杜海洋，楊光勇，張庚鑫，田維毅，王文佳，王 平，何光志

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽550025)

腸道菌群(Gut microbiota)作為腸道內(nèi)的正常微生物群，不僅對腸道的生理功能起重要作用，而且對宿主的生理、代謝、免疫、消化和營養(yǎng)的攝取功能也至關(guān)重要[1]。腸道菌群被人們稱為人體的“器官”，宿主與腸道菌群間的穩(wěn)定平衡對維系人體的健康發(fā)揮著不可或缺的作用，目前已成為了人們廣泛的關(guān)注的研究熱點(diǎn)[2]。近年來，高通量測序技術(shù)的應(yīng)用推進(jìn)了腸道菌群的研究進(jìn)程，使得腸道菌群與宿主生理病理的關(guān)聯(lián)得到更加深入的研究。

抗生素(Antibiotic)的問世提高了細(xì)菌感染性疾病的治愈率，但由于其濫用不僅破壞了腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，還導(dǎo)致了耐藥菌的產(chǎn)生[3]；同時(shí)也有研究表明抗生素在非感染性疾病中也有治療價(jià)值[4]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，抗生素破壞菌群穩(wěn)態(tài)并能夠抑制有益菌的豐度[5]，但仍缺乏抗生素對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響較為全面的認(rèn)知。

借助高通量測序這項(xiàng)技術(shù)我們能夠更加全面的分析抗生素對菌群的影響。故本文通過16S rRNA測序技術(shù)分析臨床一線類抗生素氨芐西林鈉對SD大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，明確抗生素腸道菌群的作用及為合理的臨床應(yīng)用抗生素提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與主要試劑

SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體重(200±20)g，購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，許可證書：SCXK(軍)2012-0011; 氨芐西林鈉(批號：A6180,北京博奧拓達(dá)科技有限公司)； DNA抽提試劑盒(批號：DP328-2，天根北京生化科技有限公司)；引物合成及DNA測序委托上海百趣公司完成。

1.2 主要儀器

-80 ℃冰箱(型號：88400，美國Thermo科技有限公司)；Illumia高通量測序儀(型號：HiSeq ，美國Illumina公司)。

1.3 動物分組與給藥

將40只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4組：空白組(M0)10只、抗生素1周(M1)10只、抗生素2周(M2)10只，抗生素3周(M3)10只?？股亟M采用氨芐西林鈉進(jìn)行灌胃服藥，1.0 mL/次，2次/d(用藥劑量由成人用量換算而來，最終濃度為0.031 g/mL)；空白組除采用生理鹽水灌胃外，其他方法均與抗生素組一致。

1.4 樣品采集

灌胃給藥后，分別在1 d、7 d、14 d、21 d處死M0、M1、M2、M3組的10只SD大鼠。分別無菌操作收集全部腸道內(nèi)容物于1.5 mL的EP管中，并迅速放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.5 腸道菌群16S rRNA的V3-V4區(qū)擴(kuò)增及測序

從每組10個(gè)樣本中隨機(jī)取3個(gè)大鼠腸道內(nèi)容物采用Tiangen總DNA抽提試劑盒提取DNA并作為模板；采用16S rRNA的V3-V4區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送往上海百趣公司進(jìn)行測序。PCR上游引物338F序列：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'，下游引物806R序列：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。

1.6 數(shù)據(jù)分析

對測序結(jié)果雙端合并后，用Vsearch(2.14.1)切除引物及去冗余[6]。數(shù)據(jù)用Usearch10的unoise3進(jìn)行Amplicon Sequence Variants(ASV)非聚類去噪[7]，生成Operational Taxonomic Unit(OTU)，基于Silva數(shù)據(jù)庫去除嵌合體，生成OTU表，基于rdp數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋(置信值>0.6)。用Alpha、Beta和Linear discriminant analysis Effect Size(LEfSe)方法對腸道菌群進(jìn)行多樣性及物種分類的差異性進(jìn)行分析[8]；用Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States 2(PICRUSt2)進(jìn)行功能預(yù)測分析[9]。

2 結(jié) 果

2.1 測序結(jié)果

經(jīng)過雙端合并后去除質(zhì)量錯(cuò)誤值大于0.01，并去冗余后共得到4 960條特征序列。經(jīng)過silva數(shù)據(jù)庫去除嵌合體得到833條代表性序列，其序列長度最小值為387 bp，最大433 bp，平均416 bp，基本與16S rDNA v3-v4區(qū)的長度相符合。

2.2 Alpha多樣性

經(jīng)過抗生素處理的SD大鼠的Chao1指數(shù)與對照組相比顯著升高(P<0.05)，提示抗生素能提高細(xì)菌物種的豐富度；而抗生素各組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖1A。Alpha稀釋曲線出現(xiàn)平臺期，說明本次測序深度充分，見圖1B。

2.3 Beta多樣性

采用PCoA(principal co-ordinates analysis,主坐標(biāo)軸分析)和CCA(Constrained PCoA，限制性主坐標(biāo)軸分析)方法分析bray-curtis數(shù)據(jù)，結(jié)果表明各組間菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異(P<0.01)，見圖2。

2.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

通過腸道菌群結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明正常的SD大鼠的厚壁菌門(Firmicutes)占總菌群比例的的97%，抗生素使用后厚壁菌門的比例下降，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度上升，見圖3。在抗生素使用超過一周后，腸道厚壁菌門的豐度出現(xiàn)逐漸上升的趨勢，變形菌門和放線菌門的豐度出現(xiàn)下降的趨勢，見圖4。

2.5 組間Lefse差異分析

通過Lefse(設(shè)置LAD值>2)分析找到各組間具有顯著差異的細(xì)菌類群。在屬水平下，M0組與M1有16種物種表現(xiàn)出顯著差異，真桿菌屬(Eubacterium)、未定的毛螺菌屬(Lachnospiracea_incertae_sedis)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、布勞特氏菌(Blautia)、腸球菌屬(Enterococcus)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、志賀菌(Escherichia_Shigella)，鏈球菌屬(Streptococcus)和羅斯氏菌屬(Rothia)在M1組富集 ；乳桿菌屬 (Lactobacillus)，Romboutsia、Clostridium_sensu_stricto和Turicibacter在M0組富集，見圖5A。

M0與M2有14種物種表現(xiàn)出顯著差異，腸球菌屬(Enterococcus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、摩根菌屬(Morganella)、Clostridium_XlVa、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis、Terrisporobacter、Escherichia_Shigella和布勞特氏菌(Blautia)在M2中富集；鏈球菌屬(Sireptococcus)、Clostridium_sensu_stricto、Clostridiaceae_1、羅斯氏菌屬(Rothia)、Turicibacter和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)在M0中富集，見圖5B。

M0與M3有10種物種表現(xiàn)出顯著差異，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、布勞特氏菌(Blautia)、Escherichia_Shigella、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、Clostridium_XlVa、摩根菌屬(Morganella)和Terrisporobacter在M3中富集；羅斯氏菌屬(Rothia)和嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)在M0中富集，見圖5C。

2.6 功能預(yù)測

使用PICRUSt2軟件對OTU進(jìn)行功能預(yù)測，其結(jié)果通過STAMP 軟件分析，并進(jìn)行Welch's t檢驗(yàn)，經(jīng)過FDR校正得出結(jié)果，M3與M0組的代謝通路無差異。 M1組腸道菌的N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰神經(jīng)氨酸降解的超途徑(superpathway of N-acetylglucosamine, N-acetylmannosamine and N-acetylneuraminate degradation)、尿素循環(huán)(urea cycle)通路顯著下降； Menaquinol-7生物合成的超途徑(superpathway of menaquinol-7 biosynthesis)，Menaquinol-12生物合成的超途徑(superpathway of menaquinol-12 biosynthesis)，己糖醛酸和己糖酸酯降解的超途徑(GALACT-GLUCUROCAT-PWY)通路顯著上升。M2組腸道菌甘油降解為1,3-丙二醇的超級途徑(superpathway of glycerol degradation to 1,3-propanedio)通路顯著降低，甲?；?四氫葉酸的生物合成(N10-formyl-tetrahydrofolate biosynthesis)，甲苯降解III(好氧)(通過對甲酚)(toluene degradation III (aerobic) (via p-cresol))通路顯著上升，見圖6。

3 討 論

抗生素在治療細(xì)菌感染時(shí)會引起的腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，一方面會使得條致病菌的定植而引起疾病，另一方面也會增加某類益生菌的豐度[10]。本研究采用臨床β-內(nèi)酰胺類的抗生素氨芐西林鈉，探討抗生素對腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的影響，旨在為臨床合理應(yīng)用抗生素提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

厚壁菌門是健康宿主的共有的優(yōu)勢菌群[11]，而抗生素的使用極大降低了厚壁菌門的豐度，本研究得出相同的結(jié)果[12]。在抗生素使用1周以后SD大鼠腸道乳桿菌屬和Romboutsia等厚壁菌門的物種豐度呈現(xiàn)上升趨勢。乳桿菌屬是存在于腸道內(nèi)的有益菌，可以協(xié)助消化為機(jī)體提供營養(yǎng)、助治療腹瀉和皮膚病[13]；乳酸菌在腸道菌群中形成的生物膜，能夠使該菌在惡略的環(huán)境中持久存在并維持足夠的豐度，并抑制病原菌的定植[14]。

據(jù)報(bào)道Romboutsia可作為宿主腸息肉的特異性生物標(biāo)記物[15]，然而抗生素的使用與結(jié)腸息肉的患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[16]，這些結(jié)果提示抗生素有可能是通過降低腸道內(nèi)Romboutsia豐度增加了結(jié)腸息肉患病的風(fēng)險(xiǎn)。

近年來發(fā)現(xiàn),兒童青少年是抑郁癥患病高風(fēng)險(xiǎn)人群,除了社會及家庭環(huán)境的影響，有報(bào)道顯示抗生素的使用能增加兒童患抑郁癥的風(fēng)險(xiǎn)[17]。毛螺菌屬和布勞特氏菌屬在抑郁癥患者中屬于特異性菌屬，可作為生物特異性標(biāo)志物[18]。本次實(shí)驗(yàn)抗生素組中上述兩種細(xì)菌的富集，進(jìn)一步肯定了抗生素與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性。

Shen等[19]研究表明，布勞特氏菌屬的豐度在非酒精性脂肪肝患者具有更高的豐度。在本研究中使用抗生素增加了勞特氏菌屬的豐度。綜合這些研究結(jié)果考慮，對于非酒精性脂肪肝患者在抗生素時(shí)應(yīng)該慎重考慮，以免加重病情。

帕金森病發(fā)展的形勢十分嚴(yán)峻，而其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，因此挖掘出帕金森病的生物學(xué)標(biāo)志物將會給其診斷及治療帶來顯著意義，近年有研究發(fā)現(xiàn)，帕金森病可能起源于腸道[20]。畢早安研究發(fā)現(xiàn)Terrisporobacter在帕金森病人的腸道中豐度明顯低于正常組[21]。本次實(shí)驗(yàn)中抗生素氨芐西林鈉能夠提高Terrisporobacter的豐度。提示氨芐西林鈉有可能通過改善腸道Terrisporobacter數(shù)量來治療帕金森病。

通過PICRUSt2預(yù)測腸道菌群功能，結(jié)果顯示氨芐西林鈉能夠提高甲酰四氫葉酸的合成以及降低尿素的循環(huán)。目前，甲酰四氫葉酸已作為白血病化療過程中的一種生物調(diào)節(jié)劑[22]，提示抗生素有望成為治療白血病的輔助藥物。尿素循環(huán)障礙可導(dǎo)致高氨血癥[23]，故建議高氨血癥患者應(yīng)禁用抗生素氨芐西林鈉。

綜上所述，抗生素使用一周后顯著改變了腸道菌群的結(jié)構(gòu)，但隨著用藥時(shí)間的增長，對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響逐漸減弱；抗生素在治療細(xì)菌感染性疾病時(shí)增加了結(jié)腸息肉、抑郁癥和非酒精性脂肪肝的的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但對白血病和帕金森疾病可能具有一定潛在的治療價(jià)值。這些結(jié)論與中醫(yī)學(xué)上的“異病同治”的理論不謀而合。