張 明，袁 園，張麗霞，張宏偉，*

(1．中國疾病預防控制中心環(huán)境與健康相關產(chǎn)品安全所毒理室，北京 100021；2．浙江大學華南工業(yè)技術研究院化妝品創(chuàng)新研究中心，廣東 廣州 510535)

化妝品的安全性是由化妝品的原料決定的，而化妝品中的防腐劑是化妝品常用的原料，也是引起化妝品過敏反應，即過敏性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)的重要因素之一，化妝品過敏性接觸性皮炎是皮膚接觸致敏物質后引發(fā)的遲發(fā)型過敏反應。

由于國外對動物試驗的禁令及對動物替代試驗的推行，皮膚致敏的檢測方法已開發(fā)出一系列體外替代檢測方案[1]。其中經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)推薦的人類細胞系活化試驗(human cell line activation test，h-CLAT)是檢測皮膚致敏過程中細胞表面分化抗原簇86(cluster of differentiation 86，CD86)和分化抗原簇54(cluster of differentiation 54，CD54)的表達來判定待測物是否具有致敏性，通過熒光染色測量人髓系白血病單核細胞(human myeloid leukemia mononuclear cells，THP-1)表面分子的表達來判定待測物是否具有致敏性。當致敏物接觸THP-1細胞會引起其表面分子CD86和CD54的上調，說明THP-1細胞被活化，發(fā)生了皮膚致敏過程。豚鼠局部封閉涂皮試驗(occluded patch test of Buchler，BT)是用受試物誘導過的動物再次接觸同種受試物所表現(xiàn)出的皮膚反應來判定受試物是否具有致敏性，該方法是國際上評價化學物皮膚致敏性的經(jīng)典方法，我國部分國家標準或規(guī)范也將該方法列為致敏性試驗方法之一，對化學物質進行致敏性測試。h-CLAT 試驗與BT試驗相比，測試結果是否一致，本研究擬采用體外人細胞系活化試驗和豚鼠局部封閉涂皮試驗對化妝品常用的2 種防腐劑進行致敏性檢測，對比兩種方法檢測的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及分組北京科宇動物養(yǎng)殖中心提供的健康普通級白化豚鼠，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2018-0010，體質量為300～350 g。將40 只動物隨機分為受試物試驗組和對照組。

1.1.2 細胞來源及培養(yǎng)條件THP-1細胞購于中國食品藥品檢定研究院，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗、0.05 mmol/L β-巰基乙醇的RPMI1640基礎培養(yǎng)液中，在37 ℃、CO2體積為5%的培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.3 試驗試劑RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、β-巰基乙醇、雙抗、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液均購自Sigma公司；Fc 段受體阻斷劑、7-氨基放線素菌-D(7-AAD)、FITC標記小鼠單克隆CD86抗體、FITC標記小鼠IgG1抗體、PE標記小鼠單克隆CD54抗體、PE標記小鼠IgG1抗體均購自BD公司。

1.1.4 主要儀器流式細胞儀，型號FACS Calibur，購自BD 公司；臺式高速冷凍離心機，型號GS-15R，購自美國Beckman公司；二氧化碳培養(yǎng)箱和Varioskan Flash 全波長多功能讀數(shù)儀均購自Thermo Scientific 公司；超聲儀、自動細胞計數(shù)儀、電熱恒溫水箱。

1.1.5 對照物和測試樣品BT試驗和h-CLAT試驗的陽性對照物質采用 2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB)，BT試驗誘導和激發(fā)所用樣品分別為0.5%和0.1%的丙酮溶液，h-CLAT 試驗中將其先溶解于少量DMSO 中，再用細胞培養(yǎng)液稀釋到測試濃度，其中DMSO 在培養(yǎng)液中濃度不高于10%。陰性對照物質甘油和測試樣品羥苯乙酯、羥苯丁酯均購自Sigma公司。

BT 試驗中用甘油溶解羥苯乙酯、羥苯丁酯，h-CLAT試驗中將其溶解于少量DMSO中，再用細胞培養(yǎng)液稀釋到各個測試濃度。

1.2 豚鼠局部封閉涂皮試驗[2]

按照1.1.1所述的動物情況分組，受試物組給予的羥苯乙酯的誘導及激發(fā)濃度分別為50%和40%的甘油溶液，羥苯丁酯的誘導及激發(fā)濃度分別為0.5%和0.2%的甘油溶液。

試驗前約24 h，將豚鼠背部左側用動物電推剪去毛，去毛范圍為6 cm2。

誘導接觸：將上述配置好的受試物約0.2 mL涂在試驗動物去毛區(qū)皮膚上，以二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以醫(yī)用白色膠布封閉固定6 h，第7 和第14 天以同樣方法重復1 次。陽性對照組動物用陽性物質(0.5%的2,4-二硝基氯苯的丙酮溶液)做同樣處理，陰性對照組動物誘導時采用甘油。

激發(fā)接觸：末次誘導后14 d，將約0.2 mL的受試物涂于豚鼠背部右側2 cm×2 cm去毛區(qū)，試驗前24 h去毛，然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以醫(yī)用白色膠布固定6 h。陽性對照組采用0.1%的2,4-二硝基氯苯丙酮溶液處理，陰性對照組分別采用40%羥苯乙酯的甘油溶液或0.2%羥苯丁酯的甘油溶液處理。

激發(fā)接觸后24 和48 h 觀察皮膚反應，當動物出現(xiàn)皮膚反應積分≥2，判為該動物皮膚變態(tài)反應陽性，按表1判定受試物的致敏強度。

1.3 體外人細胞系活化試驗[3]

1.3.1 THP-1 細胞培養(yǎng)THP-1 細胞于培養(yǎng)瓶中水平培養(yǎng)，鏡下觀察細胞狀態(tài)，每隔3 d 進行一次傳代培養(yǎng)。細胞使用前每隔24 h進行活細胞染色計數(shù)，計算細胞平均倍增時間，確定細胞穩(wěn)定性。細胞的使用不超過20代。

1.3.2 受試物細胞毒性檢測受試物溶解于少量DMSO 中，再用RMPI 1640 完全細胞培養(yǎng)液(含0.05 mmol/L β-巰基乙醇、10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640 基礎培養(yǎng)液，pH=7.2)稀釋，2 倍稀釋配制6個濃度值。采用試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)方法檢測細胞毒性，細胞以2×105個/mL的初始濃度培養(yǎng)2 d 后，將細胞濃度調節(jié)至1×106個/mL。取受試物溶液和細胞懸液各100 μL 混合接種至96 孔平底板上，每個濃度設置3 個平行復孔。每次同時設置陽性對照、溶劑對照(細胞和培養(yǎng)液1∶1 混合)、空白對照(除細胞外的其他介質)。將96孔板置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL的染液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h。450 nm 波長下使用酶標儀測定每孔吸光度D(450)值。

細胞活性=[D(450)受試孔-D(450)空白孔]/[D(450)對照孔-D(450)空白孔]

通過受試物細胞毒性預試驗結果，經(jīng)R 軟件分析處理，計算細胞存活率75%時的暴露濃度(75% cell viability，CV75)。

1.3.3 有效作用濃度計算對于具有致敏性的物質，進一步進行有效作用濃度(effective concentration，EC)值的計算。對CD86計算EC150，即CD86的相對熒光強度(relative fluorescence intensity，RFI)達到150 時受試物的最低有效濃度。對CD54 計算EC200，即CD54 的RFI 達到200 時受試物的最低有效濃度。選取RFICD86＞150或RFICD54＞200的最低濃度作為CA(μg/mL)，RFICD86＜150或RFICD54＜200的最高濃度作為CB(μg/mL)。

CA為RFI≥150(CD86)或200(CD54)的最低濃度；CB為RFI＜150(CD86)或200(CD54)的最高濃度。RFIA為A濃度所對應的RFI；RFIB為B濃度所對應的RFI。

若所測濃度范圍內RFI 均＞150(CD86)或200(CD54)，選用公式(3)計算EC150，選用公式(4)計算EC200。

CB為受試范圍內最低濃度；CA為比RFIB大至少10%的RFI所對應的最低濃度。

1.3.4 THP-1細胞CD86和CD54表達測定根據(jù)已經(jīng)測得的CV75值，結合細胞存活率介于65%～95%之間，1.2倍稀釋得到6個濃度。細胞以2×105個/mL的初始密度培養(yǎng)2 d 后，離心調節(jié)濃度至2×106個/mL。取受試物和細胞各500 μL，1∶1 混合接種于24 孔板上。每次試驗設立培養(yǎng)基對照、DMSO 溶劑對照和陽性對照(2.5 μg/mL 的DNCB)?？装逯糜诩毎囵B(yǎng)箱中孵育24 h，用1 mL 的染色緩沖液清洗一次，進行Fc段抗體封閉和7-AAD 染色10 min，再次清洗后進行抗體染色(FITC-CD86、PE-CD54)和同型對照染色(FITC-IgG1、PE-IgG1)。染色完成后加入200 μL染色緩沖液清洗兩次，用500 μL的FACS緩沖液重懸細胞移至流式管中待用。用空白細胞和單染細胞調節(jié)電壓補償，按下式計算RFI。

熒光強度均值(mean fluorescence intensity，MFI)為熒光強度幾何平均數(shù)。

1.3.5 受試物致敏性判定化學物質至少需要兩次獨立試驗。每次試驗要求細胞存活率大于50%，如果RFICD86≥150，則判定為CD86 表達陽性；RFICD54≥200，則判定為CD54 表達陽性。兩次試驗中CD86 和CD54任一指標兩次判定為陽性，則判定該物質具有致敏性。如果兩次試驗CD86和CD54的表達均不具有一致性，則進行第3 次試驗。若第3 次試驗中CD86 和CD54表達均為陰性，判定為非致敏物，否則判定該物質具有致敏性。

1.4 統(tǒng)計學方法

試驗數(shù)據(jù)采用R 軟件進行分析，受試物羥苯乙酯組、羥苯丁酯組、陽性對照DNCB 組和陰性對照甘油組的CD86與CD54的相對熒光強度值間的差異分析采用單因素分析進行比較，以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 豚鼠局部封閉涂皮試驗結果

通過豚鼠局部封閉涂皮試驗，對化妝品常用的防腐劑羥苯乙酯、羥苯丁酯進行了致敏性測試，于最后一次激發(fā)接觸后的24 h 和48 h 對試驗動物進行皮膚觀察，結果見表2，其中陰性對照組致敏率為0，陽性對照組DNCB 致敏率最低為40%，該試驗成立，待測物羥苯乙酯對豚鼠的致敏率為0，羥苯丁酯在第24 h對豚鼠致敏率為45%，第48 h 時對豚鼠致敏率為30%，按表1 所列的致敏強度判定標準，待測物羥苯乙酯為非無致敏物，羥苯丁酯為中等致敏物。

表2 受試物或對照物對豚鼠皮膚變態(tài)反應試驗結果(BT法)

2.2 體外人細胞系活化試驗結果

2.2.1 細胞毒性檢測結果利用CCK-8 法對受試物質羥苯乙酯、羥苯丁酯以及陽性對照物質DNCB 及陰性對照物質甘油的細胞毒性進行了測試，結果見表3。其中陰性對照物質甘油的CV75值大于5 000 μg/mL，陽性對照物質DNCB 的CV75值為2.5 μg/mL，符合OECD 相關方法中的參考值范圍，該試驗成立，待測物羥苯乙酯在測試濃度下的CV75值為126 μg/mL，羥苯丁酯在測試濃度下的CV75值為18 μg/mL。

2.2.2 CD86 和CD54 的有效作用濃度依據(jù)試驗情況，選用1.3.3 所列公式，計算受試物的CD86 的最低有效濃度(EC150)及CD54的最低有效濃度(EC200)。兩次獨立平行試驗中選取較高的EC150和EC200值作為最終值。

測試物質致敏性的兩次測定結果的EC值見表4。

表3 受試物質細胞毒性CV75值

表4 測試物質的EC150和EC200值

2.2.3 測試物質CD86 和CD54 的相對熒光強度值參考上述試驗中CV75值，在細胞存活率65%～95%范圍內，選取6 個劑量，測得待測物質的CD86 和CD54 的相對熒光強度和細胞活率，具體結果見表5。

表5 測定樣品的相對熒光強度值

2.3 BT試驗與h-CLAT試驗結果對比

將上述豚鼠局部封閉涂皮試驗與體外人細胞系活化試驗獲得的各個化學物質的致敏強度結果進行對比，結果見表6。

表6 BT法與h-CLAT試驗測試致敏性結果

3 討 論

歐盟現(xiàn)行化妝品法規(guī)第1223/2009 號條例于2009年頒布，2013年7月全面生效，取代1976年頒布的歐盟化妝品的理事會76/768/EEC指令，成為歐洲化妝品行業(yè)的統(tǒng)一法規(guī)，新法規(guī)繼續(xù)保留了禁止動物試驗的規(guī)定，加強替代方法的研發(fā)投入與支持，鼓勵替代方法的運用，將成為未來對藥品、化妝品安全性評價的主要趨勢。

歐洲替代方法研究中心(ECVAM)已完成對h-CLAT 試驗的可行性 驗 證，2015 年12 月，OECD 已經(jīng)公布了該方法草案，并于2016年正式列為OECD的毒理學測試方法。Ashikaga 等[4]通過檢測細胞CD86 和CD54 的表達水平對100 種化學物的致敏性進行了判定，h-CLAT 與小鼠局部淋巴結試驗結果的一致性可達84%，h-CLAT 不僅能分辨出極強度致敏和強致敏，而且能分辨出中度致敏和弱致敏。Parise等[5]發(fā)現(xiàn)受試物經(jīng)過暴露48 h后，可以用h-CLAT 法通過分析THP-1細胞CD86的表達水平將23種致敏物質的22種鑒定出來，結合CD86 和白細胞介素-8 的分析對致敏物可做綜合判斷。

羥基苯酯類是世界上使用廣泛的防腐劑，其中羥苯乙酯，羥苯丁酯是常見的化妝品用防腐劑，隨著人們，尤其是女性消費者對化妝品的使用量日趨上升，其對人們的皮膚及其身體健康的影響亦受到越來越多的關注，由化妝品引起的皮膚致敏性是重要關注點。本研究選用體外人細胞系活化試驗和豚鼠局部封閉涂皮試驗測試化學物的皮膚致敏性，兩種方法對陽性對照和陰性對照均做出正確判斷，說明試驗方法可靠。體外人細胞系活化試驗檢測兩種化妝品防腐劑均為致敏陽性，羥苯乙酯為弱致敏物，羥苯丁酯為強致敏物。利用體外方法檢測羥苯脂類的致敏性文章報道不多，2015 年Sonnenburg 等[6]采用體外培養(yǎng)的外周血單核細胞檢測羥苯脂類的致敏性，結果顯示羥苯乙酯為弱致敏，羥苯丁酯為強致敏，盡管與本實驗采用的測試細胞系不同，兩者的檢測結果相一致。利用h-CLAT 試驗方法，通過測定CD86 和CD54 的表達對羥苯乙酯，羥苯丁酯的致敏性測試，還未見相關報道。豚鼠局部封閉涂皮試驗檢測羥苯乙酯為非致敏物，羥苯丁酯為中度致敏物。由于國外近年來禁止動物試驗，采用豚鼠進行的測試，多是較早期的報道，1952年Sokol[7]利用豚鼠皮下注射方法，對羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯4 種物質的測試結果顯示，4種物質均未出現(xiàn)致敏性。

上述兩種方法檢測皮膚致敏性，采用的方式和原理不同，豚鼠法是模擬人體經(jīng)皮膚接觸化學物后引起致敏的全過程，含有測試物質需要透皮的環(huán)節(jié)，而體外細胞方法是通過對皮膚致敏過程中CD86和CD54表達的測定從而來判定受試物是否具有致敏性。從施用方式上而言，前者更接近與人體接觸的真實情況，但動物試驗也存在種屬差異的問題，本研究的體內試驗未采用二次激發(fā)觀察致敏情況，也可能是其敏感性及檢出率低的原因，在后期將對此進一步研究、探討。h-CLAT 試驗通過細胞方法測試，雖然檢測特異性高，但也不排除假陽性的可能。此外，兩種方法致敏強度分級標準也不盡相同，可能導致同一物質采用不同的試驗方法，結果被判定為強或弱的等級不完全一致。

如上所述，許多研究者認為，目前單一體外替代方法不能完全替代動物試驗，單一方法可以作為篩選性試驗，應采用更多的組合策略對致敏性進行測試。