任瑞英， 韓雪， 宋純東

基于C1GALT1/Cosmc通路研究雷公藤多苷對IgA腎病大鼠腸道菌群及免疫功能的影響*

任瑞英1， 韓雪1， 宋純東2△

（1鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院中醫(yī)科，河南 鄭州 450018；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，河南 鄭州 450000）

基于核心1 β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（C1GALT1）及其伴侶蛋白Cosmc （C1GALT1/Cosmc通路）研究雷公藤多苷（TWM）對IgA腎?。↖gAN）大鼠腸道菌群及免疫功能的影響。構(gòu)建IgAN大鼠模型，隨機分為模型組（IgAN組）、地塞米松（Dex）組和TWM組，另設(shè)正常飼養(yǎng)大鼠為正常對照（NC）組。采用全自動生化分析儀測定各組大鼠血清肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、24 h尿總蛋白量（UTP）及24 h尿紅細胞數(shù)； ELISA法檢測各組大鼠血清IgA1水平及血漿腫瘤壞死因子α （TNF-α）、B細胞活化因子（Baff）和白細胞介素17 （IL-17）水平；蠶豆凝集素親和ELISA法檢測半乳糖缺乏IgA1 （Gd-IgA1）水平；選擇性細菌培養(yǎng)基培養(yǎng)腸道菌落；流式細胞術(shù)檢測外周血單個核細胞（PBMC）中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）占CD4+T細胞比例（簡稱Treg比例）； Western blot法檢測腸黏膜組織C1GALT1和Cosmc的蛋白表達。與NC組比較， IgAN組大鼠24 h UTP和尿紅細胞數(shù)， SCr和BUN水平，血清IgA1和Gd-IgA1水平，腸道腸桿菌、腸球菌和擬桿菌數(shù)量，以及血漿TNF-α、Baff和IL-17水平均顯著增加（<0.05），而雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量、PBMC中Treg比例及腸黏膜組織中C1GALT1和Cosmc蛋白表達水平顯著降低（<0.05）；與IgAN組比較， Dex組和TWM組大鼠24 h UTP和尿紅細胞數(shù)， SCr和BUN水平，血清IgA1和Gd-IgA1水平，腸道腸桿菌、腸球菌和擬桿菌數(shù)量，以及血漿TNF-α、Baff和IL-17水平均顯著降低（<0.05），且TWM組低于Dex組（<0.05），雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量、PBMC中Treg比例及腸黏膜組織中C1GALT1和Cosmc蛋白表達水平顯著增加（<0.05），且TWM組高于Dex組（<0.05）。TWM可通過促進C1GALT1/Cosmc通路激活降低IgAN大鼠IgA異常糖基化水平，并減輕IgAN大鼠腸道菌群紊亂及免疫功能失調(diào)，從而發(fā)揮治療效果。

雷公藤多苷；IgA腎??；C1GALT1/Cosmc通路；腸道菌群；免疫功能

IgA腎?。↖gA nephropathy， IgAN）是一種臨床常見自身免疫性腎小球疾病，主要表現(xiàn)為血尿及蛋白尿，可導(dǎo)致終末期腎?。?-2］，但其發(fā)病機制尚未完全闡明。目前大多數(shù)學(xué)者認為， IgA異常糖基化導(dǎo)致半乳糖缺乏IgA1 （galactose-deficient IgA1， Gd-IgA1）產(chǎn)生并沉積于腎小球系膜，從而啟動炎性因子及細胞因子分泌，與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中核心1 β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（core 1 β1，3-galactosyltransferase， C1GALT1）與其伴侶蛋白Cosmc活性降低是重要機制之一［3-5］。研究報道， IgAN易感性與腸道菌群失調(diào)及腸黏膜免疫異常有一定關(guān)系，腸道有益菌數(shù)量增加對減輕疾病嚴重程度有一定作用，因此調(diào)控腸道菌群可能成為防控該病的新方向［6-7］。雷公藤多苷（multiglucoside， TWM）是雷公藤根部提取物，具有抗腫瘤、抗炎、抑制免疫反應(yīng)等多種藥理作用，廣泛用于治療糖尿病腎病、慢性腎小球腎炎、IgAN等腎臟疾?。?-9］，但關(guān)于TWM對IgAN腸道菌群及免疫功能的影響研究尚少。因此本研究基于C1GALT1/Cosmc通路探究TWM對IgAN大鼠腸道菌群及免疫功能的影響，以期為IgAN臨床治療提供新方向及理論依據(jù)。

材料和方法

1　實驗動物、儀器及試劑

48只6周齡SPF級雄性SD大鼠（貨號J001），體質(zhì)量（200±10） g，購自南京君科生物工程有限公司。TWM購自江蘇美通制藥有限公司（規(guī)格10 mg×50片，批準文號為國藥準字Z32021007）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）、四氯化碳（CCl4）和脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）購自Sigma；兔源anti-C1GALT1（貨號PA5-35246）、anti-Cosmc（貨號PA5-100451）和anti-β-actin（貨號PA1-16889）及羊抗兔IgG （貨號A32733）均購自Invitrogen；大鼠B細胞激活因子（B-cell activating factor， Baff） ELISA試劑盒（貨號JL42044）購自江萊生物科技有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α， TNF-α） ELISA試劑盒（貨號ab100785）、大鼠白細胞介素17 （interleukin-17， IL-17） ELISA試劑盒（貨號ab214028）、anti-PE-Cy7-CD4 （貨號ab210351）和anti-FITC-CD25 （貨號ab210332）購自Abcam。CytoFLEX流式細胞儀購自Beckman Coulter； FC型酶標儀購自Thermo Scientific。

2　實驗方法

2.1造模、分組及給藥48只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按照隨機數(shù)字表法分為正常對照（normal control， NC）組、模型組（IgAN組）、地塞米松（dexamethasone， Dex）組和TWM組，每組12只。除NC組外，其余3組以BSA （400 mg/kg）隔日灌胃，持續(xù)6周；蓖麻油（0.5 mL）+CCl4（0.1 mL）皮下注射，每周1次，持續(xù)9周；LPS （0.05 mg）于第6和8周尾靜脈注射以制備IgAN大鼠模型。NC組給予等量蒸餾水灌胃、生理鹽水尾靜脈注射及皮下注射處理。造模成功后， Dex組給予Dex （0.125 mg·kg-1·d-1［10］）灌胃， TWM組給予TWM （6.25 mg·kg-1·d-1［11］）灌胃， NC組和IgAN組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)8周。

2.2標本采集給藥結(jié)束后，用代謝籠收集大鼠灌胃第8周末24 h尿液，離心后留取上清液保存待檢；收集新鮮糞便3~5粒，放入EP管-80℃保存待檢。尾靜脈取血，一份于3 500 r/min （有效離心半徑10 cm）離心10 min，留取血清；一份抗凝血同樣離心后留取血漿，-80℃保存待檢；還有一份添加淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells， PBMC）。腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，分別處死各組大鼠，取出距肛門8 cm處結(jié)腸組織，沖洗內(nèi)容物，腸標本置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3大鼠腎功能指標測定采用日立7600型全自動生化分析儀測定各組大鼠血清肌酐（serum creatinine， SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）、24 h尿總蛋白量（24-hour urinary total protein， 24 h UTP）及24 h尿紅細胞數(shù)。

2.4血清IgA1和Gd-IgA1水平及血漿TNF-α、Baff和IL-17水平的測定采用ELISA檢測各組大鼠血清IgA1水平，采用蠶豆凝集素（lectin， VLL）親和ELISA法檢測Gd-IgA1水平，采用ELISA法檢測各組大鼠血漿TNF-α、Baff和IL-17水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.5腸道菌群培養(yǎng)將收集的大鼠糞便稱重后添加10倍質(zhì)量的生理鹽水，充分震蕩混勻后取適量懸浮液接種于各選擇性細菌培養(yǎng)基，腸桿菌培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基置于37℃細菌培養(yǎng)箱中需氧培養(yǎng)24 h，擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌厭氧菌培養(yǎng)基于厭氧袋置于37℃細菌培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后以菌落形成單位（colony-forming unit， CFU）計菌數(shù)，計算出每克標本中菌含量（CFU/g），并將結(jié)果取常用對數(shù)值（logCFU/g）進行分析定量。

2.6PBMC中Treg水平的檢測取200 μL PBMC細胞懸液，加入PE-Cy7-CD4和FITC-CD25單克隆抗體， 4℃避光孵育，洗滌、固定，反復(fù)洗滌后重懸，采用流式細胞儀檢測CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（regulation T cells， Treg）占CD4+T細胞比例（簡稱Treg比例），采用相應(yīng)熒光標記的同型對照IgG1染色細胞為陰性對照。

2.7腸黏膜組織中C1GALT1和Cosmc蛋白表達水平的檢測采用Western blot法：用蛋白抽提試劑盒提取各組大鼠腸黏膜組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，置于-80℃保存?zhèn)溆?；蛋白樣品進行SDS-PAGE，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，封閉，添加Ⅰ抗（C1GALT1、Cosmc和β-actin抗體均按1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，Ⅱ抗IgG （稀釋比1∶5 000）室溫孵育1.5 h；按上述方法洗膜，顯色，曝片，觀察結(jié)果并拍照分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照β-actin條帶灰度值比值為目的蛋白相對表達量。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-檢驗。<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　各組大鼠24 h UTP、尿紅細胞數(shù)、SCr和BUN水平的比較

與NC組比較， IgAN組大鼠24 h UTP、尿紅細胞數(shù)、SCr和BUN水平顯著增加（<0.05）；與IgAN組比較， Dex組和TWM組大鼠24 h UTP、尿紅細胞數(shù)、SCr和BUN水平顯著降低（<0.05），且TWM組低于Dex組（<0.05），見表1。

表1　各組大鼠24 h UTP、尿紅細胞數(shù)、SCr和BUN水平的比較

*<0.05NC group;#<0.05IgAN group;△<0.05Dex group.

2　各組大鼠血清IgA1和Gd-IgA1水平的比較

與NC組比較，IgAN組大鼠血清IgA1和Gd-IgA1水平顯著增加（<0.05）；與IgAN組比較，Dex組和TWM組大鼠血清IgA1和Gd-IgA1水平顯著降低（<0.05），且TWM組低于Dex組（<0.05），見表2。

表2　各組大鼠血清IgA1和Gd-IgA1水平的比較

*<0.05NC group;#<0.05IgAN group;△<0.05Dex group.

3　各組大鼠腸道菌群數(shù)量的比較

與NC組比較，IgAN組大鼠腸道腸桿菌、腸球菌和擬桿菌數(shù)量顯著增加（<0.05），雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著降低（<0.05）；與IgAN組比較，Dex組和TWM組大鼠腸桿菌、腸球菌和擬桿菌數(shù)量顯著降低（<0.05），且TWM組低于Dex組（<0.05），雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著增加（<0.05），且TWM組高于Dex組（<0.05），見表3。

表3　各組大鼠腸道菌群數(shù)量比較

*<0.05NC group;#<0.05IgAN group;△<0.05Dex group.

4　各組大鼠外周血中TNF-α、Baff和IL-17水平及Treg比例的比較

與NC組比較， IgAN組大鼠外周血中TNF-α、Baff及IL-17水平顯著增加， Treg比例顯著降低（<0.05）；與IgAN組比較， Dex組和TWM組大鼠外周血中TNF-α、Baff及IL-17水平顯著降低，且TWM組低于Dex組（<0.05）， Treg比例顯著增加，且TWM組高于Dex組（<0.05），見表4。

表4　各組大鼠外周血中TNF-α、Baff和IL-17水平及Treg比例的比較

*<0.05NC group;#<0.05IgAN group;△<0.05Dex group.

5　各組大鼠腸黏膜組織中C1GALT1和Cosmc蛋白表達水平的比較

與NC組比較， IgAN組大鼠腸黏膜組織中C1GALT1和Cosmc蛋白表達水平顯著降低（<0.01）；與IgAN組比較， Dex組和TWM組大鼠腸黏膜組織C1GALT1和Cosmc蛋白表達水平顯著增加（<0.05），且TWM組高于Dex組（<0.05），見圖1。

Figure 1.　Western blot was used to detect the protein expression of C1GALT1 and Cosmc in the intestinal mucosa. Mean±SD. n=12. *P<0.05, **P<0.01 vs NC group; #P<0.05 vs IgAN group; △P<0.05 vs Dex group.

討論

雷公藤屬衛(wèi)矛科植物， TWM是其主要活性成分，可通過降低尿蛋白排泄、抑制腎間質(zhì)纖維化而保護腎小管，改善腎功能，對免疫相關(guān)性腎炎等有一定治療作用［11］。申鵬霄等［12］研究報道， TWM片可通過抑制炎癥因子TNF-α和IL-6分泌，下調(diào)TGF-β1表達，降低尿蛋白、SCr和BUN水平，改善IgAN大鼠腎功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較， IgAN組大鼠24 h UTP、尿紅細胞數(shù)、SCr和BUN水平顯著增加，提示IgAN模型大鼠造模成功，可用于后續(xù)實驗；與IgAN組比較， Dex組和TWM組大鼠24 h UTP、尿紅細胞數(shù)、SCr和BUN水平顯著降低，且TWM組低于Dex組，提示TWM可顯著減輕血尿、蛋白尿等臨床癥狀，可能對IgAN大鼠有較好的治療作用。

IgAN是一種免疫性疾病，主要病理表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)沉積IgA1免疫復(fù)合物，目前公認為Gd-IgA1，進而從觸發(fā)炎癥反應(yīng)引起腎損害，出現(xiàn)蛋白尿和血尿等癥狀［13-14］。沈姣姣等［15］研究報道，與空白對照組比較， IgAN大鼠血清IgA和Gd-IgA1水平升高、腸黏膜組織中C1GALT1和Cosmc蛋白水平顯著降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較， IgAN組大鼠血清IgA1和Gd-IgA1水平顯著增加，腸黏膜組織中C1GALT1和Cosmc蛋白表達水平顯著降低，提示IgAN發(fā)生可能與IgA1水平及C1GALT1和Cosmc蛋白表達異常有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，與IgAN組比較， TWM可降低IgAN大鼠血清IgA1和Gd-IgA1水平，升高腸黏膜組織C1GALT1和Cosmc蛋白表達水平，且優(yōu)于Dex。C1GALT1是-聚糖合成第二步反應(yīng)的關(guān)鍵酶， Cosmc是其特異性分子伴侶，可調(diào)控C1GALT1活性，使其正常催化半乳糖基（galactose， Gal）連接到-乙酰半乳糖胺（-acetylgalactosamine， GalNAc）形成Gal-B'3GalNAc即T抗原［16］。IgAN發(fā)生可能使Cosmc功能異常，C1GALT1活性喪失，導(dǎo)致IgA1鉸鏈區(qū)-半乳糖基化降低，導(dǎo)致Gd-IgA1在腎臟沉積，促進IgAN發(fā)生發(fā)展。這提示TWM可能通過增加C1GALT1/Cosmc通路活性降低IgAN大鼠IgA異常糖基化水平，減輕其血尿、蛋白尿等臨床癥狀。

人體腸道存在超過100萬億細菌，不同菌群在腸道定植位點不同，功能亦不同，不同菌群共生構(gòu)成腸道微生態(tài)環(huán)境。腸道菌群與宿主營養(yǎng)、代謝、免疫功能等密切相關(guān)，正常腸道菌群對維持機體健康至關(guān)重要。近來研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)與肥胖、高血壓、腸炎性疾病、腫瘤、免疫性疾病、慢性腎病等多種疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)［17-19］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較， IgAN組大鼠腸道腸桿菌、腸球菌和擬桿菌數(shù)量顯著增加，雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著降低； TWM可降低大鼠腸桿菌、腸球菌和擬桿菌數(shù)量，增加雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量，且優(yōu)于Dex，提示TWM可改善IgAN大鼠腸道微生態(tài)。本研究還發(fā)現(xiàn)，與NC組比較， IgAN組大鼠外周血中TNF-α、Baff和IL-17水平顯著增加， Treg比例顯著降低； TWM可降低IgAN組大鼠外周血中TNF-α、Baff和IL-17水平，升高Treg比例，且優(yōu)于Dex。腸道微生態(tài)紊亂可引起機體免疫功能失調(diào)，導(dǎo)致正常菌群作為外來抗原，刺激淋巴細胞增殖分化，激活的淋巴細胞釋放出IL-1、IL-2、TNF-α等多種細胞因子，而Baff是機免疫功能異常的標志，其表達升高可進一步促進TNF-α等炎癥因子分泌，增強腎小管炎癥反應(yīng)［20］。機體免疫反應(yīng)異常亦可能與IgAN本身有關(guān)，徐光標等［21］研究報道，TWM可降低CD4+/CD8+T細胞比值，改善糖尿病腎病免疫失衡狀態(tài)，抑制TNF-α等炎癥因子表達，減輕腎臟病變。Chen等［22］報道， TWM可通過調(diào)節(jié)輔助性Th17細胞/Treg細胞平衡，降低血清IL-17水平，減輕IgAN大鼠炎癥反應(yīng)。綜合以上研究及本研究結(jié)果提示， TWM可能通過改善IgAN大鼠腸道菌群狀態(tài)，提升其免疫功能，進而減輕疾病臨床癥狀。

綜上所述， TWM可通過促進C1GALT1/Cosmc通路激活降低IgA異常糖基化水平，并減輕腸道菌群紊亂和免疫功能失調(diào)，從而發(fā)揮對IgAN大鼠的治療作用。本研究可能對臨床IgAN治療有一定參考價值，但尚存在不足，關(guān)于TWM臨床使用劑量及安全性有待進一步驗證。

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Effect ofmultiglucoside on intestinal flora and immune function in IgA nephropathy rats based on C1GALT1/Cosmc pathway

REN Rui-ying1， HAN Xue1， SONG Chun-dong2

（1，，450018，；2，，450000，）

To investigate the effects ofmultiglucoside （TWM） on intestinal flora and immune function in IgA nephropathy （IgAN） rats based on core 1 β1，3-galactosyltransferase （C1GALT1） and its chaperone protein Cosmc （C1GALT1/Cosmc pathway）.The rat model of IgAN was established， and the animals were randomly divided into model group （IgAN group）， dexamethasone （Dex） group and TWM group. Normal rats served as normal control （NC） group. The levels of serum creatinine （SCr） and blood urea nitrogen （BUN）， 24-hour urinary total protein （24 h UTP） and the number of urinary red blood cells were measured by automatic biochemical analyzer. The levels of serum IgA1， and plasma tumor necrosis factor-α （TNF-α）， B-cell activating factor （Baff） and interleukin-17 （IL-17） were detected by ELISA. The level of galactose-deficient IgA1 （Gd-IgA1） was detected bylectin affinity ELISA. The intestinal colony was cultured in selective bacterial medium. The ratio of CD4+CD25+regulatory T cells （Treg） to CD4+T cells （Treg proportion） in peripheral blood mononuclear cells （PBMC） was detected by flow cytometry.Western blot was used to determine the protein expression of C1GALT1 and Cosmc in intestinal mucosa.Compared with NC group， 24 h UTP， the number of urinary red blood cells， SCr， BUN， serum IgA1 and Gd-IgA1， the numbers of，and， and the levels of TNF-α， Baff and IL-17 in plasma in IgAN group were significantly increased （<0.05）， while the numbers ofand， the Treg proportion in PBMC， and the protein expression levels of C1GALT1 and Cosmc in intestinal mucosa were significantly decreased （<0.05）. Compared with IgAN group， 24 h UTP， the number of urinary red blood cells， SCr， BUN， serum IgA1 and Gd-IgA1， the numbers of，and， and the levels of TNF-α， Baff and IL-17 in plasma in Dex group and TWM group were significantly reduced （<0.05）， and those in TWM group were lower than those in Dex group （<0.05）. Moreover， the numbers ofand， the Treg proportion in PBMC， and the protein expression levels of C1GALT1 and Cosmc in intestinal mucosa were significantly elevated （<0.05）， and those in TWM group were higher than those in Dex group （<0.05）.TWM reduces the abnormal glycosylation level of IgA in IgAN rats by promoting the activation of C1GALT1/Cosmc pathway， and attenuates the intestinal flora disorder and immune dysfunction in IgAN rats， thus exerting the therapeutic effect.

multiglucoside； IgA nephropathy； C1GALT1/Cosmc pathway； Intestinal flora； Immune function

R692.9； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.018

1000-4718（2020）11-2050-06

2020-03-18

2020-05-12

河南省教育廳（No.202102310494）；河南省中醫(yī)藥管理局科技攻關(guān)普通項目（No.2018JDZX017）

Tel: 13838050228; E-mail: scd670918@126.com

（責任編輯：余小慧，羅森）