)菌菌粉后，湖水細(xì)菌群落反硝化能力呈現(xiàn)出逐步增強(qiáng)的趨勢(shì)，到第8 d取樣時(shí)硝酸鹽代謝占主導(dǎo)地位，表明湖水細(xì)菌群落功能以反硝化過程為主；在加入20 g細(xì)菌菌粉4 d后,與反硝化過程相關(guān)的蛋白數(shù)量增多，如K02050、K02049、K02051等與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的結(jié)合蛋白，說明湖水細(xì)菌群落參與反硝化過程的能力增強(qiáng)，在第8 d取樣時(shí)，烯酰輔酶A(K01692)和乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶(K00626)增多，表明湖水細(xì)菌群落代謝轉(zhuǎn)為以有機(jī)氮代謝為主。

3 討 論

經(jīng)過一段時(shí)間的治理后該湖泊污染狀況有了明顯的好轉(zhuǎn)(總氮含量由治理前的2.67 mg/L降為治理后的1.03 mg/L)。通過一段時(shí)間的取樣、試驗(yàn)和分析，添加外源反硝化細(xì)菌用以增強(qiáng)湖水中細(xì)菌除氮能力也得到驗(yàn)證。

本項(xiàng)目所處湖泊淺層水體中細(xì)菌群落以Proteobacteria、Actinobacteri、Firmicutes和Bacteroidetes 4個(gè)門類的細(xì)菌為主，其中Proteobacteria主要包括Betaproteobacteria(21.4%)、Gammaproteobacteria(12.0%)、Alphaproteobacteria(7.6%)3個(gè)綱，Actinobacteria主要包括Acidimicrobiia(29.7%)、Actinobacteria(7.4%)2個(gè)綱，F(xiàn)irmicutes以Bacilli為主。這與前人對(duì)富營養(yǎng)化湖泊水體中關(guān)于細(xì)菌群落的研究結(jié)果相一致[22]。

添加不同量的外源反硝化細(xì)菌對(duì)湖泊淺層水體中不同類群微生物相對(duì)豐度的影響有所不同，Gammaproteobacteria的相對(duì)豐度在加入2 g細(xì)菌菌粉后先下降后上升，而在加入20 g細(xì)菌菌粉后則其先上升后下降，Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria的相對(duì)豐度的變化趨勢(shì)則與之相反，Acidimicrobiia、Actinobacteria、Bacilli的相對(duì)豐度在兩組試驗(yàn)組中的變化趨勢(shì)均為先下降后增長。同時(shí)，添加不同量的細(xì)菌菌粉對(duì)湖泊淺層水體中細(xì)菌群落反硝化能力的影響也不同，盡管Bacilli是群落中好氧反硝化的優(yōu)勢(shì)物種，但物種相對(duì)豐度與細(xì)菌菌粉添加量之間沒有明顯的相關(guān)性，使得湖泊淺層水體中細(xì)菌群落反硝化能力與細(xì)菌菌粉添加量和時(shí)間之間也沒有明顯的相關(guān)性。

基因定量的結(jié)果顯示，添加的地衣芽孢桿菌在湖泊淺層水體中的維持周期僅為4 d左右，細(xì)菌群落多樣性也顯示在加入細(xì)菌菌粉后第4 d，細(xì)菌群落物種數(shù)有上升的趨勢(shì)，且多樣性指數(shù)可以恢復(fù)到對(duì)照組的水平。前文已述，微生物反硝化過程主要發(fā)生在深水—底泥界面，本研究關(guān)注于湖泊淺層水體中微生物群落的變化，沒有對(duì)湖泊深層水體和湖泊沉積物中微生物群落進(jìn)行深入研究，因而無法確定添加的地衣芽孢桿菌在湖泊水體中的垂直分布和定殖情況，以及對(duì)湖泊深層水體和沉積物中原有微生物群落的影響。有前人利用富營養(yǎng)湖泊沉積物研究其中的好氧反硝化細(xì)菌的群落特征發(fā)現(xiàn)，淡水環(huán)境下水庫、湖泊的沉積物中以厚壁菌門(Firmicutes)為主，湖水的一些理化性質(zhì)是影響湖泊深層水體和沉積物中微生物群落的主要因素[23-24]。因?yàn)楸狙芯恐刑砑拥牡匾卵挎邨U菌細(xì)菌菌粉含有培養(yǎng)基成分，水體的物理化學(xué)性質(zhì)，如pH值、無機(jī)鹽、氮磷含量等在細(xì)菌菌粉被溶解后會(huì)發(fā)生改變，細(xì)菌菌粉中的營養(yǎng)元素在為地衣芽孢桿菌生長繁殖提供需要的同時(shí)也促進(jìn)了細(xì)菌群落中其他微生物的生長繁殖，增加了地衣芽孢桿菌的生長競爭，這從湖泊水體中藻類的數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果和Bacilli綱細(xì)菌的群落變化特征中可以看出。對(duì)于此類因素的影響在本研究中沒有體現(xiàn)，這是在以后的湖泊治理和研究中需要特別關(guān)注的，只有這樣才能更全面地了解利用反硝化細(xì)菌治理地表水污染時(shí)水體反硝化能力的變化。

4 結(jié) 論

通過控制外源反硝化細(xì)菌(地衣芽孢桿菌)添加量，利用基因定量和16S rDNA測(cè)序技術(shù)研究其對(duì)污染湖泊淺層水體中細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)和代謝類群的影響，得到以下主要結(jié)論：

(1) 在污染湖泊水體治理過程中，添加外源反硝化細(xì)菌是利用微生物去除水體中氮素的有效方法之一，但添加的外源反硝化細(xì)菌地衣芽孢桿菌不能長時(shí)間在湖泊淺層水體中聚集，聚集時(shí)間通常在4 d左右。

(2) 湖泊淺層水體中細(xì)菌群落主要由屬于Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes 4個(gè)門的細(xì)菌組成，添加外源細(xì)菌后對(duì)湖泊水體中原位細(xì)菌群落的影響包括降低細(xì)菌群落多樣性、改變?nèi)郝浣M成和增強(qiáng)群落反硝化能力。

(3) 添加2 g細(xì)菌菌粉(約5.4×1010CFU/m3)可以持續(xù)增強(qiáng)污染湖泊水體中細(xì)菌群落的反硝化能力，添加20 g細(xì)菌菌粉(約5.4×1011CFU/m3)可以短時(shí)間內(nèi)(2 d)增強(qiáng)污染湖泊水體中細(xì)菌群落的反硝化能力，但從實(shí)際應(yīng)用情況來看，更多的外源菌種的加入，其反硝化能力并沒有隨之增強(qiáng)，因此需通過試驗(yàn)選取適當(dāng)?shù)耐都訚舛取?/p>