杜紅旗,房衛(wèi)平,婁治國,徐照學(xué),馮長松*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450008；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450008；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州 450008)

秋眠型苜蓿品種秋季生長緩慢、葉小和莖纖細(xì)匍匐，但具有較強(qiáng)的抗寒性和較高的越冬能力[1-2]。篩選調(diào)控苜蓿秋眠性候選基因時發(fā)現(xiàn)Maverick苜蓿葉片中Cyclin-D5;1基因(CycD5;1)在秋季9月份時的表達(dá)量顯著高于春季5月份時的表達(dá)量(P<0.01)[3]，因此推測CycD5;1基因的高表達(dá)可能參與苜蓿的秋眠。CycD5;1屬于植物D型細(xì)胞周期蛋白中的一個。植物D型細(xì)胞周期蛋白包括N末端和/或C末端的PEST基元(motif)，以及Rb結(jié)合基元(LxCxE)[4]?；谠谙到y(tǒng)演化上的位置，D型細(xì)胞周期蛋白可以細(xì)分成CycD1、CycD2、CycD3、CycD4、CycD5、CycD6 和CycD7 等多個亞類[5]。D型細(xì)胞周期蛋白通過形成細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的調(diào)節(jié)亞單位在細(xì)胞周期對外界信號的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6]，它們作為連接與細(xì)胞分裂活性相關(guān)的外部和內(nèi)部生長信號的主要傳感器[7]，被認(rèn)為是從G1期早期(甚至G0期)開始調(diào)控細(xì)胞循環(huán)的進(jìn)展來響應(yīng)外部生長信號[8]，其調(diào)控細(xì)胞循環(huán)的機(jī)理可能是：在對生物和非生物脅迫信號的響應(yīng)下它們直接作用于CycD/CDK復(fù)合物的信號級聯(lián)來阻止細(xì)胞周期，CycD/CDK復(fù)合物和EL2樣蛋白之間的平衡可能是決定細(xì)胞分裂與否的一個關(guān)鍵參數(shù)[7]。研究表明，CycDs的表達(dá)受植物激素調(diào)控，特別是受生長激素IAA的調(diào)控，CycDs的增加可激活或促進(jìn)細(xì)胞分裂[9]，但是它們受環(huán)境因子調(diào)控的研究未見報道。

CycD5;1屬于CycD5的一種，是一個數(shù)量性狀基因，CycD5;1在核內(nèi)復(fù)制過程中作為核內(nèi)復(fù)制限速因子，CycD5;1的過表達(dá)和沉默均能有效地改變DNA倍性水平，它通過調(diào)節(jié)葉片發(fā)育過程中連續(xù)內(nèi)循環(huán)的進(jìn)程來控制自然界的內(nèi)倍體，種群結(jié)構(gòu)與CycD5;1遺傳變異的部分混淆產(chǎn)生了一種適應(yīng)環(huán)境梯度變化的機(jī)制，這種機(jī)制導(dǎo)致在廣泛地理范圍內(nèi)的差異內(nèi)多倍體和器官生長[10]。CycD5;1是活性激酶復(fù)合物(CycD/CDK)重要組成蛋白，這些復(fù)合物誘導(dǎo)分化煙草(NicotianatabacumL.)表皮細(xì)胞分裂、促進(jìn)擬南芥(Arabidopsisthaliana)細(xì)胞增殖[11]。在擬南芥中CycD5;1高表達(dá)可以增加葉片細(xì)胞數(shù)和減少細(xì)胞體積，這可能是有絲分裂活性高于內(nèi)循環(huán)活性的結(jié)果；而其低表達(dá)使葉片細(xì)胞數(shù)減少而細(xì)胞大小基本不變[10]。

目前，CycD5;1基因的研究主要集中在擬南芥、煙草和玉米(Zea mays)上，苜蓿CycD5;1的研究僅見前期篩選調(diào)控苜蓿秋眠性候選基因中的報道，對其研究還很不深入，因此本研究通過檢測春夏秋季和人工條件下不同光照時間或溫度下秋眠型苜蓿品種Maverick葉片中CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量，分析其在苜蓿秋眠中的作用及其調(diào)控秋眠性的機(jī)理，以期為苜蓿分子育種提供功能基因和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大田試驗

選用美國苜蓿標(biāo)準(zhǔn)秋眠1級品種Maverick作為試驗品種，2010年9月播種于鄭州惠濟(jì)區(qū)的砂質(zhì)壤土中，按照常規(guī)苜蓿種植管理辦法進(jìn)行種植管理。第一次取樣是苜蓿春季返青后4月份取樣，以后5月份到10月份期間每次刈割后第14天取樣，每次均是在上午8:00開始采集，采集至少三株苜蓿植株分枝頂端第一個成熟葉片以下的第3～5片成熟葉片，取后放置液氮中，之后再存于-80 ℃冰箱待用。每次取樣需要記錄當(dāng)月的日照長度和溫度；隨機(jī)選取5株苜蓿并隨機(jī)選取10片葉片測長和寬，采用曹亦芬等建立的A=KLW (A：葉面積；K：修正系數(shù)；L：葉長；W：葉寬)公式和糾正系數(shù)(根據(jù)長寬的數(shù)值選用適合的糾正系數(shù))計算葉面積[12]；同樣，隨機(jī)選取15株苜蓿植株并測每株高、中、低枝條的高度，取其平均值作為該苜蓿株的株高。

1.2 人工條件處理試驗

紫花苜蓿為長日照植物，日照長度長于14 h開花，在夏末秋初日照長度短于11 h時它會發(fā)生明顯秋眠，因此日照長度設(shè)置為：8 h、12 h、16 h；紫花苜蓿最適生長發(fā)育溫度是15～25 ℃，并且氣溫高于30 ℃植株生長受阻，高于35 ℃植株萎蔫甚至死亡，因此溫度設(shè)置為16 ℃、24 ℃和32 ℃。紫花苜蓿品種Maverick植株共分為6組，每組各3株苜蓿植株。其中3組分別在溫度均為24 ℃、光照強(qiáng)度均為3 000 lux，每天光照時間分別為8 h、12 h和16 h下培養(yǎng)。另外3組在光照強(qiáng)度均為3 000 lux、每天光照時間均為16 h，溫度分別為16 ℃,24 ℃和32 ℃下培養(yǎng)。每種處理均是刈割后開始處理，處理14 d后取各自的葉片并儲存于-80 ℃冰箱待用。

1.3 總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄

所取樣品嚴(yán)格按照TRizol法操作步驟(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取各樣品的總RNA，并應(yīng)用Nano2000核酸檢測儀器檢測各樣品RNA的濃度后均調(diào)至500 ng/μL的濃度，取2 μL的各樣品RNA嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟(TAKARA公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 CycD5;1 mRNA相對含量檢測

前期轉(zhuǎn)錄組測序得到的CycD5;1部分序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中序列比對進(jìn)行基因注釋、保守序列分析和各外顯子界限的分析，根據(jù)序列分析結(jié)果應(yīng)用primer5.0軟件按照熒光定量引物設(shè)計原則設(shè)計CycD5;1熒光定量引物(CycD5;1-S：ACAGAAATAGACCAAGAGGGAGA，CycD5;1-A：CAGGGCAGAACAAGTAAACAAAG)，紫花苜蓿GAPDH熒光引物為GAPDH-S：TGGGAAGCACATTACAGCAG，GAPDH-A：CATCAGCATTGACACCAACC[3]，應(yīng)用羅氏SYBER green熒光染料在羅氏Cycler9.0熒光PCR儀上檢測各樣品中CYCD5;1 mRNA相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

依據(jù)熒光定量PCR檢測的CycD5;1和GAPDH的Ct值，采用2-ΔΔCt公式計算CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示[13]。應(yīng)用SPSS 19.0(IBM Corp., USA)軟件中one-way ANOVA方法、雙因子相關(guān)性分析和雙邊T檢驗方法對所測日照長度、溫度、株高、葉面積和各樣品間CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性和相關(guān)性分析。最后，應(yīng)用GraphPad prism 5(GraphPad Software,Inc, USA)軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 采樣時期日照長度和溫度

從4月份至10月份的日照長度和溫度均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。從4月份至6月份的夏至日照長度逐漸延長，之后逐漸縮短；從4月份至7月份溫度逐漸升高，之后逐漸下降(圖1)。

2.2 Maverick苜蓿株高和葉面積

從5月份至10月份，Maverick苜蓿的株高逐漸下降，但4-8月份Maverick苜蓿株高差異沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)，9、10月份時的Maverick苜蓿株高極顯著低于4-8月份的株高(P<0.01)(圖2)，表明Maverick品種苜蓿在秋季發(fā)生秋眠時株高顯著降低；8-10月份Maverick苜蓿葉面積顯著小于其它月份的葉面積(P<0.05),表明秋季Maverick苜蓿秋眠時的葉面積顯著變小(圖3)。

2.3 CycD5;1基因mRNA 相對表達(dá)量

由圖4可見，自然條件下，CycD5;1 mRNA 相對表達(dá)量基本呈現(xiàn)4-7月份逐漸減少，7-10月份逐漸升高的趨勢，其中7月份含量最低9月份時的CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于6、7、8月份時的相對表達(dá)量(P<0.05)，10月份的CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量極顯著高于6、7、8月份時的相對表達(dá)量(P<0.01)。

人工氣候條件下，隨著光照時間的增加，Maverick苜蓿葉片中CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量逐漸增加,光照時間8 h時的Maverick苜蓿葉片CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量極顯著低于12 h和16 h時的相對表達(dá)量(P<0.01)；光照時間12 h時的Maverick苜蓿葉片CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量極顯著低于16 h時的相對表達(dá)量(P<0.01)(圖5)。

隨著溫度的升高，秋眠型苜蓿Maverick葉片中CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量逐漸降低，其中16 ℃下秋眠型苜蓿Maverick葉片中CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量極顯著高于24 ℃和32 ℃下CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量(P<0.01)(圖6)。

2.4 CycD5;1 mRNA 相對表達(dá)量、苜蓿表觀參數(shù)、環(huán)境因子之間的相關(guān)性

由表1可見，自然條件下,秋眠型苜蓿Maverick葉中CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量變化與溫度顯著中度負(fù)相關(guān)(P<0.05),與日照長度顯著高度負(fù)相關(guān)(P<0.05)。但在人工氣候條件下,秋眠型苜蓿Maverick葉中CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量變化與日照長度極顯著高度正相關(guān)(P<0.01)、與溫度極顯著高度負(fù)相關(guān)(P<0.01)。自然條件下，秋眠型苜蓿Maverick葉中CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量與葉面積、株高呈顯著中度負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表1 CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量、苜蓿表現(xiàn)號數(shù)、環(huán)境因子之間的相關(guān)性Table 1 Correlation between CycD5;1 mRNA relative abundance in the leaves of Maverick and day length and temperature

3 討 論

秋眠型苜蓿在秋季發(fā)生秋眠時再生高度和葉面積顯著低于未秋眠時的再生高度和葉面積,但是目前苜蓿秋眠性的分子機(jī)理不清楚。本研究表明秋眠型苜蓿Maverick葉片中CycD5;1基因的表達(dá)受日照長度的正調(diào)控、受溫度負(fù)調(diào)控，其中，溫度是調(diào)控其表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)境因子，秋眠型苜蓿MaverickCycD5;1基因的高表達(dá)很可能在減小其葉面積、降低其株高中發(fā)揮重要作用而參與調(diào)控苜蓿的秋眠。

3.1 Maverick葉片CycD5;1基因表達(dá)

在人工條件下秋眠型苜蓿Maverick葉片中CycD5;1基因表達(dá)受日照長度和溫度調(diào)控的趨勢相反，溫度負(fù)調(diào)控CycD5;1基因表達(dá)，溫度的降低上調(diào)CycD5;1基因表達(dá)；自然條件下,秋眠型苜蓿Maverick葉片中CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量與日照長度和溫度顯著負(fù)相關(guān)(表1)；由此可得：人工條件和自然條件下日照長度與秋眠型苜蓿Maverick葉中CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量相關(guān)性相反，而人工條件和自然條件下的溫度與秋眠型苜蓿Maverick葉中CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量相關(guān)性相同，并且自然條件下日照長度和溫度與秋眠型苜蓿Maverick葉中CycD5;1 mRNA相對表達(dá)量的相關(guān)性一致,因此秋眠型苜蓿Maverick葉片中CycD5;1基因的表達(dá)主要受溫度的調(diào)控。秋眠型苜蓿最初引自寒冷氣候地區(qū)、具有很好的抗寒性，適合于寒冷氣候的地區(qū)生長；它們形成了適應(yīng)環(huán)境的調(diào)控方式，并且秋眠型苜蓿有其獨特的遺傳背景和遺傳多樣性[14]，Sterken等[10]研究表明：CycD5;1的遺傳變異參與植物適應(yīng)環(huán)境梯度變化的機(jī)制，因此CycD5;1很可能參與秋眠型苜?？购詮?qiáng)的特性，這也可能是它的表達(dá)主要受溫度調(diào)控的原因。

秋眠型苜蓿Maverick葉片中CycD5;1基因表達(dá)主要受溫度的調(diào)控是直接還是間接的呢？Aurora等[9]研究表明：CycDs的表達(dá)受植物激素調(diào)控，特別是受生長激素IAA的調(diào)控，溫度通過改變植物激素作用來影響植物生命活動。以此推測秋眠型苜蓿Maverick葉片中CycD5;1基因的表達(dá)受溫度的調(diào)控很可能是通過植物激素間接調(diào)控的。

3.2 CycD5;1基因調(diào)控苜蓿秋眠的機(jī)理

溫度是調(diào)控苜蓿秋眠性的環(huán)境因子[15]，從夏末至秋季隨著溫度的降低秋眠型苜蓿發(fā)生秋眠，秋眠型苜蓿Maverick葉片中CycD5;1基因的表達(dá)主要受溫度的調(diào)控，溫度的降低導(dǎo)致秋眠型苜蓿葉片中CycD5;1基因mRNA相對表達(dá)量升高(圖4、圖6)，并且秋眠型苜蓿Maverick葉片中CycD5;1基因mRNA相對表達(dá)量與其株高和葉面積顯著負(fù)相關(guān)(表1)，所以秋季時秋眠型苜蓿葉片中CycD5;1基因的高表達(dá)很可能參與降低株高和減少葉面積。株高和葉面積都被認(rèn)為是苜蓿秋眠性的重要指標(biāo)[16-17]。葉面積是葉片細(xì)胞周期、分裂和生長的宏觀表現(xiàn)，細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)與整個器官生長速率的變化有著直接的聯(lián)系,細(xì)胞周期、分裂和生長受細(xì)胞和環(huán)境因素之間空間關(guān)系的調(diào)節(jié)[18-19]，葉片大小受細(xì)胞周期、分裂和生長相關(guān)基因表達(dá)變異的影響[20]。CycD5;1屬于植物D 型細(xì)胞周期蛋白之一，是活性激酶復(fù)合物(CycD/CDK)重要組成蛋白，這些復(fù)合物在調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂中起著關(guān)鍵作用。本研究表明：秋眠型苜蓿葉片中CycD5;1基因的高表達(dá)減小了葉面積。苜蓿葉面積的減小減弱了葉片光合作用、呼吸作用和蒸騰作用，從而減慢了整個植株的生長，可能導(dǎo)致了苜蓿株高的降低。

綜上所述，CycD5;1基因調(diào)控苜蓿秋眠的機(jī)理可能是：從夏季至秋季隨著溫度的降低，CycD5;1基因表達(dá)的上調(diào)減慢了細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂，從而使葉面積減小、葉片光合作用、呼吸作用和蒸騰作用減弱，從而減慢了整個植株的生長而發(fā)生秋眠。但在擬南芥中CycD5;1高表達(dá)增加葉片細(xì)胞數(shù)和減少細(xì)胞體積，沉默CycD5;1擬南芥植株能減少葉片細(xì)胞數(shù)和減少細(xì)胞體積[10]，說明CycD5;1基因的高表達(dá)可能增加了葉面積和促進(jìn)了細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂，這與本研究的結(jié)果相反?？赡艿脑蚴遣煌奈锓N間CycD5;1參與適應(yīng)環(huán)境梯度變化的機(jī)制不同，不同物種的CycD5;1的功能有差異。

4 結(jié) 論

秋眠型苜蓿Maverick葉片中CycD5;1基因的表達(dá)受溫度極顯著負(fù)調(diào)控、受日照長度極顯著正調(diào)控，但溫度對其表達(dá)調(diào)控占絕對優(yōu)勢；隨著溫度的降低CycD5;1基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致苜蓿葉面積的減小和株高的降低從而促進(jìn)了苜蓿的秋眠。