潘 赟， 劉世榮，易曉華，張 宇，孫秀柱，2*

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100;2.西北農林科技大學 草業(yè)與草原學院，陜西 楊凌 712100)

隨著人工授精技術的廣泛應用，精液冷凍保存研究在動物生產(chǎn)繁殖領域方面也受到高度重視，然而精子在冷凍保存過程中會受到不同程度的損傷，如：物理損傷，化學損傷和氧化應激損傷。其中，氧化應激損傷是降溫保存過程中損害精子的主要因素，對精子結構形態(tài)會產(chǎn)生一系列的不利影響，包括細胞內冰晶的形成、脂質相變以及質膜重組引起的膜結構和功能的改變，造成冷凍復蘇后精液品質下降，嚴重制約精液冷凍保存技術的發(fā)展。家畜精子對低溫尤為敏感，冷凍解凍后精子活力一般不超過50%[1]。在山羊精液冷凍保存過程中，由于精子質膜中含有大量的不多飽和脂肪酸，使山羊精液在冷凍保存期間極易受到氧化應激損傷影響，活性氧的過量產(chǎn)生使精子細胞內抗氧化防御平衡體系遭到破壞[2]，進而造成精子質膜脂質過氧化，影響精子的運動性、代謝及細胞內成分的高滲漏率，破壞精子頂體、質膜及DNA的完整性。在實踐應用中，添加外源性抗氧化劑可以減少精子細胞遭受氧化應激損傷影響，降低ROS及過氧化水平，提高精子品質及母畜授胎率。為此，本文以活性氧的產(chǎn)生及對精液冷凍保存損傷機理和常用抗氧化劑對山羊精液冷凍保存的作用兩方面進行綜述，期望為山羊精液冷凍保存相關研究提供一定的理論依據(jù)和參考。

1 活性氧對山羊精液冷凍保存的影響

活性氧(Active Oxygen , ROS)是生物體內正常有氧代謝過程中產(chǎn)生的一系列副產(chǎn)物，由于核外含有不成對電子,它們能夠形成高活性分子，在與電子反應時，氧轉化為活性氧物質，主要包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH-)、一氧化氮(NO)等[3]。精子細胞內ROS的產(chǎn)生主要是由線粒體呼吸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH氧化酶)、脂氧合酶等酶類產(chǎn)生。此外，在冷凍解凍過程中受滲透壓、冷休克、高度稀釋等因素刺激，也會產(chǎn)生大量ROS。ROS在動植物體內具有雙重意義，在許多重要信號反應中起關鍵作用[4]，但ROS也是有氧代謝的有毒副產(chǎn)物[5]。有研究報道，在精子細胞結構和功能成熟的生理過程中，適量ROS的產(chǎn)生對精子細胞的成熟，誘發(fā)精子超激活運動及精子獲能發(fā)揮著積極作用[6]，此外，適量的ROS還能提高酶的活性，增強機體抗氧化能力。但ROS水平較高時，精子細胞易受氧化應激損傷影響，導致細胞自身抗氧化防御機制受到破壞，失去自我保護功能，對精子細胞的存活構成嚴重威脅。ROS對精子的作用模式主要有三種:①脂質過氧化，是ROS影響精子功能的主要方式。它可以將細胞膜內多不飽和脂肪酸過氧化，產(chǎn)生丙二醛，影響精子質膜的完整性[7]；②對線粒體 ATP 產(chǎn)生發(fā)生影響，ROS可以降低軸絲蛋白磷酸化，影響精子的運動能力；③誘導精子DNA損傷，堿基修飾、移碼突變及染色體重排[8]，改變細胞內信號傳導途徑，增加細胞凋亡，導致精卵結合受損[9]。此外，ROS對胚胎發(fā)育、流產(chǎn)和不育也有著密切的聯(lián)系[10]。

2 抗氧化劑對精液冷凍保存的影響

動物生殖組織中存在自身的氧化還原平衡體系，當受到ROS刺激時，機體內抗氧化機制會被啟動，以減輕自身氧化損傷程度。有研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物的精子可以通過糖酵解、三羧酸循環(huán)結合磷酸戊糖或糖酵解結合線粒體三羧酸循環(huán)途徑獲得能量，使精子產(chǎn)生氧化還原能力[11]。但在精液冷凍保存過程中，ROS的過量產(chǎn)生與精子抗氧化活性之間的氧化與抗氧化平衡系統(tǒng)受到破壞，精子質量受到嚴重損害。因此，添加外源性抗氧化劑是抵抗自由基誘導氧化應激的主要防御因子[12]，通過阻止自由基鏈的生成和蔓延來減少氧化應激造成的損傷，以維持自身抗氧化平衡，提高凍融后精子質量。

常見的抗氧化劑主要有酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑，酶類抗氧化劑也稱為天然抗氧化劑，主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、輔酶Q10等。非酶類抗氧化劑也稱為合成抗氧化劑，主要包括維生素類(VE、VC)、氨基酸類(半胱氨酸、谷氨酰胺)、多糖類(海帶多糖、枸杞多糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖等)及其他抗氧化劑(褪黑素、谷胱甘肽)。這些抗氧化劑均能中和精液中過多的ROS，降低氧化應激損傷水平，保護細胞結構，改善冷凍解凍后精子品質(見表1～2)。

表1 酶類抗氧化劑的作用及機制Table 1 Action and mechanism of enzymatic antioxidants

表2 非酶類抗氧化的分類及作用機制Table 2 Classification and mechanism of non-enzymatic antioxidants

2.1 酶類抗氧化劑對山羊精液冷凍保存的影響

酶類抗氧化劑也稱為天然抗氧化劑，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)是精漿中ROS主的清除劑, 對精子發(fā)生和維持精子的正常受精能力具有積極作用，SOD廣泛存在于生物體內，是一種源于生命體的活性金屬酶物質，被認為是抵抗活性氧的第一道防線，在冷凍保存中能有效減少自由基產(chǎn)生，保護超氧陰離子自由基對機體的損害；CAT也叫接觸酶酵，可以減弱或消除H2O2對細胞的毒害作用；輔酶 Q10(Coenzyme Q10，Co Q10)屬脂溶性抗氧化劑，主要存在于細胞線粒體內膜上,是氧化磷酸化反應過程中多種酶的輔酶；此外，輔酶 Q10具有增強免疫力、緩解體力疲勞、抗細胞凋亡等作用。劉超等[24]研究表明，山羊精液中GSH-Px、SOD活性與精子活力呈極顯著正相關。Berlingue等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)液中添加SOD能顯著提高精子活力，同對照組相比在含有SOD組中，在3 h、6 h和9 h精子活力均得到顯著提高，且母畜授精率明顯高于空白組。霍敏[26]在研究絨山羊精液冷凍保護中發(fā)現(xiàn)，添加外源性CAT可以顯著提高精子質量，當添加200 U/mL CAT時能顯著提高精子質膜完整率和頂體完整率；當添加300 U/mL CAT時，能顯著提高精子活率、DNA 完整率、線粒體膜電位并降低細胞內ROS水平?；裘舻萚27]在絨山羊精液冷凍保存研究中發(fā)現(xiàn)，在冷凍稀釋液中添加輔酶Q10可以提高凍融后精子質量, 其中, 添加40 μg/mL輔酶Q10效果最好。

2.2 非酶類抗氧化劑對山羊精液冷凍保存的影響

2.2.1 維生素類抗氧化劑對山羊精液冷凍保存的影響 維生素E(Vitamin E，VE)又名α-生育酚，屬于多酚類脂溶性維生素，主要存在于細胞膜中并能與膜結構中的脂質結合，使膜脂肪酸鏈與ROS之間共價鍵斷裂，保護細胞中不飽和脂肪酸免受氧化反應損傷，是機體重要的抗氧化劑。Azawi等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在Tris稀釋劑中添加VC或VE可以顯著提高山羊精子的保存時間和質量，在添加VC或VE5 ℃保存12h后精子活率分別為54.7%和45.5%，異常精子和頂體缺陷率分別為18.8%和52.8%。Kargar等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加VE可以提高冷凍解凍后精子的活力和質膜的完整性。施力光等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加VE有助于提高熱帶地區(qū)夏季高溫季節(jié)山羊精子密度、活力，降低畸形率同時還能增強精漿中抗氧化酶的活性，緩解熱應激。Yue等[31]研究發(fā)現(xiàn)，VE可以改善睪丸細胞膜和線粒體的抗氧化能力，提高精液質量；當添加200 IU VE 時對提高精液質量具有積極作用，可以顯著降低MDA水平并改善睪丸細胞中SOD、GSH-PX活性，提高質膜和線粒體的完整性。

維生素C(Vitamin C，VC)又稱抗壞血酸，屬于水溶性維生素，它可以與機體內的自由基發(fā)生氧化還原反應，能有效地清除機體內多余的ROS及有害自由基。陳宗明等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在低溫保存精液稀釋液中添加 3.0 mg/mL VC可以減少低溫對精子的損傷，顯著提高精子活力改善精液品質。宋天增等[33]研究發(fā)現(xiàn)，添加2.0 mg/mL VC可以降低4 ℃保存藏西北絨山羊精液全基因組DNA甲基化異常水平, 提高藏西北絨山羊精液冷藏效果。Memon等[34]研究不同冷卻速度和冷凍方法時發(fā)現(xiàn)，VC能夠改善精液冷凍解凍后精子質量，當添加8.5 mg/mL VC能改善精子活力、膜和頂體的完整性。

2.2.2 氨基酸類抗氧化劑對山羊精液冷凍保存的影響 半胱氨酸是一種含巰基的非必需天然氨基酸，是谷胱甘肽的重要合成物，具有抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加半胱氨酸能夠顯著提高精液品質降低精子畸形率，但對質膜完整率并沒有顯著影響，當添加5.0 mmol/L的半胱氨酸可以提高精液品質和精漿中抗氧化酶的活性[35]；在Tris-卵黃甘油稀釋液中添加半胱氨酸能降低精子脂質過氧化水平，提高母畜妊娠率[36]。但Salvador等[37]研究表明，5 ℃保存山羊精液時，在稀釋液中添加半胱氨酸并不能提高精子活力。因此，添加半胱氨酸作為冷凍精子抗氧化劑有待商榷。

谷氨酰胺是哺乳動物機體組織中最豐富的一種游離氨基酸，具有改善機體氮平衡、促進蛋白質合成，為其他氨基酸、核酸的合成提供氮源的作用。此外，谷氨酰胺還能調節(jié)細胞代謝維持細胞膜結構，參與蛋白質結構的氧化還原活性[38]。研究表明，谷氨酰胺在山羊精子凍融過程中具有低溫保護作用，谷氨酰胺的最佳濃度為25 Mm[39]。石薇等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在添加10 mmol/L棉子糖的稀釋液中, 當添加5 mmol/L谷氨酰胺時，能顯著降低冷凍解凍后精子的畸形率，提高精子頂體的完整率和活率。張少華等[41]研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加5.0 mmol/L的谷氨酰胺對冷凍精液品質的保護效果最好。

2.2.3 多糖類抗氧化劑對山羊精液冷凍保存的影響 多糖類抗氧化劑是由單糖通過糖苷鍵連接而成的化合物，屬于非滲透性保護劑具有抗氧化性。此外，在冷凍保存過程中，糖類抗氧化劑還可以作為能量物質，為線粒體氧化磷酸化提供能量，提高過氧化酶的活性。王艷華[43]在山羊精液冷凍稀釋液中分別添加1.0 mg/mL 海帶多糖和4.0 mg/mL枸杞多糖，能有效提高凍融后山羊精子活率、頂體完整率、質膜完整率和線粒體活性；在基礎液中配伍添加海帶多糖和枸杞多糖也能夠有效改善冷凍解凍后山羊精子活率、頂體完整率和質膜完整率，其最佳配伍濃度為 1.0 mg/mL 海帶多糖+2.0 mg/mL 枸杞多糖。孟克格日樂[44]在內蒙古白絨山羊精液冷凍稀釋液研究中發(fā)現(xiàn)，在山羊精液冷凍稀釋液里添加海藻糖能有效提高冷凍解凍后精液品質，最佳濃度為0.018 g/mL。任發(fā)等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在絨山羊精液冷凍保存液中分別添加4.0 mg/mL 枸杞多糖和1.0 mg/mL 海帶多糖，冷凍解凍后能提高精子內超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶活性；與單獨添加枸杞多糖或海帶多糖相比，配伍添加2.0 mg/mL枸杞多糖+1.0 mg/mL海帶多糖也能降低精子內ROS水平，提高精子質量。席利萌等[46]研究發(fā)現(xiàn)，紅景天多糖對山羊精液冷凍保存具有較好的冷凍保護效果, 能明顯提高山羊精液冷凍解凍后精子活率、頂體完整率及GSH水平,降低丙二醛濃度,最適濃度為16 mg/L。

2.2.4 其他抗氧化劑對山羊精液冷凍保存的影響 褪黑素(Melatonin, MLT) 是一種胺類激素，具有良好的脂溶性和水溶性，色氨酸是合成褪黑素的主要成分，具有刺激抗氧化酶(如GSH-PX和SOD)活性的作用[46]，可以穿透膜結構進入細胞器發(fā)揮其強大的抗氧化功能。霍敏等[69]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍稀釋液中添加褪黑素能夠顯著降低絨山羊精子細胞中ROS的含量, 當在稀釋液中添加0.500 mg/mL的褪黑素試驗組精子活率、質膜完整率、頂體完整率(53.3%、44.6%和77.9%)均顯著高于空白對照組 (47.8%、36.3%和53.2%)。Ramadan等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在繁殖季節(jié)褪黑激素可以顯著增加精子的運動性、射精量、血液睪丸激素濃度，而在非繁殖季節(jié)，褪黑激素能有效減少死精子百分比。

谷胱甘肽(Glutathione, GSH)是細胞內主要的非蛋白硫醇化合物，可與自由基結合發(fā)揮自由基清除劑的作用。研究表明，添加GSH可以減少冷凍解凍后精子中ROS的產(chǎn)生，提高精子的運動性及頂體的完整性[49]；在Tris冷凍稀釋液中添加5 mM的GSH可提高解凍后精子活力，降低頂體異常百分比[50]；在GSH對綿羊細管凍精質量影響中發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖冷凍稀釋液中添加GSH可以增加冷凍解凍后精子的活力、質膜、頂體膜及DNA的完整性,當添加1 mmol/L GSH時效果，可以顯著提高凍融后精子品質，還可以在一定程度上提高體外授精卵裂率及囊胚率[51]。

3 展 望

隨著生殖生物學、低溫生物學和人工授精技術研究發(fā)展，抗氧化劑和精液的長期保存研究也越來越深入，對山羊遺傳資源的長期保持和輔助繁殖技術都有著極為重要的意義。但由于精子細胞結構的特殊性，在冷凍保存過程中，精子細胞會產(chǎn)生過量的ROS，ROS攜帶著氧化性極強的自由基,易與精子質膜發(fā)生脂質過氧化反應，破壞細胞內抗氧化平衡體系，影響精子解凍后的品質，包括運動能力、形態(tài)結構、頂體的完整性，DNA的完整性及活率等。雖然甘油、卵黃等冷凍保護劑已廣泛應用到山羊精液冷凍保護實驗研究中，但在繁殖生產(chǎn)中任存在很大程度的限制性，如在降溫過程中冰晶化的產(chǎn)生對精子的機械損傷和物理損傷。為維持凍融后精子結構的完整性及膜的通透性，關鍵蛋白結構及修飾的生物學功能，提高精子質量及優(yōu)良公畜的利用率。因此，進一步探索冷凍損傷的機理、分子組成結構及外源性抗氧化劑、抗凍保護劑以及膜保護劑的研究，稀釋配方、冷凍解凍程序的優(yōu)化組合，為推動精液冷凍保存技術的快速發(fā)展，優(yōu)質資源的保護及利用提供更多技術保障，促進山羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。