魏蓉 張?jiān)?李新月

1. 300071 天津, 南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院; 2. 天津市口腔醫(yī)院牙周病科

miRNA參與調(diào)控包括牙周炎在內(nèi)的多種免疫炎癥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生發(fā)展[1-2]。在人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periondontal ligament fibroblasts，hPDLFs)中，LPS通過(guò)Toll樣受體2(toll-like receptor 2,TLR2)特異性下調(diào)骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)的表達(dá)，可能與牙槽骨代謝有關(guān)[3]；miR-19a在牙周炎性組織中異常表達(dá)[4]，并且與TLR2間具有負(fù)性靶向作用位點(diǎn)[5]，但其與牙周炎相關(guān)研究少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究hPDLFs中miR-19a對(duì)TLR2及BSP的表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó));M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara，日本);CG-02/05實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀[HealForce,力新儀器(上海)有限公司];P.g.LPS(InvivoGene，美國(guó));HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(南京諾唯贊生物)。

1.2 方法

1.2.1 hPDLFs的培養(yǎng)及分組處理 取因正畸拔除(已經(jīng)過(guò)天津市口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查)的雙尖牙根中1/3牙周膜組織培養(yǎng)細(xì)胞并傳代。分別測(cè)定空白對(duì)照組及LPS誘導(dǎo)組的miR-19amRNA表達(dá)；分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(LPS組)、miR-19a過(guò)表達(dá)對(duì)照組、miR-19a過(guò)表達(dá)組、miR-19a抑制對(duì)照組、miR-19a抑制組分別空白或LPS處理。

1.2.2 Real-time PCR 用Trizol試劑提取總RNA，miR-19a以U6為內(nèi)參,TLR2及BSP以β-actin為內(nèi)參，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量法測(cè)定其mRNA表達(dá)，相對(duì)定量法計(jì)算其CT值。

1.2.3 Western blot 提取總蛋白，取40 μg行電泳、轉(zhuǎn)移印跡、封閉，經(jīng)一抗、二抗結(jié)合后曝光顯影、定影處理。用LabWorksTM系統(tǒng)攝像，分析各組條帶的亮度值，與對(duì)應(yīng)GAPDH(內(nèi)參照)條帶相比，得到校正值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

hPDLFs經(jīng)P.g.LPS誘導(dǎo)后，miR-19a mRNA表達(dá)水平升高約2.6 倍(圖 1)。過(guò)表達(dá)miR-19a在mRNA(P=0.001)及蛋白(P=0.000)水平均能明顯降低LPS對(duì)TLR2的激活作用(圖 2)；過(guò)表達(dá)miR-19a能拮抗LPS對(duì)BSP的下調(diào)作用，這種下調(diào)作用在mRNA(P=0.010)及蛋白水平(P=0.005)是一致的(圖 3)。

圖 1 正常及LPS誘導(dǎo)下hPDLFs中miR-19a的表達(dá)

圖 2 miR-19a對(duì)hPDLFs在LPS誘導(dǎo)下TLR2表達(dá)水平的影響

圖 3 miR-19a對(duì)hPDLFs在LPS誘導(dǎo)下LPS表達(dá)水平的影響

3 討 論

在P.g.LPS誘導(dǎo)的牙周炎細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)hPDLFs中miR-19a表達(dá)上調(diào)約2.6 倍，與前期研究報(bào)道牙周炎性組織中其表達(dá)水平升高約2～5 倍的結(jié)論一致[3]。但其與TLR2的同時(shí)上調(diào)似乎在hPDLFs中并不符合二者的負(fù)性靶向作用關(guān)系，這種現(xiàn)象的原因可能是：mRNA的表達(dá)受到多種miRNA的調(diào)控，LPS誘導(dǎo)hPDLFs后TLR2升高，但細(xì)胞(和機(jī)體)內(nèi)受多種機(jī)制調(diào)控影響，TLR2受到多種miRNA的調(diào)控，miR-19a可能只作為其中之一，且miRNA對(duì)靶標(biāo)因子多起微調(diào)作用[6]，因此LPS誘導(dǎo)后二者的變化并未表現(xiàn)為明顯的負(fù)性相關(guān)；此外，miRNA的調(diào)控作用具有時(shí)間特異性[7]，miR-19a在hPDLFs中的表達(dá)可能也呈現(xiàn)時(shí)間相關(guān)性，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hPDLFs中過(guò)表達(dá)miR-19a可以抑制LPS對(duì)TLR2的激活作用，且抑制miR-19a也可部分上調(diào)TLR2的mRNA(P>0.05)和蛋白水平(P=0.020)，證實(shí)了miR-19a在hPDLFs中對(duì)TLR2的調(diào)節(jié)也為負(fù)性作用關(guān)系。

BSP是一種多功能細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在牙骨質(zhì)形成、牙周組織再生中有重要作用。過(guò)表達(dá)miR-19a能上調(diào)BSP的表達(dá)，部分抵消LPS對(duì)BSP的抑制作用，可能與牙槽骨代謝相關(guān)。盡管抑制miR-19a對(duì)上調(diào)TLR2和抑制BSP的作用并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其對(duì)二者的調(diào)控趨勢(shì)符合miR-19a與TLR2間負(fù)性作用關(guān)系的假設(shè)；此外，過(guò)表達(dá)miR-19a對(duì)于抑制TLR2、上調(diào)BSP更具有生理性意義：在hPDLFs中，LPS刺激后miR-19a升高抑制TLR2的表達(dá)，調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答；同時(shí)上調(diào)BSP意味著在牙周炎發(fā)生發(fā)展中，miR-19a可能起到了抑制牙槽骨吸收的作用。但這種調(diào)控作用是否是通過(guò)TLR2介導(dǎo)有待繼續(xù)研究。

綜上，miR-19a能夠負(fù)性調(diào)控TLR2，正向調(diào)控BSP的表達(dá)水平，部分抵消LPS的病理作用，在牙周炎發(fā)生發(fā)展中可能具有積極作用。