程 娜，牛元力，李志勛，龍 罡，秦建鵬，邱丙姍，趙桂英*，李 祥*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南東恒經(jīng)貿(mào)集團豬育種有限公司，云南 曲靖 655000)

大河烏豬是大河豬與杜洛克豬雜交選育而成的培育品種。其具有肉質(zhì)細膩、肌間脂肪含量高等特性[1]。但其瘦肉率與生長速度較大白豬、杜洛克豬和長白豬等外來豬種仍有較大差距。豬眼肌面積大小與豬的胴體瘦肉率有高度的相關性，是提高豬生產(chǎn)性能的重要指標之一[2]。

肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)屬于轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF-β)超家族成員。MSTN主要分布在骨骼肌中，對骨骼肌的生長和分化有重要的調(diào)控作用，可能對瘦素的產(chǎn)生以及分泌有影響[3]。Magdalena等[4]研究發(fā)現(xiàn)在卡緬涅茨羊和波美拉尼亞羊中MSTN基因均存在多個SNP位點，并且某些多態(tài)性位點可以作為生長性狀的遺傳標記。Kambadur R等[5]在對比利時藍牛的研究中發(fā)現(xiàn)，MSTN基因編碼區(qū)11個堿基的插入，是比利時藍牛雙肌臀產(chǎn)生的重要原因。最早Sonstegard等[6]通過將MSTN基因定位于豬的第15號染色體上，構建了豬第15號染色體的連鎖圖譜。豬MSTN基因由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，李紹華等[7]采用PCR-SSCP技術研究豬MSTN基因時發(fā)現(xiàn)第2外顯子和第3外顯子均存在多態(tài)性。MSTN基因?qū)κ萑饴始凹∪馍L有重要影響。本試驗通過對大河烏豬MSTN基因第3外顯子多態(tài)性的研究，找出與眼肌面積關聯(lián)分析的高產(chǎn)基因型，為大河烏豬瘦肉率提供分子標記位點，加快大河烏豬選育進程。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

本試驗于2019年在云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院318豬生產(chǎn)研究室進行。

1.2 試驗材料

試驗選用飼養(yǎng)管理、環(huán)境條件一致的不同家系，同胎次，產(chǎn)仔日期相近，體重均達100 kg左右的育肥大河烏豬79頭。采集其活體耳組織，并將采集的耳組織放入1.5 mL的Eppendorf試管中，加入75%的乙醇，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

將采集耳組織的79頭大河烏豬屠宰，測定其眼肌面積，測定部位為胸腰椎結(jié)合處，測定方法為眼肌的長、高，并做好相關記錄，眼肌面積=長×高×0.7。

1.3 耳組織中DNA的提取

提取耳組織中DNA的方法采用常規(guī)酚/氯仿法，具體參照《分子克隆實驗指南》[8]。

1.4 DNA原液的檢測

檢測時制備1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，取4 μL待檢測的DNA原液和1 μL 10x Loading buffer混合進行點樣，第一孔加入DNA Marker(DL 2000)5 μL作為參照，120 V穩(wěn)壓電泳20 min，電泳完畢后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察有無DNA條帶及亮度情況，以檢測DNA是否提取成功，將提取成功的DNA原液儲于4 ℃保存待用。

1.5 MSTN基因第3外顯子PCR引物設計

根據(jù)NCBI(美國國立生物技術信息中心)公布的豬MSTN基因序列(GENE BANK ID：EF490990)，選取一段包含第3外顯子的序列，長度為439 bp。使用NCBI blast功能查找基因突變位點，發(fā)現(xiàn)MSTN基因第3外顯子有兩個突變位點：①第3外顯子63 bp處C-T的突變；②第3外顯子92 bp處G-A的突變。使用DNA CLUB軟件查找酶切位點發(fā)現(xiàn)突變的兩個點都位于TaqI酶識別的限制性位點(TCGA)。使用Premier 5.0軟件設計大河烏豬MSTN基因第3外顯子的引物，上游引物為5'-AGGGTAGGAAAGTGATTCAGGAT-3'，下游引物為5'-GAGCACCCACAGCGATCTAC-3'，將設計好的引物序列送往擎科生物技術有限公司合成。

1.6 MSTN基因第3外顯子PCR反應體系

創(chuàng)建25 μL 的PCR反應體系，其中1.1×T3 Super PCR Mix 21.5 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、DNA原液(模板)1.5 μL。98℃預變性2.5 min，98 ℃變性10 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸6 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸2 min，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測。將符合下一步實驗要求的樣品放置于4 ℃保存。

1.7 MSTN基因第3外顯子測序

將MSTN第3外顯子DNA樣品送往北京擎科生物科技有限公司昆明分公司進行測序。利用DNAMAN 進行序列比對，在NCBI中下載大猩猩(DQ927204)、黑猩猩(DQ927196)、駱駝(KJ847844)、馬(KC708233)、穴兔(GU244575)、綿羊(KT832792)、山羊(EF423557)的基因序列，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 MSTN基因第3外顯子PCR-TaqI-RFLP的反應體系

創(chuàng)建25 μL 的酶切反應體系，其中PCR產(chǎn)物19 μL、限制性內(nèi)切酶TaqI1 μL 10×LoadingBuffer 2 μL、ddH2O 3 μL。將配置好的反應體系置于37 ℃的水浴鍋6 min，反應終止后取出。制備3%的瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳完畢后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察檢測到兩種基因型。

1.9 眼肌面積計算

使用Excel表格，根據(jù)大河烏豬基因型，整理眼肌面積和屠宰體重的原始數(shù)據(jù)，用SAS9.0軟件的GLM(General Linear Model))過程，配合下列回歸方程進行協(xié)方差分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤( X±SE)。眼肌面積(y)與屠宰體重(x)間直線回歸方程：y=14.98+0.16x。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

大河烏豬耳樣中提取的DNA原液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，結(jié)果顯示基因組DNA條帶清晰明亮、整齊沒有拖尾現(xiàn)象，濃度均勻、質(zhì)量較好，符合PCR擴增試驗要求(圖1)。

2.2 MSTN基因第3外顯子PCR擴增結(jié)果

由圖2可見，大河烏豬MSTN基因第3外顯子的PCR產(chǎn)物均為439 bp的單一條帶，無非特異性擴增，條帶清晰、明亮，符合所要擴增的目的片段大小，可以進行后續(xù)的酶切試驗。

2.3 MSTN基因第3外顯子PCR-TaqI-RFLP反應結(jié)果

由圖3可見，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶TaqI酶切后呈現(xiàn)多態(tài)性，分為2種基因型，一種是含有439、315、287、152、124、28 bp六個條帶的CTGA基因型，另一種是含有287、152、124、28 bp四個條帶的CTGG基因型。因28 bp片段長度過小，無法觀測到，但不影響基因型的判斷。

2.4 大河烏豬MSTN基因第3外顯子基因型與眼肌面積關聯(lián)分析

由表1可見，CTGG基因型大河烏豬的眼肌面積比CTGA基因型大河烏豬大4.37 cm2，差異極顯著(P<0.01)。

表1 大河烏豬MSTN基因第3外顯子基因型與眼肌面積的關聯(lián)分析Table 1 Association analysis of exon 3 of MSTNgene and eye muscle area in Dahewu pig

2.5 大河烏豬MSTN基因的群體遺傳特性

在大河烏豬的兩個基因型中，CTGG的基因型頻率為0.1266，CTGA的基因型頻率為0.8734，其中G等位基因頻率為0.5633，A等位基因頻率為0.4367。MSTN基因在大河烏豬試驗群體中呈中度多態(tài)性(0.25

表2 大河烏豬MSTN基因的群體遺傳信息Table 2 Population genetic information of MSTN gene in Dahewu pig

2.6 序列比對結(jié)果

大河烏豬CTGA基因型與CTGG基因型序列比對結(jié)果如圖4所示，全部的大河烏豬63位堿基都發(fā)生了由C-T的突變，只有部分大河烏豬92位發(fā)生了由G-A的突變。

2.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖5知，大河烏豬與穴兔的親緣關系最近，駱駝與馬親緣關系最近，大猩猩與黑猩猩的親緣關系最近，但大猩猩、黑猩猩、駱駝和馬較大河烏豬親緣關系較遠。

3 討 論

MSTN基因在進化中相對保守，在其他動物的研究上已證實該基因失活會導致骨骼肌過度發(fā)育。胡師金等[9]檢測到綿羊MSTN基因第3外顯子G-A的突變位點，經(jīng)關聯(lián)分析表明，其突變?yōu)辄c與綿羊體重、管圍、背膘厚和眼肌面積顯著相關。劉桂芬等[10]在對渤海黑牛MSTN基因多態(tài)性位點檢測中發(fā)現(xiàn)第3外顯子G-A、C-T的兩個多態(tài)性位點，與體尺關聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)MSTN的作用除了在肌肉方面也可能在體尺方面有體現(xiàn)。Kambadur等[11]在皮埃蒙特牛中同樣發(fā)現(xiàn)了G-A的突變，而且突變個體均表現(xiàn)為“雙肌臀”特征。

通過對大河烏豬MSTN基因第3外顯子酶切結(jié)果和序列比對結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，全部大河烏豬63位堿基均發(fā)生了C-T的突變，部分大河烏豬92位堿基發(fā)生了G-A的突變。易恒潔等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在高坡豬MSTN基因第3外顯子中存在C-T的突變位點,但其為同義突變，并未引起氨基酸的改變。Jiang等[13]通過用PCR-SSCP法對豬整個MSTN基因進行多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)外顯子中C-T的突變位點，并且證實了這種突變在西方豬種少見在中國地方豬種多見，但對于是否與瘦肉率有關需進一步研究。李紹華等[7]以47頭“雙肌臀”大白豬為研究對象，在對其MSTN基因的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然第3外顯子的突變?yōu)槌聊蛔?，但可初步證實該突變可使豬具有更低的背膘及更高的瘦肉率，這可能與突變后該處產(chǎn)生的內(nèi)切酶位點有關。黃艷娜等[14]在對陸川豬MSTN基因的研究中發(fā)現(xiàn)存在G-A的突變，與本研究結(jié)果一致。但劉曉琴等[15]在對長白豬、大白豬、杜×長×大三元雜、通城豬、萊蕪豬、五指山豬六個豬種MSTN基因的克隆測序中，并未在MSTN基因外顯子區(qū)域檢測到突變位點，與本試驗結(jié)果不一致，這可能是由于豬種差異所導致的。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)豬和穴兔的親緣關系最近，楊光有等[16]研究發(fā)現(xiàn)豬疥螨與兔疥螨分離株同源性較高，Walton等[17]通過應用微衛(wèi)星標記對人和犬疥螨的同源性研究，發(fā)現(xiàn)疥螨的這些遺傳因子的突變是由特定的宿主決定的, 而并非地理環(huán)境所決定。由此證實，豬和兔的親緣關系較近，與本試驗結(jié)果一致。本研究系統(tǒng)進化分析顯示，駱駝和馬的MSTN基因第3外顯子序列差異性較小、黑猩猩和大猩猩MSTN基因第3外顯子親緣關系最近，與綿羊和山羊的差異性較大、親緣關系較遠，說明MSTN基因的突變可能與動物體尺大小有關。

大河烏豬63位堿基全部發(fā)生突變，但前人研究發(fā)現(xiàn)MSTN基因第3外顯子不發(fā)生突變[18-20]或部分發(fā)生突變[21]，這可能與奠基者效應有關[22-24]。通過對大河烏豬MSTN基因第3外顯子92位G-A堿基突變與眼肌面積關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，突變個體極顯著提高了大河烏豬的眼肌面積，與前人研究結(jié)果一致[25]。這說明大河烏豬MSTN基因第3外顯子92位的堿基突變是一個有價值的標記為點，值得在大河烏豬育種中應用于輔助標記選擇。因此，MSTN基因可以作為大河烏豬眼肌面積的候選基因?？梢赃x擇和保留更多的CTGG型大河烏豬，以提高其瘦肉率。

4 結(jié) 論

通過對大河烏豬MSTN基因第3外顯子多態(tài)性和眼肌面積的關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，MSTN基因可以作為大河烏豬眼肌面積的候選基因，為大河烏豬生產(chǎn)性能的提高奠定了基礎。