張仁森，劉秋月，胡文萍，王翔宇，馬 琳，儲明星，狄 冉

(中國農(nóng)業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193)

生殖激素(reproductive hormone)是指與動物性器官、性細胞、性行為等的發(fā)生和發(fā)育以及發(fā)情、排卵、妊娠、分娩和泌乳等生殖活動有直接關系的激素[1]。生殖激素按其化學本質(zhì)可以分為三類[2]。第一類為蛋白質(zhì)、多肽類激素，垂體分泌的所有生殖激素和腦部分泌的大部分生殖激素都屬此類，如褪黑素(melatonin)、催乳素(prolactin)、促性腺激素釋放激素(gonadotrophin releasing hormone)、促黃體素(Luteinizing Hormone，LH)和促卵泡素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)。此外，胎盤和性腺以及生殖器官外的其他組織器官也可以分泌蛋白質(zhì)和多肽類激素，如孕馬血清促性腺激素(pregnant mare's gonadotrophin)。這類激素對性腺或乳腺的發(fā)育和分泌機能有直接作用。第二類為類固醇類激素，主要由性腺和腎上腺分泌，如生殖激素中的雌激素(estrogen)、雄激素(androgen)和孕酮(progesterone)，它們在結構上都是環(huán)戊烷多氫菲衍生物[3]，此類激素對動物性行為和FSH、LH等的分泌有直接或間接作用。第三類為脂肪酸類激素，主要由子宮、前列腺、精囊腺和某些外分泌腺體所分泌，如前列腺素(prostaglandin)，前列腺素對生殖、內(nèi)分泌、心血管、呼吸、消化、神經(jīng)等系統(tǒng)均有生物學作用，在生殖系統(tǒng)中起作用的前列腺素主要是PGF2α和PGE2[4]。

生殖激素對家畜的生長發(fā)育和繁殖具有重要的調(diào)控作用，因而是家畜繁殖研究中的主要對象。生理狀況下動物體內(nèi)生殖激素含量較低，血液中的含量一般只有10-12～10-9g/mL[5-7]，并且多數(shù)存在與其結構相似的化合物[8-10]，這些化合物的存在會干擾生殖激素的測定，造成假陽性或者假陰性，故測定的方法必須具有高度的特異性和靈敏性。通常，蛋白類的生殖激素分泌后貯存于分泌腺體中，直至需要時才從腺體中釋放出來，且其在血液中不與轉(zhuǎn)運蛋白結合，而類固醇類激素一般不貯存，邊分泌邊釋放至血液中[11]。與轉(zhuǎn)運蛋白結合的激素不具有生物學活性，但可以防止被肝臟分解，待解離后才具有生物學作用[12]。

家畜生殖激素的精準測定對研究其在家畜生長發(fā)育和繁殖中的調(diào)節(jié)作用具有非常重要的意義。目前國內(nèi)外對其測定方法主要包括生物測定法、基于抗原抗體特異性結合的免疫分析法、基于配體受體特異性結合的測定方法、基于適配體技術的測定方法以及以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS /MS)為代表的理化測定法等五類。以上五類方法各有其優(yōu)缺點，在實際應用中應根據(jù)實驗目的和實際情況加以選擇應用。各類檢測方法優(yōu)缺點總結見表1。

1 生物測定法

最早用于生殖激素濃度測定的方法是生物測定法(bioassay)，該方法是根據(jù)生殖激素的生物學作用而設計的，是研究某種新的激素及其制劑最基本的檢測手段。該方法雖然靈敏度不高，但其結果能直接體現(xiàn)生殖激素的生物活性，因此其他方法不能替代它。

Rubin等[13]建立了一種根據(jù)子宮增重來間接判斷雌激素含量的生物測定法，但是該方法復雜、費時且靈敏度較差。有人建立了一種基于放射性受體競爭結合法的體外FSH生物活性測定方法[14]。但是即使FSH能夠與其受體結合，也不能完全代表激素的生物活性。其它生物測定方法還包括利用子宮增重或者陰道涂片測定雌激素、利用雞冠發(fā)育測定雄激素[15]、利用卵巢增重測定FSH、利用抗壞血酸排空反應測定LH等技術。

生物測定法雖然可以間接反映激素的含量，但其靈敏度相對較低，并且測定的準確度和精確度受標準品純度、生殖激素之間相似的生物活性、實驗動物對激素的敏感度等因素影響，所以近年來生物測定法多用來測定生殖激素的生物活性而很少用于生殖激素濃度的測定。

表1 家畜生殖激素各類檢測方法優(yōu)缺點比較Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of various methods for detecting reproductive hormones in livestock

2 免疫測定法

免疫測定法是近年來得到快速發(fā)展的一種生殖激素測定方法，該方法靈敏度高，特異性好，在生殖激素的測定中得到了廣泛的運用。在免疫法測定激素的歷史進程中一個重要的突破是放射免疫分析法RIA(radioimmunoassay，RIA)技術的出現(xiàn)，該技術大大提升了激素檢測的靈敏度和準確度，其發(fā)明者Yalow和Bereson[16]因此獲得了諾貝爾醫(yī)學獎。該方法運用I-131或者I-125作為放射信號去檢測小分子量蛋白質(zhì)，但是由于其放射性的危害和對環(huán)境的污染，后來又逐漸發(fā)展了酶免疫測定法(enzyme-immunoassay，EIA)、熒光免疫測定法(fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA)、化學發(fā)光免疫測定法(chemiluminescene immunoassay，CL)、電化學發(fā)光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)、電化學免疫傳感器法(immune- electrochemistry sensor)等免疫測定法。

Szczesna等[17]運用放射性免疫法發(fā)現(xiàn)綿羊血液中催乳素的濃度在懷孕的大部分階段和懷孕前都會受到瘦素的影響，該方法靈敏度為2.0 ng/mL，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為9.1%和12.0%。Noguchi等[18]對豬血液中卵泡期和排卵前的促黃體素濃度進行了測定，結果發(fā)現(xiàn)運用熒光免疫測定法所得結果與放射性免疫測定法所得結果相似，熒光免疫測定法可以用來方便、快捷的測定豬血液中的促黃體素濃度。該方法的靈敏度為1.6 pg/mL，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為8.3%和6.8%。Li等[19]運用酶免疫測定法對豬卵泡顆粒細胞中的雌激素濃度進行了測定，結果顯示豬卵泡顆粒細胞中雌激素的產(chǎn)生需要豬卵泡顆粒細胞中促卵泡素的誘導。該方法的靈敏度為0.5 pg/mL，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為8.3%和7.6%。董佳涵等[20]采用化學發(fā)光酶免疫分析法測定成年雌性比格犬發(fā)情期中血清促黃體素、雌二醇和孕酮的濃度水平，并與放射性免疫測定法測定結果進行比較，結果顯示兩者顯著相關(P=0.0001)，化學發(fā)光酶免疫測定法與放射性免疫測定法檢測血清促黃體素、雌二醇和孕酮濃度的相關系數(shù)分別為r=0.964、0.987、0.9997，說明可以使用化學發(fā)光酶免疫分析法代替放射性免疫測定法測定犬體內(nèi)各生殖激素的含量。

免疫測定法具有高專一性、高靈敏性及操作相對簡單等優(yōu)點，但是其測定還是受到多種因素的影響。一是抗體的制備相對而言較為復雜。尤其對甾體類激素而言，其本身為不具有免疫活性的半抗原，故需先結合于牛血清白蛋白形成完全抗原，再制備抗體，另外甾體類激素之間具有相似的分子結構，會造成嚴重的交叉反應[21]。另一些因素如嗜異性抗體的存在、各種蛋白類激素類似物的存在[22]、游離激素和結合激素的平衡等因素都會影響免疫測定的結果[23]。各免疫測定法的優(yōu)缺點總結見表2。

3 基于配體-受體特異性結合的測定方法

激素與其靶細胞上的受體特異性結合的親和力很高，因此可用激素的受體代替免疫測定方法中的抗體對激素進行測定。與免疫測定法類似，用放射性同位素標記激素或其受體所建立的方法，稱為放射性受體分析法(radio receptor-assay, RRA)，用酶或熒光素標記激素或其受體所建立的方法，分別稱為酶標受體測定法(enzyme-labeled receptor-assay, ERA)和熒光素受體測定法(fluorescence-labeled receptor, FRA)。

夏國良等[24]利用綿羊卵巢黃體細胞膜作為LH/CG受體來源，以放射性125 I-h CG作為示蹤標記配體，以高純度hCG為標準品建立標準曲線建立了一種有效的LH-RRA測定方法。它能夠直接檢測多種動物血清中與受體結合的具有生物活性的LH的動態(tài)變化。該法測定程序簡單，在2 h內(nèi)完成并獲得可重復性結果。測定方法的靈敏度為0.3 ng/管，批內(nèi)和批間誤差分別為(3.41±3.14)%和(8.70±7.93)%。Cheng等[25]利用草地夜蛾細胞表達的β2-腎上腺素能受體建立了一種酶標受體測定法，利用該方法所測定的克萊多巴胺的半抑制濃度(IC50)和檢測限分別為30.38 μg/L和5.20 μg/L，該方法簡便快速且對環(huán)境沒有危害。

表2 生殖激素免疫測定方法的優(yōu)缺點比較Table 2 Comparison of advantages and disadvantages of immunoassay for reproductive hormones g/mL

與免疫測定法相比，受體測定法得到的結果更接近于生物測定，因為激素只有與其受體結合后，才能表現(xiàn)其生物學活性。但該方法操作相對復雜，受體的制備耗時耗力，且因為激素之間結構的相似性會造成一定的假陽性。

4 基于適配體技術的測定方法

適配體(Aptamer)這一概念首次由Ellington[26]和Tuerk[27]提出。核酸適配體是指通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)從特定的DNA文庫中篩選得到的一段針對靶蛋白的且具有高親和力和特異性識別作用的單鏈寡核苷酸(10～100堿基)片段，又稱為適配體、核酸適體或適配子等，可為ssDNA和RNA。適配體自身可通過折疊形成特定的二級或三級結構，如莖、環(huán)、凸、發(fā)卡結構、假結體、四角環(huán)和G-四鏈體等。

Contreras等[28]通過該技術在含1.8×1015mol單鏈DNA分子的隨機文庫中篩選出一條對孕酮具有高親和力的核酸適配體，該適配體與孕酮的相似物17β-雌二醇(E2)和諾塞甾酮(NET)沒有交叉反應，該方法檢測孕酮濃度范圍為10 ng/mL～60 ng/mL，檢測極限為0.90 ng/mL。張桂蘭等[29]建立了基于適配體技術的雌二醇納米金比色法，該方法可在20 min內(nèi)完成檢測。該方法的靈敏度可達10 ng/mL，線性范圍為10～10 000 ng/mL。由于長鏈適配體與納米金親和力高于短鏈適配體的親和力，為了提高納米金比色法檢測雌二醇的靈敏度，Liu等[30]又將76 mer適配體剪切為33 mer和43 mer兩段，建立了另外一種雌二醇的比色檢測法，結果顯示靈敏度提高了10倍，檢測限可達1 ng/mL。

傳統(tǒng)的抗原-抗體反應靈敏度和特異性均較好，市場上的許多試劑盒就是基于此原理開發(fā)的，但蛋白質(zhì)作為探針分子易受pH、溫度等環(huán)境因素影響而變性、且合成價格昂貴。適配體由DNA或RNA構成(主要是DNA)，比蛋白質(zhì)體積更小，經(jīng)SELEX篩選富集后，可以擁有與抗原-抗體反應相匹敵的靈敏度，同時合成更容易，穩(wěn)定性更好。在不遠的將來，適配體有望取代酶聯(lián)免疫反應，成為各種化學分子檢測的有力工具。

5 理化測定法

理化測定法中最為重要的是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)，該方法將高分離能力、使用范圍廣的液相色譜分離技術(包括高效毛細管電泳、毛細管高效液相色譜等)與高靈敏、高專屬的質(zhì)譜技術結合起來，成為一種強有力、多用途的定性、定量分析工具，是近年來新投入應用的一種分析方法，該方法被IFCC(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)[31]推薦為測定游離甲狀腺激素的標準方法，多用于檢測小分子化合物，其原理是用色譜分離混合物，以質(zhì)譜作為檢測器，分離、檢測出每種化合物的種類和濃度。

陳曉紅等[32]利用該方法測定了牛奶中孕激素的殘留量，檢測范圍為0.1～0.5 μg/kg，該方法可簡便、快速的檢測牛奶中孕激素的殘留量且特異性強、干擾少。Jared等[33]運用該法同時檢測出子宮沖洗物中783種蛋白成分。Lin等[34]運用該方法測定了羔羊和母羊卵母細胞之間5649種蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)其中574種蛋白在羔羊和母羊之間的表達存在差異。

LC-MS相比于傳統(tǒng)免疫方法，特異性和靈敏度更高。質(zhì)譜檢測技術的檢測靈敏度能夠達到pg/mL的水平，傳統(tǒng)方法受制于標準曲線檢測限的原因遠達不到該水平。同時質(zhì)譜法是通過被檢測物的荷質(zhì)比進行精確定量的，因此特異性更好，準確性更高。在進行生殖激素水平檢測時，由于該類物質(zhì)在動物機體內(nèi)濃度都相對較低，且結構相似的物質(zhì)較多，傳統(tǒng)免疫方法和高效液相色譜法的敏感性和特異性均無法達到檢測要求[35]。LC-MS操作流程相對復雜且實驗設備昂貴，故目前尚未普及。