徐小春，陳文娟，趙 瑞，馬 森

(1.北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450002)

灘羊肌肉大理石紋的形成主要是由于肌內(nèi)脂肪沉積，并與肌肉嫩度、多汁性和風(fēng)味等肉質(zhì)相關(guān)指標(biāo)緊密相關(guān)[1]。 存在肌內(nèi)脂肪中的一些脂類及脂溶性物質(zhì)是肉質(zhì)風(fēng)味物質(zhì)的前體物，也是肉質(zhì)風(fēng)味形成的重要基礎(chǔ)[2]。因此，以灘羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞為模型，研究前體脂肪細(xì)胞成脂分化過程的調(diào)控機(jī)制，探討肌內(nèi)脂肪的生成規(guī)律對改善肉質(zhì)、提高羊肉的食用價值具有重要意義。前體脂肪細(xì)胞具有增殖和分化的特性，在其分化過程中受到一系列轉(zhuǎn)錄因子及酶(過氧化物酶增殖體激活受體γ(PPARγ)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)、脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)、脂肪酸合成酶(FAS)、脂蛋白脂酶(LPL)等)的調(diào)控作用[3-5]。前體脂肪細(xì)胞在分化的過程中形態(tài)發(fā)生變化，同時相關(guān)基因表達(dá)也發(fā)生變化，最終分化為成熟脂肪細(xì)胞，脂質(zhì)在胞質(zhì)內(nèi)積累[6]。相較于脂肪組織來源的前體脂肪細(xì)胞，肌內(nèi)來源的細(xì)胞更適宜作為細(xì)胞模型模擬體內(nèi)肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞增殖和分化的過程及了解與該過程相關(guān)的調(diào)控機(jī)制[7-8]。因此，建立灘羊肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系是解析該細(xì)胞增殖和分化相關(guān)調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)性工作，也可以為通過營養(yǎng)和遺傳等途徑調(diào)節(jié)肌內(nèi)脂肪沉積提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與主要試劑

選取10日齡健康無病的灘羊1只(寧夏鹽池縣某專業(yè)合作社提供)，頸部處死后無菌條件下采取背最長肌組織，放于添加雙抗的(青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL)無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中備用。0.2%Ⅱ型膠原酶(Gibco，美國)，胎牛血清(FBS)(Gibco，美國)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma, 美國)，0.25%胰蛋白酶(Gibco，美國)，青鏈霉素(Gibco，美國)，OriCell SD大鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(Cyagen Biosciences，中國)，油紅O染料(Sigma，美國)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(Sigma, 美國)，RNA提取試劑盒(Takara，日本)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)，實時熒光定量qPCR Mix(Takara，日本)等。

1.2 灘羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)

用75%的酒精消毒采樣部位，采取背最長肌組織，放置含有雙抗的PBS溶液沖洗5次。在無菌培養(yǎng)皿中剔除肉眼可見的血管和結(jié)締組織，將組織剪成約1.0 mm左右的組織塊，加入0.2%Ⅱ型膠原酶置于37 ℃水浴鍋中消化1.5 h，每5 min振蕩1次，消化完全后加入等體積的完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+10% FBS+100 IU/mL青鏈霉素)終止消化。消化液依次過200目、400目孔徑的細(xì)胞篩，濾液1 500 r/min離心10 min，棄上清。完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 h之后換液，貼壁細(xì)胞即為肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，之后每隔1 d換液1次。

1.3 灘羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞傳代培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)匯合度為80%左右時，PBS洗3次，用0.25%胰蛋白酶消化3 min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮且少量飄起，此時加入胰蛋白酶2倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化。1 000 r/min離心10 min，棄上清，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1∶2或1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，每隔2 d換液1次，直到細(xì)胞培養(yǎng)匯合度為90%鋪滿整個培養(yǎng)皿。

1.4 灘羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長曲線的測定

原代細(xì)胞培養(yǎng)匯合度為80%左右，胰蛋白酶消化細(xì)胞后收集并重懸，接種至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔密度為1.0×105個/mL，隨機(jī)分為7組，每組3孔。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT)法測定細(xì)胞活力：細(xì)胞培養(yǎng)皿每孔加入20 μL MTT溶液，放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，PBS洗去MTT溶液，加入150 μL DMSO，測定490 nm波長處的OD值。每隔48 h進(jìn)行測定一次，用每孔吸光度值的平均值繪制曲線，即為原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的生長曲線。

1.5 灘羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化

第二代細(xì)胞匯合至80%時進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，加入OriCell SD大鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液72 h，換以O(shè)riCell SD大鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液培養(yǎng)24 h，A液和B液交替作用2次(8 d)。

1.6 油紅O染色鑒定及脂肪含量的測定

肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成為成熟脂肪細(xì)胞后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，油紅O染色60 min，PBS洗2次，倒置顯微鏡下觀察。之后60%異丙醇進(jìn)行萃取，測定萃取液在510 nm波長處的OD值。

1.7 引物設(shè)計及合成

參照GenBank中PPARγ、C/EBPα、FAS、aP2、LPL基因序列，用Primer Premier 5.0及NCBI設(shè)計qRT-PCR特異性引物，引物相關(guān)信息見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.8 實時熒光定量PCR

分別在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)第0、2、4、6、8天提取總RNA，利用PrimeScript○RRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，qRT-PCR方法檢測脂肪細(xì)胞成脂分化關(guān)鍵基因mRNA的相對表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系20 μL：其中Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，用ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，39個循環(huán)；65～95 ℃熔解曲線5 s。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Graph Pad Prism 5統(tǒng)計分析軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，采用Graph Pad Prism 5軟件作圖，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 前體脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

采用差速貼壁法處理細(xì)胞，得到純化的灘羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞。細(xì)胞分離后4 h開始貼壁(圖1A)；2 d后細(xì)胞形態(tài)均一，大部分呈現(xiàn)梭形(圖1B)；6 d后細(xì)胞生長旺盛呈現(xiàn)長梭形(圖1C)；培養(yǎng)至8 d時，細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形且平行排列緊密(圖1D)。培養(yǎng)匯合至90%時傳代培養(yǎng)，傳代第2天、4 d細(xì)胞呈現(xiàn)梭形及不規(guī)則三角形(圖2A、圖2B)；傳代培養(yǎng)至第6 d，細(xì)胞生長旺盛且呈現(xiàn)長梭形(圖2C)；傳代培養(yǎng)8 d后，細(xì)胞平行排列緊密(圖2D)，與原代培養(yǎng)第8天形態(tài)基本一致。

2.2 誘導(dǎo)分化及油紅O染色鑒定

灘羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化2 d后，細(xì)胞由梭形逐漸變?yōu)闄E圓形(圖3A)；誘導(dǎo)分化4 d時，細(xì)胞的成脂分化趨勢較為明顯(圖3B)；誘導(dǎo)分化6 d，出現(xiàn)少量的脂滴(圖3C)；誘導(dǎo)培養(yǎng)8 d，脂滴出現(xiàn)明顯(圖3D)。誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色鑒定，細(xì)胞內(nèi)脂滴被油紅O著色而成紅色，說明肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞已經(jīng)被成功誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞(圖3E和圖3F)。

2.3 生長曲線

肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長曲線形狀近似“S”型(圖4)，細(xì)胞增殖過程分別為潛伏期、指數(shù)生長期和平臺期，符合一般細(xì)胞的生長規(guī)律。在細(xì)胞接種后0～2 d生長緩慢，2～6 d 迅速增殖，為指數(shù)生長期，8 d后進(jìn)入平臺期(圖4)。

2.4 脂肪含量測定

采用油紅O染色法對肌內(nèi)前體細(xì)胞內(nèi)脂肪含量進(jìn)行檢測，由圖5可知，細(xì)胞誘導(dǎo)第2 d出現(xiàn)脂滴，隨誘導(dǎo)時間的增長脂肪含量逐漸增加，誘導(dǎo)第12 d時細(xì)胞內(nèi)脂肪含量最高(圖5)。

2.5 脂肪相關(guān)基因表達(dá)檢測

由圖6可見，在肌內(nèi)脂肪前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中，PPARγ在誘導(dǎo)第4 d和6 d的表達(dá)水平顯著高于誘導(dǎo)0 d、2 d、8 d 的表達(dá)水平(P<0.05)；C/EBPα在誘導(dǎo)分化4 d的表達(dá)水平最高，顯著高于0 d、2 d、6 d、8 d的表達(dá)水平(P<0.05)；FAS基因在誘導(dǎo)6 d的表達(dá)水平顯著高于誘導(dǎo)0 d、2 d、4 d、8 d 的表達(dá)水平(P<0.05)；aP2基因在誘導(dǎo)分化4 d的表達(dá)水平最高，顯著高于0 d、2 d、6 d、8 d的表達(dá)水平(P<0.05)；LPL基因在誘導(dǎo)4 d和6 d的表達(dá)水平顯著高于0 d、2 d、8 d的表達(dá)水平(P<0.05)。隨著分化時間增長，PPARγ先升高后降低，F(xiàn)AS先降低后升高再降低，C/EBPα和LPL先升高后降低，aP2先升高后降低再升高。

3 討 論

3.1 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)

酶消化法和組織塊培養(yǎng)法是從特定組織分離培養(yǎng)細(xì)胞的常用方法[9-10]，本研究采用Ⅱ型膠原酶消化分離獲得了呈梭形及不規(guī)則三角形的前體脂肪細(xì)胞，其成分均一、增殖和分化能力較強(qiáng)。與組織塊培養(yǎng)法相比，Ⅱ型膠原酶消化法在5～7 d內(nèi)細(xì)胞可生長至至80%匯合度，短期內(nèi)即可獲得大量純度較高的細(xì)胞。但酶消化法也容易混雜其他種類細(xì)胞，細(xì)胞原代培養(yǎng)的污染率較高，該缺點(diǎn)可經(jīng)過差速貼壁及傳代對細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步純化而彌補(bǔ)。本研究根據(jù)山羊[11]、牛[12]、豬[13]、兔[14]的肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)條件，利用酶消化法分離得到的肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞貼壁性能良好，貼壁率可達(dá)到50%左右，24 h后可達(dá)到80%左右。該結(jié)果表明本研究分離的灘羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長狀態(tài)良好，能夠在體外大量增殖。

3.2 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長曲線

細(xì)胞生長狀態(tài)通常用生長曲線來觀察，生長曲線也是評價細(xì)胞活力的重要指標(biāo)之一。一般細(xì)胞傳代貼壁后，經(jīng)過潛伏期，隨即進(jìn)入指數(shù)生長期，此時細(xì)胞大量分裂。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和便停止生長，隨即進(jìn)入平臺期，最后退化衰亡進(jìn)入抑制期。細(xì)胞的生長過程包括：潛伏期、指數(shù)生長期、平臺期和抑制期。細(xì)胞接種的密度直接影響細(xì)胞潛伏期的長短，接種密度過小，細(xì)胞生長緩慢，則潛伏期長；細(xì)胞密度過大，則潛伏期短，導(dǎo)致細(xì)胞過早進(jìn)入抑制期[15]。為了準(zhǔn)確描述細(xì)胞數(shù)量在整個生長過程中的動態(tài)變化，本研究用96孔板以1.0×105個/mL密度接種細(xì)胞，接種后24 h換液，細(xì)胞貼壁性能良好，細(xì)胞經(jīng)歷2 d的潛伏期，第3天開始迅速增殖，第6天進(jìn)入平臺期，第8 d細(xì)胞密度持續(xù)增大，代謝產(chǎn)物增加，導(dǎo)致部分細(xì)胞脫落死亡，此時進(jìn)入細(xì)胞衰亡期，生長曲線近似“S”型，符合細(xì)胞的正常生長規(guī)律。

3.3 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定

前體脂肪細(xì)胞無論在體內(nèi)還是體外都具有自發(fā)成脂的潛能，過度融合能夠促進(jìn)細(xì)胞的成脂分化[16-17]。前體脂肪細(xì)胞的成脂分化過程受到不同調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[18-19]。不同的激素和生長因子與前體脂肪細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合后，直接或間接通過不同的信號通路來調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化[20]。細(xì)胞內(nèi)甘油三酯與油紅O特異性結(jié)合使脂滴染色變成橘紅色，因此可作為體外培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞的鑒定及分化狀態(tài)的分析[11]。本研究結(jié)果表明，傳代培養(yǎng)細(xì)胞在匯合至80%后用成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)小脂滴，油紅O染色后呈紅色，說明分離得到的細(xì)胞為肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞。細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后開始有小脂滴出現(xiàn)，4 d后小脂滴迅速聚集，6 d后小脂滴大量出現(xiàn)，這與脂肪在細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)學(xué)變化完全一致。

3.4 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞成脂分化關(guān)鍵基因時序表達(dá)

前體脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞受到多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，尤其受到PPARγ、C/EBPα及其家族轉(zhuǎn)錄因子的密切調(diào)控[21]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞通過下調(diào)PPARγ基因的表達(dá)，抑制其向成熟脂肪細(xì)胞分化[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)第6天時表達(dá)水平最高，之后逐漸下降。在江香豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞中，PPARγmRNA表達(dá)水平在整個分化早期時均呈現(xiàn)較高表達(dá)，之后顯著降低，此研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，但其表達(dá)水平在第3 d時最高[23]。上述結(jié)果表明，肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后期PPARγ的表達(dá)可能受到抑制。LPL是甘油三酯(Triglyceride，TG)代謝中的關(guān)鍵酶，對脂肪沉積起重要的調(diào)控作用。改變LPL表達(dá)水平可能會影響全身代謝和神經(jīng)元脂質(zhì)生物學(xué)功能[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPL在肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞分化早期表達(dá)差異顯著，中期差異不顯著，但出現(xiàn)大幅度上調(diào)，后期有所下降。此研究結(jié)果與孫成娟等[23]研究結(jié)果相反，這可能是由品種間的遺傳差異造成的。FAS在脂肪酸的合成中發(fā)揮重要作用，是一種脂肪生成酶。在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中，青蒿琥酯通過降低C/EBPα、PPARγ、FAS、perilipin A和STAT-3的表達(dá)和磷酸化水平抑制脂肪生成[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS在肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的第6天呈現(xiàn)較高表達(dá)，顯著高于其他時期的表達(dá)水平，這與FAS江香豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律結(jié)果一致。干擾Smad3后發(fā)現(xiàn)顯著促進(jìn)了山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中脂滴的聚集，并且脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因C/EBPα、LPL、aP2的表達(dá)水平顯著上升[26]。本研究結(jié)果表明，C/EBPα和aP2在前體脂肪細(xì)胞分化第4天表達(dá)最高，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與PPARγ和LPL的表達(dá)規(guī)律一致。

4 結(jié) 論

本研究通過膠原酶消化法分離細(xì)胞，利用差速貼壁法對細(xì)胞進(jìn)行純化，成功構(gòu)建了灘羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)體系。所分離的細(xì)胞經(jīng)過傳代后純度較高，增殖和分化能力較強(qiáng)。誘導(dǎo)分化通過油紅O鑒定所分離的細(xì)胞為肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，成脂關(guān)鍵基因PPARγ、C/EBPα、FAS、aP2、LPL在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的分化中、后期均呈現(xiàn)較高水平表達(dá)，這為后續(xù)體外研究灘羊肌內(nèi)脂肪代謝以及沉積機(jī)理奠定了良好的基礎(chǔ)，對進(jìn)一步研究灘羊脂肪沉積機(jī)制具有重要意義。