王慶海,夏凡,2,李翠,卻曉娥
(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心,北京100097;2.中南林業(yè)科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,長(zhǎng)沙410004;3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院荒漠化研究所,北京100091)
阿特拉津(Atrazine,ATZ)廣泛應(yīng)用于農(nóng)田、果園和草地,并已成為水體檢出頻率最高的除草劑之一[1]。我國(guó)長(zhǎng)江流域、黃河流域、太湖流域和松花江流域等重點(diǎn)流域地表水中ATZ 的樣點(diǎn)檢出率為100%[2],其中長(zhǎng)江流域重慶段部分樣點(diǎn)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)處于中等水平[3]。ATZ 在環(huán)境中具有移動(dòng)性和持久性,一項(xiàng)全國(guó)性的調(diào)查在地下水和自來(lái)水中亦檢測(cè)到ATZ或其降解產(chǎn)物[4]。因此,ATZ 污染對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康潛在的影響和危害受到廣泛關(guān)注,研究ATZ污染水體的治理技術(shù)十分必要。
目前,植物修復(fù)是治理水體ATZ污染的主要技術(shù)手段之一[5]。研究表明,水生植物金錢蒲(Acorus gra?mineus)和美人蕉(Canna hybrida)能有效去除水中的ATZ,歷時(shí)14 d ATZ 濃度降低32%~51%[6]。柳枝稷(Panicum vergatum)和須芒草(Andropogon gerardii)能吸收培養(yǎng)液中近40%的ATZ,其中絕大部分(>86%)可被轉(zhuǎn)運(yùn)至莖葉,具備修復(fù)植物的優(yōu)良特性[7]。植物對(duì)ATZ的去除率與植物的生物量、根冠比存在明顯的正相關(guān)關(guān)系[8],微生物的協(xié)同作用也是植物發(fā)揮修復(fù)效能的重要基礎(chǔ)[9]。研究證實(shí),微生物和植物酶的根際降解/礦化作用以及植株體內(nèi)降解是去除ATZ 污染的主要機(jī)制,其貢獻(xiàn)大于植物的富集作用[10]。由于ATZ的植物毒性具有顯著的劑量效應(yīng),其殘留量也是影響微生物菌屬相對(duì)豐度的主要環(huán)境因子[11],所以ATZ 濃度勢(shì)必影響植物生長(zhǎng),進(jìn)而影響污染修復(fù)效果?,F(xiàn)有研究對(duì)ATZ 濃度與植物修復(fù)效果的關(guān)系報(bào)道較少,對(duì)植物修復(fù)系統(tǒng)中植物和微生物的作用多數(shù)也只進(jìn)行了定性描述,無(wú)法準(zhǔn)確分析修復(fù)植物對(duì)污染物的去除潛力及其重要性。但這些信息對(duì)修復(fù)植物的篩選評(píng)價(jià)至關(guān)重要。
黃菖蒲(Iris pseudacorus)是多年生草本挺水植物,對(duì)ATZ 具有較強(qiáng)的耐受性,具有作為修復(fù)植物的潛力[12]。本試驗(yàn)以黃菖蒲為修復(fù)植物,研究了不同ATZ 濃度條件下植物的修復(fù)效率和ATZ 在植物體內(nèi)的運(yùn)移分布特征,并定量分析植物和微生物在水培系統(tǒng)中對(duì)污染物的去除貢獻(xiàn),為ATZ污染水體治理選擇修復(fù)植物提供依據(jù)。
試驗(yàn)所用植物材料黃菖蒲為溫室營(yíng)養(yǎng)缽培育。挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗(4~6 葉期)進(jìn)行移栽,移栽前清洗幼苗根部泥土,置于10%Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)1周適應(yīng)水培環(huán)境,將預(yù)培養(yǎng)后的幼苗(株高:42.2±2.5 cm,每株鮮質(zhì)量:4.7±1.2 g)移入塑料培養(yǎng)桶(直徑15 cm,高25 cm)中進(jìn)行試驗(yàn)。每個(gè)培養(yǎng)桶放1 000 mL 10%Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液,并移入3 株幼苗。營(yíng)養(yǎng)液母液含:0.51 g·L-1KNO3、0.82 g·L-1Ca(NO3)2、0.49 g·L-1MgSO4·7H2O、0.136 g·L-1KH2PO4、2.86 mg·L-1H3BO3、0.08 mg·L-1CuSO4·5H2O、0.22 mg·L-1ZnSO4·7H2O、1.81 mg·L-1MnCl2·4H2O、0.09 mg·L-1H2MoO4·H2O、20 mg·L-1Fe-EDTA。營(yíng)養(yǎng)液用超純水配制和稀釋。
供試儀器包括Xevo TQD 高效液相色譜-質(zhì)譜儀(Waters,美國(guó))、RE100-Pro 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京瑞成偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司),試驗(yàn)所用ATZ 為380 g·L-1ATZ 懸浮劑(山東濱農(nóng)科技有限公司生產(chǎn))。ATZ標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 μg·L-1甲醇溶液)購(gòu)于百靈威公司,丙酮、石油醚為分析純級(jí),甲醇和甲酸均為色譜純級(jí),試驗(yàn)用水均為超純水(18.2 MΩ·cm)。
ATZ 濃度高達(dá)32 mg·L-1時(shí)黃菖蒲仍可存活,最低可觀察效應(yīng)濃度為2 mg·L-1[12],據(jù)此按倍數(shù)法設(shè)置0.5、1、2、4 mg·L-1共4 個(gè)濃度。每個(gè)濃度處理分別進(jìn)行如下設(shè)計(jì):
(1)無(wú)植物不抑菌處理:不種植物,培養(yǎng)液中添加ATZ。
(2)無(wú)植物抑菌對(duì)照:不種植物,培養(yǎng)液中添加ATZ,并加入氨芐青霉素,使其在培養(yǎng)液中的濃度為10 mg·L-1(該劑量能有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)而對(duì)植物生長(zhǎng)無(wú)明顯影響)[13]。為保證抑菌效果,氨芐青霉素每周添加1 次(抑菌處理用作在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)確定植物、微生物和其他因素對(duì)ATZ消解的貢獻(xiàn))。
(3)有植物不抑菌處理:種植物,培養(yǎng)液中添加ATZ。
(4)有植物抑菌處理:種植物,培養(yǎng)液中添加ATZ,并加入氨芐青霉素(濃度及添加方法同上)。
每個(gè)處理共設(shè)33個(gè)培養(yǎng)桶(水樣采集11次,每次3 個(gè)重復(fù)),其他條件一致。所有處理均置于日光溫室培養(yǎng),培養(yǎng)期間溫室內(nèi)溫度為21~35 ℃,光強(qiáng)約為自然光強(qiáng)的60%。試驗(yàn)期間,每日向桶里添加10%Hoagland 培養(yǎng)液至水位標(biāo)志線,以補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分和消耗掉的養(yǎng)分。
在試驗(yàn)進(jìn)行的前7 d 每日采集水樣,隨后分別在14、21、28 d和35 d采集水樣。采集水樣時(shí),在每個(gè)處理的33 個(gè)培養(yǎng)容器中隨機(jī)選擇3 個(gè)(3 次重復(fù)),將培養(yǎng)液補(bǔ)足至1 000 mL(初始體積),充分搖勻后用聚乙烯瓶取200 mL。為避免連續(xù)水樣采集對(duì)試驗(yàn)的影響,取過(guò)水樣的3 次重復(fù)不再進(jìn)行后續(xù)取樣觀察。植株全株樣品分別于7、14、21、28 d和35 d采集,用蒸餾水清洗干凈后分成莖葉和根系兩部分,分別測(cè)定其ATZ 含量。水樣和植物樣中ATZ 提取參照董靜[14]的方法,通過(guò)丙酮水混合液進(jìn)行提取,再由C-18固相萃取小柱凈化,具體操作步驟為:分別取植物的地上部分和地下部分各1 g,于勻漿機(jī)中研磨;將勻漿后的植物樣品,用15 mL丙酮與水混合液(V∶V=3∶1)振蕩提取30 min,4 000g離心10 min,取上清提取液,將沉淀重復(fù)提取2 次,合并提取液;將提取液40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除丙酮,收集剩余水相;將水相用20、15、5 mL 石油醚萃取3次,收集有機(jī)相,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干;用0.5 mL 色譜純甲醇和10 mL 超純水溶解旋蒸殘留,將溶解液通過(guò)預(yù)活化的C-18 固相萃取小柱,棄流出液;用2 mL色譜甲醇洗脫,抽干,收集洗脫液,經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后待測(cè)。
ATZ 測(cè)定采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLCMS/MS)分析[15]。液相色譜配UV 檢測(cè)器,采用C18-UPLC 色譜柱(5 μm,4.6×250 mm),流動(dòng)相A 為甲醇,流動(dòng)相B 為0.1%的甲酸水溶液,流速0.6 mL·min-1,進(jìn)樣量為10 μL,柱溫28 ℃,色譜分離的條件為:0~6 min,95%B;6~20 min,10%B;20~25 min,10%B;25~25.1 min,95%B;25.1~30 min,95%B。質(zhì)譜條件:電噴霧電離(ESI+)離子源,離子源溫度設(shè)為350 ℃,源電壓設(shè)為3.5 kV,脫溶劑溫度:350 ℃。定性離子對(duì)為m/z=216.2/104.0,定量離子對(duì)為m/z=216.2/174.1,碰撞電壓為26 V和16 V,碰撞能量為28 eV和17 eV。
使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析,不同ATZ 濃度處理間差異顯著性檢驗(yàn)采用新復(fù)極差法(Duncan′s 法),抑菌和不抑菌間、根系和莖葉間差異顯著性檢驗(yàn)采用t 檢驗(yàn)法;并用該軟件中的最優(yōu)尺度回歸分析定量評(píng)價(jià)各影響因素對(duì)植物和微生物去除貢獻(xiàn)的重要性。采用Origin 9.2 繪圖和擬合方程,圖中誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。ATZ 消解速率常數(shù)和半衰期借助一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)方程來(lái)計(jì)算:
式中:Ct為ATZ 殘留濃度,mg·L-1;C0為ATZ 初始濃度,mg·L-1;t為時(shí)間,d;K為消解速率常數(shù)。
歷時(shí)35 d ATZ(38%懸浮劑中有效成分,下同)的消解率,無(wú)論是否抑菌,有植物處理均顯著高于無(wú)植物處理;無(wú)論有無(wú)植物,不抑菌處理均顯著高于抑菌處理(表1)。就同一初始濃度而言,無(wú)植物+抑菌處理的消解率最低,有植物+不抑菌處理的消解率最高,二者差異顯著。ATZ的消解率隨初始濃度的增加而降低,濃度間差異顯著。培養(yǎng)液中ATZ殘留濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降。ATZ 的半衰期隨初始濃度的增加而加長(zhǎng),而且濃度間差異顯著(表1)。各處理培養(yǎng)液中ATZ殘留濃度與時(shí)間的關(guān)系,均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)方程(表2)。植物和微生物存在的條件下,ATZ 的半衰期顯著縮短,僅為無(wú)植物抑菌對(duì)照的1/3~1/2。已有研究發(fā)現(xiàn)修復(fù)植物黑麥草(Lolium perenne)明顯促進(jìn)土壤中ATZ殘留的降解,歷時(shí)19 d去除率由未種植物處理的40%提高至61%[16];水浮蓮(Pistia stra?tiotes)和鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)能加快水中異惡草酮的消解,去除率達(dá)90%以上[17]。這些研究結(jié)果表明植物可加速除草劑的消解,縮短其在環(huán)境中的滯留時(shí)間。
植物、微生物和ATZ初始濃度等因素均影響ATZ的消解率,為進(jìn)一步定量分析各因素對(duì)ATZ消解率的重要性,以ATZ 消解率為因變量,以植物、微生物(無(wú)序分類變量)和ATZ 濃度為自變量,進(jìn)行最優(yōu)尺度回歸分析。由回歸方程的決定系數(shù)(R2)、顯著性水平(P值)可以看出,ATZ 消解率與這些因素的最優(yōu)尺度回歸分析是有意義的(表3)。植物、微生物和ATZ 初始濃度均是ATZ 消解率的顯著影響因素(P<0.001),其中ATZ 初始濃度的影響最大(標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)為-0.700,重要性為0.543),其次為微生物,最后是植物。由此可見(jiàn),植物修復(fù)系統(tǒng)中,ATZ 污染負(fù)荷對(duì)去除率的重要性超過(guò)微生物和植物,成為影響植物修復(fù)效率的首要因素。實(shí)踐中,植物修復(fù)技術(shù)措施的采用需在準(zhǔn)確分析污染物濃度的基礎(chǔ)上進(jìn)行。
ATZ 在植物修復(fù)系統(tǒng)中的消解速率常數(shù)隨其初始濃度的升高而降低;有植物+不抑菌、有植物+抑菌、無(wú)植物+不抑菌和無(wú)植物+抑菌4個(gè)處理間差異顯著,有植物+不抑菌處理高于其他3 個(gè)處理,無(wú)植物+抑菌處理低于其他3 個(gè)處理(圖1)。就同一處理而言,ATZ 的消解速率常數(shù)隨初始濃度的升高而下降,而且不同初始濃度的消解速率常數(shù)相互間差異顯著。
表1 各處理ATZ第35 d時(shí)的消解率Table 1 Dissipation rates of atrazine in culture solution at 35th day
表2 ATZ在不同處理水體中的一級(jí)消解動(dòng)力學(xué)方程Table 2 The first order kinetic equation of atrazine in different treatments
表3 ATZ消解與各因素的回歸分析Table 3 The contribution of related factors to ATZ dissipation based on optimal scaling regression analysis
ATZ總消解速率常數(shù)(K)是微生物、植物、水解和光解等因素綜合作用的消解速率常數(shù)之和,各因素對(duì)ATZ 消解的貢獻(xiàn)率可采用各自的K值與總K值之比得到。本試驗(yàn)條件下,植物對(duì)ATZ消解的貢獻(xiàn)率不抑菌條件下為34%~49%,顯著高于抑菌條件下的貢獻(xiàn)率(17%~38%)(圖2)。不抑菌條件下,植物對(duì)ATZ 消解的貢獻(xiàn)率隨初始濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),1 mg·L-1處理顯著高于其他濃度處理。抑菌條件下,植物對(duì)ATZ 消解貢獻(xiàn)率的變化趨勢(shì)與不抑菌條件下的相似。微生物對(duì)ATZ 消解貢獻(xiàn)率的無(wú)植物時(shí)為28%~41%,顯著低于有植物時(shí)(41%~49%);有植物時(shí)微生物的貢獻(xiàn)受ATZ 濃度影響較小,而無(wú)植物時(shí)高濃度處理的貢獻(xiàn)率顯著低于低濃度處理(圖2)。最優(yōu)尺度回歸分析結(jié)果表明,ATZ初始濃度對(duì)植物的貢獻(xiàn)率影響不顯著,但顯著影響微生物的貢獻(xiàn)率;植物和微生物均對(duì)對(duì)方的貢獻(xiàn)率有顯著影響,且重要性均超過(guò)ATZ 初始濃度(表3)。Qu 等[18]利用穗狀狐尾藻修復(fù)湖泊底泥ATZ污染,發(fā)現(xiàn)植物能夠改變修復(fù)系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu),促進(jìn)ATZ 降解細(xì)菌醋酸桿菌(Acetobacter)和狹義梭菌(Clostridium-sensu-stricto)生長(zhǎng)。反過(guò)來(lái),微生物可減輕ATZ在生長(zhǎng)和生理方面對(duì)修復(fù)植物的脅迫和損傷[19]。ATZ 初始濃度為1 mg·L-1時(shí),植物的貢獻(xiàn)率顯著高于微生物的;而其他3個(gè)初始濃度處理,微生物的貢獻(xiàn)率均顯著高于植物的。這表明微生物在植物修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著更為重要的作用。本研究采用添加氨芐青霉素的方法抑菌,并不能達(dá)到完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的理想效果,微生物的降解貢獻(xiàn)有可能被低估。其他因素對(duì)ATZ消解的貢獻(xiàn)率為11%~20%,0.5 mg·L-1顯著高于其他濃度處理(圖2)。這表明植物修復(fù)系統(tǒng)中其他因素在ATZ 濃度較低時(shí)貢獻(xiàn)較大。
圖1 不同條件下ATZ的消解速率常數(shù)Figure 1 The dissipation kinetics constant of atrazine in water during the experimental period
圖2 植物修復(fù)系統(tǒng)中不同因素對(duì)ATZ消解的貢獻(xiàn)率Figure 2 The relative contribution of various factors to atrazine dissipation in water
黃菖蒲在含有ATZ 的培養(yǎng)液中培養(yǎng),7、14、21、28 d 和35 d 時(shí)植物莖葉和根系均可檢測(cè)到ATZ(圖3)。這表明黃菖蒲根系吸收累積ATZ后,能夠向莖葉運(yùn)輸。而且莖葉中ATZ 含量普遍與根系中的無(wú)顯著差異。就農(nóng)藥而言,疏水性是影響其在植物體內(nèi)向上運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵因素[20]。ATZ 具有中等疏水性(lgKow=2.6)。研究表明,具有中等疏水性(1<lgKow<4)的化合物更容易被植物根部吸收并向上轉(zhuǎn)運(yùn),而高疏水性化合物(lgKow>4)則更可能持留于根部[21]。進(jìn)一步研究表明,ATZ 是通過(guò)共質(zhì)體途徑被植物根部吸收,然后轉(zhuǎn)運(yùn)至莖葉[22]。就植物而言,吸收有毒有害物質(zhì)后盡快從根系轉(zhuǎn)移至莖葉,是對(duì)該物質(zhì)耐受的主要響應(yīng)機(jī)制之一。黃菖蒲莖葉和根系A(chǔ)TZ 含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),峰值出現(xiàn)的時(shí)間各濃度處理均為14 d時(shí),顯著高于7、28 d和35 d時(shí)的含量(圖3)。ATZ 含量后期持續(xù)降低,表明其在植物體內(nèi)發(fā)生降解。將累積于體內(nèi)的有毒物質(zhì)降解為低毒或無(wú)毒的物質(zhì),不僅是植物耐受性的體現(xiàn),而且是植物修復(fù)潛力的反映,更是理想修復(fù)植物應(yīng)具有的特性。由此推斷,黃菖蒲具有修復(fù)ATZ污染的潛力。在水體異噁草松污染的植物修復(fù)研究中,Alencar 等[17]發(fā)現(xiàn)大薸(Pistia stratiotes)不僅具有較高的污染去除能力,而且植物組織中并無(wú)該除草劑累積,這樣就避免了植物衰敗對(duì)水體造成二次污染。所以,ATZ 污染理想修復(fù)植物的篩選,應(yīng)對(duì)累積于植物體內(nèi)的ATZ的歸趨進(jìn)行深入研究,進(jìn)一步明確其降解產(chǎn)物的種類及其毒性效應(yīng)。
圖3 黃菖蒲體內(nèi)ATZ含量Figure 3 Atrazine in roots and shoots of I.pseudacorus
黃菖蒲莖葉和根系A(chǔ)TZ 含量隨初始濃度的升高而增加(圖3),二者呈顯著線性關(guān)系(圖4);4 mg·L-1處理顯著高于其他濃度處理,2 mg·L-1處理顯著高于0.5 mg·L-1和1 mg·L-1處理(圖3)。污染物初始濃度與修復(fù)植物累積量之間的正相關(guān)關(guān)系,在農(nóng)藥[23]和其他有機(jī)物[24]中均有發(fā)現(xiàn)。這意味著污染負(fù)荷一定程度上增加,會(huì)提高修復(fù)植物對(duì)污染物的累積量。但Dosnon-Olette 等[23]證實(shí),農(nóng)藥的植物毒性與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系。因此,污染物初始濃度過(guò)高,會(huì)對(duì)修復(fù)植物產(chǎn)生毒害作用,植物生長(zhǎng)受到抑制甚至死亡,導(dǎo)致吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解污染物的能力下降。
黃菖蒲體內(nèi)ATZ含量多數(shù)濃度處理無(wú)顯著差異,但0.5 mg·L-1和1 mg·L-1處理28 d 時(shí)根系A(chǔ)TZ 含量前者顯著高于后者;2 mg·L-1處理根系和莖葉累積峰值時(shí)(14 d)不抑菌處理均顯著高于抑菌處理(圖3A);而4 mg·L-1處理,黃菖蒲根系A(chǔ)TZ 含量在7、14 d 和21 d 時(shí)不抑菌處理卻顯著低于抑菌處理(圖3B)。有研究證實(shí),當(dāng)ATZ 暴露濃度不高于2 mg·L-1時(shí),黃菖蒲無(wú)明顯藥害癥狀[12]。而隨著ATZ 濃度升高,加之微生物的協(xié)同作用減弱,黃菖蒲生長(zhǎng)受到抑制,ATZ 由根系向莖葉的轉(zhuǎn)移量及在根系內(nèi)的降解量減少,導(dǎo)致抑菌處理根系含量較高。
本研究ATZ使用的是制劑產(chǎn)品,制劑產(chǎn)品中含有的助劑等其他成分可能會(huì)對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生影響,這須在后續(xù)相關(guān)研究中予以考慮。
圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間黃菖蒲ATZ累積量與培養(yǎng)液ATZ初始濃度的相關(guān)性Figure 4 Correlation between atrazine contents in plant and initial atrazine concentrations during different treatment period
(1)ATZ 濃度≤4 mg·L-1時(shí),歷時(shí)35 d 植物修復(fù)系統(tǒng)中ATZ 的消解率≥90%;ATZ 初始濃度、植物和微生物均顯著影響ATZ 的消解率,其中ATZ 初始濃度影響的重要性居首要地位。
(2)植物修復(fù)系統(tǒng)中,植物對(duì)ATZ 消解的貢獻(xiàn)率為34%~49%;ATZ 初始濃度對(duì)植物的貢獻(xiàn)無(wú)顯著影響,但顯著影響微生物的貢獻(xiàn)。微生物對(duì)植物的貢獻(xiàn)具有顯著的促進(jìn)作用。
(3)黃菖蒲根系能夠吸收ATZ 并將之轉(zhuǎn)運(yùn)至莖葉,且轉(zhuǎn)運(yùn)能力較強(qiáng),莖葉含量可與根系相當(dāng)。植物體內(nèi)ATZ 含量與ATZ 初始濃度存在顯著正相關(guān)性。ATZ可在植物體內(nèi)(根系和莖葉)發(fā)生降解。