謝大識，李繼仁，羅平華

(婁底職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000)

由于受到斷奶應(yīng)激的影響，仔豬在斷奶后容易發(fā)生以腸道黏膜破壞、腹瀉、采食量下降、生長停滯、機(jī)體抗病力和免疫力降低等為主要特征的“斷奶應(yīng)激綜合征”[1-2]。斷奶仔豬日糧中添加抗生素可在一定程度上提高斷奶仔豬的生長性能和抵抗致病菌能力，在一定程度上緩解“斷奶應(yīng)激綜合征”，但抗生素大量過度濫用可導(dǎo)致耐藥性、藥物殘留、環(huán)境污染等系列問題，開發(fā)并推廣應(yīng)用抗生素替代品已迫在眉睫[3-4]。微生態(tài)制劑是一類利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物制成的生物活菌制劑，將其作為飼料添加劑具有純天然、不產(chǎn)生耐藥性、不產(chǎn)生環(huán)境污染等優(yōu)點[5-6]。研究表明，微生態(tài)制劑能改善肉雞腸道的微生物菌落平衡，提高肉雞、仔豬、羔羊、犢牛飼料的消化吸收利用率[7-10]，提高蛋雞的產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)[11]，在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中將具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。本試驗旨在研究斷奶仔豬日糧中添加不同劑量的復(fù)合微生態(tài)制劑對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率、盲腸和糞便微生物菌群、免疫功能的影響，為緩解“斷奶應(yīng)激綜合征”提供一種實踐方法，為微生態(tài)制劑在仔豬養(yǎng)殖中的開發(fā)與推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 復(fù)合微生態(tài)制劑

復(fù)合微生態(tài)制劑購自湖北華大某科技有限公司，主要含有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、屎腸球菌、丁酸梭菌四種益生菌，其活菌總數(shù)≥1.0×109CFU/g。

1.2 斷奶仔豬

150頭21日齡健康杜長大三元雜交斷奶仔豬由湖南牛媽媽生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供。

1.3 培養(yǎng)基、試劑盒

EMB瓊脂培養(yǎng)基、LBS瓊脂培養(yǎng)基、BL瓊脂培養(yǎng)基，均購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；IgG ELISA檢測試劑盒、IgA ELISA檢測試劑盒、IgM ELISA檢測試劑盒、豬白介素-2(IL-2)ELISA檢測試劑盒、豬白介素-4(IL-4)ELISA檢測試劑盒、豬干擾素-γ(IFN-γ)ELISA檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.4 試驗整體設(shè)計

將150頭21日齡健康杜長大三元雜交斷奶仔豬完全隨機(jī)分成5組(對照組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組)，每組30頭斷奶仔豬，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)10頭斷奶仔豬。對照組仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧(日糧組成及營養(yǎng)水平見表1)，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別在基礎(chǔ)日糧中添加100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg、800 mg/kg的復(fù)合微生態(tài)制劑。所有試驗仔豬的日常飼養(yǎng)管理均完全一致，均自由采食和飲水，試驗期35 d。

1.5 檢測樣品的采集

1.5.1 血清樣品的采集 試驗結(jié)束時，對試驗仔豬逐頭采集血液1.0 mL，將采集的血液依次置于37 ℃放置2 h，4 ℃放置4 h后，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液即為待檢測的血清樣品。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutritional level of diet

1.5.2 盲腸與糞便樣品的采集 試驗結(jié)束時，試驗仔豬采集血液后，于每個重復(fù)中隨機(jī)挑選4頭仔豬，采集所挑選仔豬的新鮮糞便。糞便采集完成后對所挑選的仔豬進(jìn)行屠宰，無菌采集一段盲腸，各屠宰仔豬的盲腸截取部位均一致。

1.5.3 免疫器官樣品的采集 屠宰仔豬的盲腸采集完成后，分別摘取脾臟和肝臟。

1.6 檢測指標(biāo)與方法

1.6.1 生長性能和腹瀉率的測定 分別于試驗開始和結(jié)束時對仔豬空腹稱重，計算平均日增重。每天記錄飼料消耗量，計算平均日采食量。每天觀察仔豬的腹瀉情況，計算腹瀉率。

平均日增重(g)=(試驗?zāi)w重-試驗初體重)/試驗天數(shù)

平均日采食量(g)=試驗期間飼料消耗總量/試驗天數(shù)

料重比=平均日采食量/平均日增重

腹瀉率(%)=(腹瀉仔豬數(shù)×腹瀉天數(shù))/(試驗仔豬總數(shù)×試驗天數(shù))×100

1.6.2 盲腸和糞便微生物含量的測定 將無菌采集的盲腸(或糞便)準(zhǔn)確稱量1.0 g，溶解于9.0 mL滅菌生理鹽水中，充分混合均勻后吸取1.0 mL溶解于9.0 mL滅菌生理鹽水中，按照此種方法依次進(jìn)行10-8倍稀釋。取10-5～10-7倍的稀釋液各0.1 mL分別接種EMB瓊脂培養(yǎng)基于37 ℃放置24 h進(jìn)行大腸桿菌的分離培養(yǎng)并計數(shù)。取10-7～10-9倍的稀釋液各0.1 mL分別接種LBS瓊脂培養(yǎng)基于37 ℃放置48 h進(jìn)行乳酸桿菌的分離培養(yǎng)并計數(shù)。取10-6～10-8倍的稀釋液各0.1 mL分別接種BL瓊脂培養(yǎng)基于37 ℃放置48 h進(jìn)行雙歧桿菌的分離培養(yǎng)并計數(shù)。盲腸(或糞便)微生物含量以培養(yǎng)基菌落數(shù)量的對數(shù)表示，lg(CFU/g)。

1.6.3 免疫功能檢測指標(biāo)的測定 對采集的脾臟、肝臟進(jìn)行稱重，計算脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)。

免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官重量/體重

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長性能和腹瀉率的測定結(jié)果

如表2所示，Ⅰ組與對照組相比較，平均日增重提高了1.51%(P<0.05)，腹瀉率降低了33.07%(P<0.05)。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組與對照組相比較，平均日增重分別提高了3.17%、3.45%、2.91%，且差異顯著(P<0.05)；平均日采食量分別提高了0.75%、1.08%、0.58%，且差異顯著(P<0.05)；料重比均降低了1.99%(P<0.05)；腹瀉率分別降低了42.19%、53.91%、39.84%，且差異顯著(P<0.05)。Ⅲ組與Ⅱ組、Ⅳ組相比較，腹瀉率分別降低了20.27%、23.38%，且差異顯著(P<0.05)。該結(jié)果表明斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合微生態(tài)制劑能夠提高斷奶仔豬的生長性能，降低腹瀉率，以400 mg/kg添加劑量的作用效果最佳。

表2 生長性能和腹瀉率的測定結(jié)果Table 2 Test results of growth performance and diarrhea rate

2.2 盲腸和糞便微生物含量的測定結(jié)果

如表3所示，試驗Ⅰ組與對照組相比較，盲腸乳酸桿菌數(shù)提高了2.19%(P<0.05)，糞便大腸桿菌數(shù)降低了2.04%(P<0.05)。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組與對照組相比較，盲腸大腸桿菌數(shù)分別降低了2.16%、3.30%、2.59%，且差異顯著(P<0.05)；盲腸乳酸桿菌數(shù)分別提高了4.25%、6.32%、4.50%，且差異顯著(P<0.05)；盲腸雙歧桿菌數(shù)分別提高了2.05%、2.87%、1.91%，且差異顯著(P<0.05)；糞便大腸桿菌數(shù)分別降低了3.94%、4.82%、4.09%，且差異顯著(P<0.05)；糞便乳酸桿菌數(shù)分別提高了2.47%、3.45%、2.71%，且差異顯著(P<0.05)；糞便雙歧桿菌數(shù)分別提高了2.51%、2.93%、2.79%，且差異顯著(P<0.05)。Ⅲ組與Ⅱ組、Ⅳ組相比較，盲腸乳酸桿菌數(shù)分別提高了1.98%、1.74%，且差異顯著(P<0.05)。該結(jié)果表明斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合微生態(tài)制劑能夠改善斷奶仔豬的腸道微生物菌群平衡，以400 mg/kg添加劑量的作用效果最佳。

表3 盲腸和糞便微生物含量的測定結(jié)果Table 3 Determination results of cecum and fecal microbial content lg(CFU/g)

2.3 免疫功能檢測指標(biāo)的測定結(jié)果

如表4所示，試驗Ⅰ組與對照組相比較，IgG含量和IL-2含量分別提高了8.09%和3.76%(P<0.05)，且差異顯著(P<0.05)。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組與對照組相比較，脾臟指數(shù)分別提高了12.31%、16.41%、12.82%，且差異顯著(P<0.05)；IgG含量分別提高了15.18%、22.85%、15.68%，且差異顯著(P<0.05)；IgA含量分別提高了7.53%、9.41%、7.76%，且差異顯著(P<0.05)；IL-2含量分別提高了9.04%、11.58%、9.55%，且差異顯著(P<0.05)；IL-4含量分別提高了1.62%、1.74%、1.65%，且差異顯著(P<0.05)；IFN-γ含量分別提高了1.95%、2.44%、2.35%，且差異顯著(P<0.05)。Ⅲ組與Ⅱ組、Ⅳ組相比較，IgG含量分別提高了6.66%、6.21%，且差異顯著(P<0.05)。該結(jié)果表明斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合微生態(tài)制劑能夠提高斷奶仔豬的免疫功能，以400 mg/kg添加劑量的作用效果最佳。

表4 免疫功能檢測指標(biāo)的測定結(jié)果Table 4 Test results of immune function test indexes

3 討 論

3.1 復(fù)合微生態(tài)制劑對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

復(fù)合微生態(tài)制劑進(jìn)入仔豬體內(nèi)后能夠產(chǎn)生大量的纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶等多種消化酶以及大量氨基酸和維生素等，能夠增強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收利用率，提高飼料轉(zhuǎn)化利用率，增強(qiáng)腸道的消化吸收功能，提高仔豬生長性能并降低腹瀉率。陳勇等[8]研究表明，復(fù)合微生態(tài)制劑能顯著提高仔豬對營養(yǎng)物質(zhì)的表現(xiàn)消化率，提高仔豬的生產(chǎn)性能。楊紅萍等[12]研究表明，斷奶仔豬飼料中添加500 mg/kg、1 000 mg/kg、2 000 mg/kg的復(fù)合微生態(tài)制劑均能顯著提高仔豬的養(yǎng)分表觀消化率。本研究中以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、屎腸球菌、丁酸梭菌四種益生菌為主要成份的復(fù)合微生態(tài)制劑均能夠顯著提高斷奶仔豬的生長性能，降低腹瀉率，研究結(jié)果與上述研究結(jié)果表現(xiàn)出了一致性。但不同研究學(xué)者在斷奶仔豬日糧中復(fù)合微生態(tài)制劑的最適添加劑量之間存在較大差異，陳勇等[8]研究表明復(fù)合微生態(tài)制劑添加劑量為1 000 mg/kg時效果較好，楊紅萍等[12]研究表明2 000 mg/kg添加劑量的復(fù)合微生態(tài)制劑作用效果最為顯著，而本研究結(jié)果表明復(fù)合微生態(tài)制劑400 mg/kg添加劑量的作用效果最佳，分析不同研究結(jié)果產(chǎn)生的原因可能為：不同研究中的復(fù)合微生態(tài)制劑的主要成份、活菌數(shù)量、仔豬品種與飼養(yǎng)條件等方面均存在差異，故對于復(fù)合微生態(tài)制劑的選擇應(yīng)根據(jù)復(fù)合微生態(tài)制劑主要成份與活菌數(shù)量、自身豬場養(yǎng)殖條件等合理確定最適添加劑量。

3.2 復(fù)合微生態(tài)制劑對斷奶仔豬盲腸和糞便微生物的影響

正常情況下動物腸道內(nèi)各種微生物菌群處于一種微生態(tài)平衡中，仔豬在斷奶前后由于飲食、飼養(yǎng)等環(huán)境的急劇改變，極易誘發(fā)由斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的腸道微生物菌落失衡，導(dǎo)致大腸桿菌等有害菌的數(shù)量增加，乳酸桿菌等有益菌的數(shù)量減少，導(dǎo)致仔豬的腸道功能迅速降低，極易誘發(fā)各種疾病[13-14]。本研究中，復(fù)合微生態(tài)制劑均能夠提高斷奶仔豬盲腸和糞便中乳酸桿菌等有益菌的數(shù)量，降低斷奶仔豬盲腸和糞便中大腸桿菌等有害菌的數(shù)量，表明復(fù)合微生態(tài)制劑能夠改善斷奶仔豬的腸道微生物菌群平衡。分析該試驗結(jié)果產(chǎn)生的原因，可能為復(fù)合微生態(tài)制劑中的活菌以及代謝產(chǎn)物進(jìn)入仔豬腸道后能夠通過競爭腸粘膜定植位點、降低腸道環(huán)境pH等方式扶持乳酸桿菌等有益菌的生長繁殖，抑制大腸桿菌等有害菌的生長，調(diào)節(jié)和優(yōu)化腸道的微生物菌群平衡。同時，本研究中結(jié)果還顯示復(fù)合微生態(tài)制劑400 mg/kg添加劑量的作用效果明顯好于100 mg/kg、200 mg/kg、800 mg/kg添加劑量的作用效果，分析該試驗結(jié)果產(chǎn)生的原因，可能為斷奶仔豬腸道對復(fù)合微生態(tài)制劑中的活菌以及代謝產(chǎn)物的吸收利用具有一個閾值，超過該閾值后的復(fù)合微生態(tài)制劑中的活菌以及代謝產(chǎn)物無法被斷奶仔豬吸收利用，故對于本研究中的復(fù)合微生態(tài)制劑而言，臨床中添加400 mg/kg即可。

3.3 復(fù)合微生態(tài)制劑對斷奶仔豬免疫功能的影響

脾臟是動物最大的免疫器官，是產(chǎn)生抗體、補(bǔ)體等免疫物質(zhì)的最主要器官；肝臟是最主要的免疫器官，是解毒和清除病原菌的重要器官[15]。本研究選擇脾臟和肝臟免疫器官指數(shù)，IgG、IgA、IgM免疫球蛋白含量，IL-2、IL-4、IFN-γ細(xì)胞因子含量作為檢測指標(biāo)分別從免疫器官功能、體液免疫功能、細(xì)胞免疫功能3個方向全面研究探討復(fù)合微生態(tài)制劑對斷奶仔豬免疫功能的影響。研究結(jié)果表明，復(fù)合微生態(tài)制劑在提高斷奶仔豬免疫器官功能，提高斷奶仔豬體液免疫功能，提高斷奶仔豬細(xì)胞免疫功能等方面均表現(xiàn)出了良好的作用效果，以添加劑量為400 mg/kg時作用效果最好。

4 結(jié) 論

在斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中添加100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg、800 mg/kg復(fù)合微生態(tài)制劑均能夠提高斷奶仔豬的生長性能，降低腹瀉率，改善腸道微生物菌群平衡，提高斷奶仔豬的免疫功能，以添加400 mg/kg效果最好。