蘭 莉，陳海麗，徐 蕾

(十堰市婦幼保健院產(chǎn)科，湖北 十堰 442008)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，對女性生命健康造成極大的威脅。宮頸癌具有較高的致死率，近幾年來，其發(fā)病率呈增長和年輕化趨勢[1]。早期宮頸癌治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等，但部分患者極易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳[2]。目前，宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，并且缺乏有效的診斷和治療靶點，因此探討宮頸癌的致病機(jī)制、尋找宮頸癌的治療靶點具有重大意義。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生命活動，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。RNA 結(jié)合基序單鏈相互作用蛋白3(RNA-binding motif，singlestranded-interacting protein 3，RBMS3)是一種RNA 結(jié)合蛋白，在人體內(nèi)廣泛表達(dá)。研究顯示，RBMS3參與胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]，可作為腫瘤診治的生物學(xué)標(biāo)記或分子靶點。RBMS3 反義鏈3(RBMS3 antisense 3，RBMS3-AS3)是一種lncRNA，且部分與RBMS3基因互補(bǔ)。有報道稱，RBMS3-AS3在宮頸癌組織中高表達(dá)，可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[6]。本研究主要探討了RBMS3-AS3對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響及其是否通過調(diào)控RBMS3表達(dá)發(fā)揮作用，以期為宮頸癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和實驗試劑

人宮頸永生化細(xì)胞Ect1/E6E7 和宮頸癌細(xì)胞HeLa、Caski 和SiHa，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI 1640 培養(yǎng)基， 購于美國Gibco 公司； 四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazoletrazolium，MTT)和胰蛋白酶，購于美國Sigma 公 司；Trizol 試 劑 和LipofectamineTM2000 試 劑盒，購于美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，購于深圳晶美公司；鼠抗人RBMS3 單克隆抗體，購于英國Abcam 公司；鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)單克隆抗體和兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcell lymphoma-2，Bcl-2)、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)多克隆抗體，購于北京中山生物技術(shù)有限公司；PCR引物，購于上海生工生物工程有限公司；RBMS3-AS3 和RBMS3 的小干擾RNA，購于上海吉凱基因公司；BCA蛋白測定試劑盒，購于上海碧云天公司；Annexin V-FITC/PI 試劑盒，購于上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸永生化細(xì)胞Ect1/E6E7 和宮頸癌細(xì)胞HeLa、Caski 和SiHa 均用含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基、置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d 更換1 次新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實時熒光定量PCR 檢測RBMS3-AS3 表達(dá)將對數(shù)生長期的Ect1/E6E7、HeLa、Caski和SiHa細(xì)胞均以每孔1×105個接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，用Trizol 試劑提取細(xì)胞中總RNA，經(jīng)微量核酸儀檢測純度和濃度后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進(jìn)行實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性6 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35 個循環(huán)。引物序列：RBMS3-AS3 上游5′-CGGGCTTAGCCGTAGCG TTGC-3′，下 游5′-CAAATGGCCCGTGGTCATGCG-3′；GAPDH 上 游5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，下游5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算RBMS3-AS3相對表達(dá)水平。

1.2.3 Western blot 法檢測RBMS3 蛋白表達(dá)將對數(shù)生長期的Ect1/E6E7、HeLa、Caski和SiHa細(xì)胞均以每孔1×105個接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測蛋白含量。取適量蛋白，100 ℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每泳道30 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟膜，將其置于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加RBMS3(1∶500)、β-actin(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后，加辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h。TBST 緩沖液洗膜后，加入ECL 顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，ImageJ軟件分析RBMS3蛋白相對表達(dá)水平。RBMS3蛋白相對表達(dá)水平以其蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示。

1.2.4 HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組將宮頸癌細(xì)胞HeLa以1×105個/孔接種于6 孔板中，待細(xì)胞生長至匯合度為60%時，更換無FBS的培養(yǎng)基，并分為si-RBMS3-AS3組、陰性序列組、si-RBMS3-AS3+si-RBMS3 和si-RBMS3-AS3+陰性序列組。其中si-RBMS3-AS3 組轉(zhuǎn)染RBMS3-AS3 的小干擾RNA，陰性序列組轉(zhuǎn)染亂序無意義陰性序列，si-RBMS3-AS3+si-RBMS3 組共轉(zhuǎn)染RBMS3-AS3 的小干擾RNA 與RBMS3 的小干擾RNA，si-RBMS3-AS3+陰性序列組共轉(zhuǎn)染RBMS3-AS3 的小干擾RNA 與亂序無意義陰性序列。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。同時設(shè)置對照組(對照組)：不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，細(xì)胞正常培養(yǎng)相同時間。qPCR 法檢測各組HeLa 細(xì)胞中RBMS3-AS3 表達(dá)水平，方法同1.2.2；Western blot法檢測各組HeLa 細(xì)胞中RBMS3、Cyclin D1、Bcl-2、Bax 和MMP-2 蛋白表達(dá)，方法同1.2.3，其中RBMS3、Cyclin D1、Bcl-2、Bax 和MMP-2 一抗稀釋度分為1∶500、1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶500。

1.2.5 MTT 檢測細(xì)胞增殖各組HeLa 細(xì)胞以1×103個/孔接種于96 孔板中，分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，加20 μL濃度為5 g/L的MTT，繼續(xù)孵育4 h。棄培養(yǎng)基，加150 μL 二甲基亞砜，振蕩混勻，酶標(biāo)儀測定光密度D(490)值。

1.2.6 Transwell 實驗檢測細(xì)胞侵襲將Matrigel 基質(zhì)膠用RPMI 1640 培養(yǎng)基以1∶8 的比例稀釋，鋪于Transwell小室的上室，自然晾干。調(diào)整各組HeLa細(xì)胞密度為5×104個/mL。取100 μL 細(xì)胞懸液，加入Transwell 上室。下室加500 μL 含F(xiàn)BS 的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min，置于倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個視野，對侵襲細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率各組HeLa 細(xì)胞以1×104個/孔接種于24 孔板，培養(yǎng)48 h 后，胰酶消化，適量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細(xì)胞2 次。取含1.0×106個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，吸棄PBS，加入400 μL結(jié)合緩沖液，用移液器輕輕吹打，混懸細(xì)胞。加入10 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min 后，加入5 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，室溫避光反應(yīng)5 min。最后再加入100 μL 結(jié)合緩沖液，混勻后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

細(xì)胞凋亡率/%=(早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS 22.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 RBMS3-AS3和RBMS3在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

Western blot和qPCR檢測結(jié)果見圖1和表1，宮頸癌細(xì)胞系HeLa、Caski和SiHa中RBMS3-AS3的表達(dá)水平均高于Ect1/E6E7細(xì)胞(P＜0.05)，而RBMS3蛋白表達(dá)均低于Ect1/E6E7細(xì)胞(P＜0.05)。由于宮頸癌細(xì)胞HeLa中RBMS3-AS3、RBMS3 蛋白的表達(dá)水平較Ect1/E6E7細(xì)胞差異更顯著，因此，選擇HeLa 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 Western blot檢測宮頸癌細(xì)胞株中RBMS3蛋白表達(dá)的條帶圖

表1 qPCR 和Western blot 檢測宮頸癌細(xì)胞株中RBMS3-AS3 和RBMS3蛋白的表達(dá)±s，n=9)

表1 qPCR 和Western blot 檢測宮頸癌細(xì)胞株中RBMS3-AS3 和RBMS3蛋白的表達(dá)±s，n=9)

與正常宮頸細(xì)胞株Ect1/E6E7比較，*P＜0.05.

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2.2 HeLa細(xì)胞中RBMS3-AS3的表達(dá)

qPCR檢測結(jié)果見表2，與對照組或陰性序列組比較，si-RBMS3-AS3 組HeLa 細(xì)胞RBMS3-AS3 相對表達(dá)水平降低(P＜0.05)，而對照組與陰性序列組HeLa 細(xì)胞RBMS3-AS3 相對表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 qPCR檢測各組HeLa細(xì)胞中RBMS3-AS3表達(dá)(x±s，n=9)

2.3 HeLa 細(xì)胞中RBMS3、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、MMP-2蛋白的表達(dá)

Western blot 檢測結(jié)果見圖2 和表3，與對照組或陰性序列組比較，si-RBMS3-AS3 組HeLa 細(xì)胞中RBMS3、Bax 的 蛋 白 表 達(dá) 水 平 升 高(P＜0.05)，Cyclin D1、Bcl-2 和MMP-2 的蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05)，而對照組與陰性序列組HeLa 細(xì)胞中RBMS3、Cyclin D1、Bax、Bcl-2 和MMP-2 蛋白表達(dá)水平比較均無顯著差異(P＞0.05)。與si-RBMS3-AS3+陰性序列組比較， si-RBMS3-AS3 + si-RBMS3 組HeLa 細(xì) 胞 中RBMS3、Bax 的蛋 白 表達(dá) 水 平降低(P＜0.05)，Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2的蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.05)。

圖2 Western blot檢測各組細(xì)胞中RBMS3、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、MMP-2蛋白表達(dá)

表3 Western blot檢測各組HeLa細(xì)胞中RBMS3、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、MMP-2蛋白表達(dá)水平±s，n=9)

表3 Western blot檢測各組HeLa細(xì)胞中RBMS3、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、MMP-2蛋白表達(dá)水平±s，n=9)

與對照組比較，*P＜0.05；與陰性序列組比較，#P＜0.05；與si-RBMS3-AS3+陰性序列組比較，&P＜0.05.

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2.4 HeLa細(xì)胞的增殖情況

MTT 法檢測各組HeLa 細(xì)胞的增殖情況結(jié)果見表4，可見與對照組或陰性序列組比較，si-RBMS3-AS3組HeLa 細(xì)胞D(490)值降低(P＜0.05)，而對照組與陰性序列組HeLa 細(xì)胞D(490)值比較無顯著差異(P＞0.05)。與si-RBMS3-AS3+陰性序列組比較，si-RBMS3-AS3+si-RBMS3組HeLa細(xì)胞D(490)值升高(P＜0.05)。

表4 MTT法檢測各組HeLa細(xì)胞的增殖情況[D(490)值，s，n=9]

表4 MTT法檢測各組HeLa細(xì)胞的增殖情況[D(490)值，s，n=9]

與對照組比較，*P＜0.05；與陰性序列組比較，#P＜0.05；與si-RBMS3-AS3+陰性序列組比較，&P＜0.05.

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2.5 HeLa細(xì)胞的侵襲情況

Transwell實驗檢測各組HeLa細(xì)胞侵襲情況結(jié)果見表5 和圖3，可見與對照組或陰性序列組比較，si-RBMS3-AS3組HeLa細(xì)胞侵襲數(shù)降低(P＜0.05)，而對照組與陰性序列組HeLa 細(xì)胞侵襲數(shù)比較無顯著差異(P＞0.05)。與si-RBMS3-AS3+陰性序列組比較，si-RBMS3-AS3+si-RBMS3 組HeLa 細(xì)胞侵襲數(shù)顯著升高(P＜0.05)。

表5 Transwell實驗檢測各組HeLa細(xì)胞的侵襲數(shù)目s，n=9)

表5 Transwell實驗檢測各組HeLa細(xì)胞的侵襲數(shù)目s，n=9)

與對照組比較，*P＜0.05；與陰性序列組比較，#P＜0.05；與si-RBMS3-AS3+陰性序列組比較，&P＜0.05.

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2.6 HeLa細(xì)胞的凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HeLa細(xì)胞凋亡率結(jié)果見表6和圖4，可見與對照組或陰性序列組比較，si-RBMS3-AS3組HeLa細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05)，而對照組與陰性序列組HeLa 細(xì)胞凋亡率比較無顯著差異(P＞0.05)。與si-RBMS3-AS3+陰性序列組比較，si-RBMS3-AS3+si-RBMS3 組HeLa 細(xì)胞凋亡率降低(P＜0.05)。

表6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HeLa細(xì)胞凋亡率s，n=9)

表6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HeLa細(xì)胞凋亡率s，n=9)

與對照組比較，*P＜0.05；與陰性序列組比較，#P＜0.05；與si-RBMS3-AS3+陰性序列組比較，&P＜0.05.

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圖3 Transwell實驗檢測各組HeLa細(xì)胞侵襲情況

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HeLa細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個多因素和多階段的過程。宮頸癌的早期診斷和治療缺乏有效的生物學(xué)指標(biāo)，因此，研究宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的分子機(jī)制，尋找有效的診斷和分子治療靶點，有助于宮頸癌患者的治療。LncRNA 可在轉(zhuǎn)錄，表觀遺傳等多個方面調(diào)控基因的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為[7-9]。LncRNA 的作用機(jī)制與相鄰基因的位置關(guān)系十分密切，根據(jù)其編碼蛋白基因的位置關(guān)系，可將lncRNA 分為正義(sense)、反義(antisense)，雙向(bidirectional)、內(nèi)含子(intronic)和基因間(intergenic)lncRNA。其中反義鏈型lncRNA 對相應(yīng)基因具有調(diào)控作用，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。

RBMS3-AS3 是RBMS3 反義鏈3，屬于lncRNA。Su等[11]研究顯示，RBMS3-AS3在主動脈瘤中表達(dá)有差異，可作為主動脈瘤的診斷標(biāo)志物。目前RBMS3-AS3對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和作用機(jī)制還未見相關(guān)報道。本研究顯示，與人宮頸永生化細(xì)胞Ect1/E6E7 比 較，宮 頸 癌 細(xì) 胞HeLa、Caski 和SiHa 中RBMS3-AS3 表達(dá)降低，提示RBMS3-AS3 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。通過轉(zhuǎn)染RBMS3-AS3 的小干擾RNA 抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞中RBMS3-AS3 表達(dá)后，細(xì)胞增殖和侵襲受到抑制，凋亡加劇，Cyclin D1、Bcl-2 和MMP-2 蛋白表達(dá)降低，Bax 蛋白表達(dá)升高，說明抑制RBMS3-AS3 表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示RBMS3-AS3 可能是宮頸癌治療的潛在作用靶點。

RBMS3是C-myc基因單鏈結(jié)合蛋白家族成員，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究顯示，RBMS3在胃癌細(xì)胞中表達(dá)降低，過表達(dá)RBMS3可通過阻滯Wnt/β-catenin 信號通路，抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]；人乳腺癌組織和細(xì)胞系RBMS3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，RBMS3過表達(dá)可在體外顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲及體內(nèi)腫瘤生長[13]；膽囊癌組織中RBMS3 表達(dá)降低，過表達(dá)RBMS3 可抑制膽囊癌細(xì)胞增殖和克隆形成，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞中RBMS3 蛋白呈低表達(dá)，提示RBMS3參與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。抑制宮頸癌細(xì)胞中RBMS3-AS3 表達(dá)后，RBMS3 蛋白表達(dá)升高，且抑制RBMS3 表達(dá)逆轉(zhuǎn)RBMS3-AS3 對宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用及凋亡的促進(jìn)作用，并能夠逆轉(zhuǎn)RBMS3-AS3 對宮頸癌細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2、Bax 及MMP-2 蛋白表達(dá)的影響，提示RBMS3-AS3 可能通過上調(diào)RBMS3表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，RBMS3-AS3 在宮頸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，RBMS3 蛋白呈低表達(dá)；抑制RBMS3-AS3 表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，其可能通過負(fù)調(diào)控RBMS3表達(dá)發(fā)揮作用，是宮頸癌靶向治療的潛在作用靶點。