李林森，徐暉，劉瑞明，汪亞倫?

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2016 級(jí)）

光動(dòng)力學(xué)療法（photodynamic therapy，PDT）作為一種治療腫瘤的新方法，越來(lái)越受到醫(yī)療工作者和學(xué)者們的關(guān)注［1－2］。PDT 的基本原理是在腫瘤病變組織攝取一定量光敏劑后，利用特定波長(zhǎng)的光照射腫瘤部位，光敏劑會(huì)將腫瘤組織的分子氧（O2） 轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的單線態(tài)氧（O1）或自由基，進(jìn)而破壞腫瘤細(xì)胞來(lái)達(dá)到治療腫瘤的目的［3］。光敏劑作為氧分子形態(tài)轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因子，一直是PDT 研究的重點(diǎn)，而酞菁作為第二代光敏劑，具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)、適宜的治療波長(zhǎng)（650～700 nm） 以及體內(nèi)滯留時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)［4－5］。但是酞菁分子疏水性強(qiáng)的特點(diǎn)，也限制了其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用［6］。因此，本研究利用自組裝納米載藥系統(tǒng)提高酞菁鋅（ZnPc） 光敏劑的水溶性，通過(guò)四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT） 法考察其對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 的光動(dòng)力學(xué)作用，為PDT 抗腫瘤的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器 Synergy 4TM混合式多功能讀板機(jī)（美國(guó)BioTek 公司），激光粒度測(cè)定儀（英國(guó)Malvern Panalytical 公司），LED 光能祛痘燈（青島陽(yáng)光動(dòng)力生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），BSA124S 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 材料 酞菁鋅（ZnPc） （中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，CAS：14320－04－8），聚乳酸－聚羥基乙酸（poly （lactic－co－glycolic acid，PLGA，Mw：7 000－17 000）、聚乙二醇 （polyethylene glycol，PEG，Mw：2 000）、透析袋MD25 （8 000－14 000 D）、脫氧膽酸鈉（SDC，Mw：414.56） （北京索萊寶科技有限公司），N－甲基吡咯烷酮（NMP）、1－ （3－二甲氨基丙基）－ 3－ 乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N－羥基琥珀酰亞胺（NHS） （美國(guó)Amresco 公司），MTT 細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96 孔板（美國(guó)Corning 公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），RPMI－1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco BRL 公司），胰蛋白酶（美國(guó)Invitrogen 公司），人肝癌細(xì)胞HepG2 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)）。

1.3 方法

1.3.1 溶劑擴(kuò)散法制備ZnPc－PLGA－PEG （zinc phthalocyanine－poly （lactic－co－glycolic acid）－polyethylene glycol） 納米粒和PLGA－ PEG （poly（lactic－co－glycolic acid）－polyethylene glycol） 空白納米粒并行粒徑測(cè)量 稱取100 mg PLGA、0.96 mg NHS、1.59 mg EDC 溶于2 ml NMP 中，冰水浴攪拌2 h；再稱取16.67 mg PEG 溶解于1 ml NMP中，完全溶解后，緩慢加入到上述PLGA 溶液中反應(yīng)24 h，透析后離心濃縮至3 ml。

將上述反應(yīng)液平均分成2 份，取一份緩慢滴加到純化水中至15 ml，得到PLGA－PEG 空白納米粒；精確稱量10.0 mg ZnPc 溶解于含有45 mg SDC 的1.5 ml NMP 中，與PLGA－PEG 溶液混合后，緩慢滴加到純化水中至30 ml，得到ZnPc－PLGA－PEG納米粒。標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定ZnPc 藥物濃度。

ZnPc－PLGA－PEG 納米粒和PLGA－PEG 空白納米粒在室溫下靜置15 min 后，使用激光粒度儀的Malvern 系統(tǒng) （Malvern ZEN，英國(guó) Malvern Panalytical公司） 通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定兩者平均粒徑，測(cè)量多分散指數(shù)（PDI） 以評(píng)估ZnPc－PLGAPEG 納米粒粒度分布，結(jié)果取3 次測(cè)量值的平均值。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在含有100 單位／ml 的雙抗（青霉素與鏈霉素） 和體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清的RPMI－1640 培養(yǎng)基中進(jìn)行HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部80%～90%時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化并傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行細(xì)胞毒性PDT 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT 法測(cè)定ZnPc－PLGA－PEG 納米粒和PLGA－PEG 空白納米粒對(duì)HepG2 細(xì)胞的活力作用將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶（含有EDTA） 消化，培養(yǎng)基終止消化后離心收集細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的RPMI－1640 培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞至密度為1.5×105個(gè)／ml 后，以每孔100 μl 細(xì)胞液迅速接種在96 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育16 h。更換新鮮培養(yǎng)基后加藥。設(shè)1 個(gè)對(duì)照組（只加培養(yǎng)液）、5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組（ZnPc－PLGA－PEG 納米粒終濃度分別為0.01、0.1、1、10 和100 μmol／L） 及等比例稀釋的5 個(gè)PLGA－PEG 空白納米粒組，每組為4 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h；待細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，更換培養(yǎng)基，用波長(zhǎng)670 nm 的LED 燈光照5 min （光劑量約7.5 J／cm2） 后避光置于培養(yǎng)箱中；暗毒性實(shí)驗(yàn)除未光照外，其他處理方式相同。16 h 后，利用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率并繪圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZnPc－PLGA－PEG 納米粒和PLGA－PEG 空白納米粒的制備及粒徑考察 通過(guò)溶劑擴(kuò)散法制備的PLGA－PEG 空白納米粒和ZnPc－PLGA－PEG 納米粒均以單體形式存在，穩(wěn)定且不易聚集。PLGA－PEG 空白納米粒呈乳白色，并帶有淺藍(lán)色乳光，ZnPc－PLGA－PEG 納米粒呈深藍(lán)色。經(jīng)檢測(cè)，PLGA－PEG 空白納米粒和ZnPc－PLGA－PEG 納米粒的粒徑分別為 （99.0 ± 50.3） nm 和 （101.0 ±47.1） nm，見(jiàn)圖1，PDI 分別為0.258 和0.217。ZnPc 的裝載增加了ZnPc－PLGA－PEG 納米粒的粒徑。

2.2 ZnPc－PLGA－PEG 納米粒和PLGA－PEG 空白納米粒的光毒性及暗毒性實(shí)驗(yàn) 隨著ZnPc－PLGA－PEG 納米粒濃度的增加，在光照條件下，腫瘤細(xì)胞的存活率不斷下降，在10 μmol／L 的濃度下，腫瘤細(xì)胞的存活率只有4.6%，見(jiàn)圖2A；而同樣條件下的非光照組，腫瘤細(xì)胞的存活率一直保持在95%以上，見(jiàn)圖2B。在對(duì)未裝載ZnPc 的PLGAPEG 空白納米粒進(jìn)行光毒性和暗毒性的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的存活率未發(fā)生明顯變化，這與ZnPc－PLGA－PEG 納米粒的暗毒性結(jié)果相近，均不影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。見(jiàn)圖3。

圖2 ZnPc－PLGA－PEG 納米粒的光毒性（A） 及暗毒性（B）

圖3 PLGA－PEG 空白納米粒的光毒性（A） 及暗毒性（B）

3 討論

在PDT 研究中，阻礙酞菁類光敏劑臨床應(yīng)用最主要的因素即為其水溶性較差。一些研究中利用表面活性劑，如蓖麻油、吐溫等的加入，可以提高酞菁光敏劑的溶解性，但是也會(huì)帶來(lái)副作用［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)納米載藥系統(tǒng)改善酞菁鋅（ZnPc） 的水溶性及穩(wěn)定性，取得了很好的效果。得到的ZnPc－PLGA－PEG 納米粒在水溶液中能夠長(zhǎng)時(shí)間均勻存在，不易聚集，可以作為一種新型光敏劑開展進(jìn)一步體內(nèi)PDT 研究。

在PDT 研究中，光敏劑在光照（光毒性） 和非光照（暗毒性） 條件下對(duì)細(xì)胞的殺傷作用是考察其性質(zhì)的重要指標(biāo)之一，也是其臨床進(jìn)一步應(yīng)用可能性的重要參考。利用MTT 檢測(cè)方法證明，在光照條件下，ZnPc－PLGA－PEG 納米粒對(duì)HepG2細(xì)胞具有明顯的殺傷和抑制作用，在濃度10 μmol／L 的ZnPc 納米粒PDT 作用下，腫瘤細(xì)胞存活率小于5%；而非光照條件下，在各個(gè)濃度下，腫瘤細(xì)胞的存活率均大于95%，說(shuō)明對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的殺傷不是光敏劑的直接作用，而是光敏劑、光和氧氣等諸多因素共同作用的結(jié)果。在非光照條件下，光敏劑對(duì)細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生毒性作用，這在臨床應(yīng)用中具有很大的益處，我們可以利用光源照射部位的選擇，提高PDT 治療的靶向性。

通過(guò)納米粒子裝載ZnPc 的方式可以提高光敏劑的光動(dòng)力活性，但是納米粒子組成材料自身對(duì)細(xì)胞存活率的影響也需要進(jìn)一步考察。高分子材料的選擇對(duì)于納米粒子的組裝起著至關(guān)重要的作用，其中材料的安全性是重中之重。在本實(shí)驗(yàn)中以PLGA－PEG 空白納米粒作為對(duì)照，同樣進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞光毒性和暗毒性的考察。結(jié)果顯示，在光照和非光照條件下，PLGA－PEG 空白納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均無(wú)影響，說(shuō)明ZnPc－PLGA－PEG納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用全部來(lái)自于ZnPc 的PDT 作用，PLGA－PEG 空白納米粒的組裝材料是安全的。

綜上所述，ZnPc－PLGA－PEG 納米粒是一種安全、可靠的新型光敏劑，具有水溶性好、性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，對(duì)于人肝癌細(xì)胞HepG2 具有很好的殺傷和抑制作用，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。