張杰， 黃興曉， 池菊芳

Aβ1-40通過激活MAPKs通路誘導(dǎo)血管平滑肌細胞發(fā)生炎癥及表型轉(zhuǎn)化*

張杰， 黃興曉▲， 池菊芳△

［紹興市人民醫(yī)院（浙江大學(xué)紹興醫(yī)院）心內(nèi)科，浙江紹興 312000］

探究β-淀粉樣蛋白1-40 （Aβ1-40）對血管平滑肌細胞（VSMCs）的炎癥反應(yīng)、活力、遷移能力及表型轉(zhuǎn)化的影響，并分析其機制。以不同濃度的Aβ1-40干預(yù)VSMCs適當(dāng)時間。用CCK-8和Transwell實驗評估細胞的活力及遷移能力；用Western blot檢測細胞中白細胞介素1β （IL-1β）和腫瘤壞死因子α （TNF-α）等炎癥因子水平， VSMCs表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、骨橋蛋白（OPN）和Krüppel樣因子4 （KLF4）的表達，以及絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路相關(guān)蛋白p-p38 MAPK、p-ERK1/2和p-JNK的蛋白水平。在Aβ1-40的作用下， VSMCs中炎癥因子IL-1β和TNF-α水平顯著升高，表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達發(fā)生改變， α-SMA表達水平顯著下降，而OPN和KLF4的表達水平顯著升高（<0.05）；且在一定濃度范圍內(nèi)， Aβ1-40可提高VSMCs的活力和遷移能力；另外，Aβ1-40處理可顯著增加VSMCs中p-p38 MAPK、p-ERK1/2和p-JNK的蛋白水平（<0.05）。應(yīng)用MAPKs相應(yīng)的抑制劑可顯著降低IL-1β和TNF-α表達水平（<0.05），并抑制細胞表型轉(zhuǎn)化，即α-SMA表達水平顯著升高， OPN和KLF4表達水平顯著下降（<0.05）。Aβ1-40可通過激活MAPKs通路誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生炎癥反應(yīng)和表型轉(zhuǎn)化。

β-淀粉樣蛋白1-40；血管平滑肌細胞；炎癥；表型轉(zhuǎn)化；MAPKs信號通路

β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein， Aβ）在腦內(nèi)的沉積是阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）的重要發(fā)生機制之一，其中Aβ1-40和Aβ1-42在AD的病理過程中顯得尤為重要［1-2］。且隨著研究的深入，上述兩種淀粉樣蛋白在AD中的具體定位日漸清晰。Aβ1-40主要通過與腦血管較高的親和力而沉積于血管，造成大腦淀粉樣血管病（cerebral amyloid angiopathy， CAA），這是一種AD的標(biāo)志性病變，進而促進AD的進展［3］； Aβ1-42則更多的是沉積在腦組織而發(fā)揮其作用［4］。然而Aβ1-40與腦血管的親和力并無特異性，預(yù)示其可能不僅僅只在腦血管中沉積，還可能在外周血管中也發(fā)揮促炎等作用。一項關(guān)于Aβ在全身血漿及組織中水平的研究顯示，在動脈粥樣硬化患者的主動脈壁上，Aβ1-40和Aβ1-42分別以75.3 ng/g和0.7 ng/g的含量存在于動脈粥樣硬化斑塊之中［5］。同時，最新資料也表明AD與心血管疾病（cardiovascular diseases， CVD）存在許多共享的病理機制， Aβ1-40在CVD中也同樣發(fā)揮著重要作用，而針對Aβ1-40代謝可能將成為一種有效的CVD治療方式［6］。但目前為止，僅有少量關(guān)于Aβ1-40與心血管疾病關(guān)系的研究，而細分到動脈粥樣硬化的研究更是寥寥無幾。據(jù)此，本研究主要探討Aβ1-40與動脈粥樣硬化的關(guān)系。另外，由于血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）在動脈粥樣硬化中發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用，因此本研究觀察Aβ1-40對VSMCs炎癥和表型轉(zhuǎn)化的影響，并探討絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPKs）信號通路［包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-egulated kinase， ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase， JNK）和p38 MAPK］在其中的作用。

材料和方法

1　實驗材料

VSMCs購自中國科學(xué)院。DMEM培養(yǎng)基購自Sigma；胎牛血清購自Gibco； Aβ1-40購自Abcam； SB203580、U0126、SP600125和CCK-8試劑盒均購自Mce； Transwell小室購自Corning； BCA試劑盒和ECL發(fā)光液購自碧云天公司；抗白細胞介素1β （interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α， TNF-α）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smoth muscle actin， α-SMA）、骨橋蛋白（osteopontin， OPN）、Krüppel樣因子4 （Krüppel-like factor 4， KLF4）、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK抗體均購自Abcam。

2　實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基（Sigma）培養(yǎng)VSMCs。細胞置于37℃、5% CO2加濕培養(yǎng)箱之中。

2.2細胞干預(yù)為探究不同濃度Aβ1-40對VSMCs的作用，將VSMCs隨機分為4組：（1）對照（control）組，給予正常培養(yǎng)基；（2） 0.5 μmol/L Aβ1-40組，培養(yǎng)基中含0.5 μmol/L Aβ1-40；（3） 2.5 μmol/L Aβ1-40組，培養(yǎng)基中含2.5 μmol/L Aβ1-40；（4） 5.0 μmol/L Aβ1-40組，培養(yǎng)基中含5.0 μmol/L Aβ1-40。為探究MAPKs信號通路在Aβ1-40所致VSMCs炎癥和表型轉(zhuǎn)化中的作用，將VSMCs隨機分為5組：（1）對照組，給予正常培養(yǎng)基；（2） Aβ1-40組，培養(yǎng)基中含2.5 μmol/L Aβ1-40；（3） Aβ1-40+SB203580組，在用2.5 μmol/L Aβ1-40干預(yù)VSMCs之前，用20 μmol/L p38 MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理細胞30 min；（4） Aβ1-40+U0126組，在用2.5 μmol/L Aβ1-40干預(yù)VSMCs之前，用20 μmol/L ERK1/2抑制劑U0126預(yù)處理細胞30 min；（5） Aβ1-40+SP600125組，在用2.5 μmol/L Aβ1-40干預(yù)VSMCs之前，用20 μmol/L JNK抑制劑SP600125組預(yù)處理細胞30 min。干預(yù)適當(dāng)時間后，終止培養(yǎng)，進行后續(xù)實驗分析。

2.3CCK-8實驗檢測細胞活力將VSMCs以每孔6 000個的密度種植于96孔板中，待細胞貼壁之后，分別予以不同濃度的Aβ1-40進行干預(yù)。0、24、36和48 h之后，每孔避光加入10 μL的CCK-8液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，最后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（）值。

2.4Transwell實驗檢測細胞的遷移能力將Transwell小室置于24孔板中，上室以5×104細胞密度種植VSMCs（無血清培養(yǎng)基），下室加入600 μL含5%胎牛血清及不同濃度Aβ1-40的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后進行結(jié)晶紫染色，隨后置于倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)。

2.5Western blot檢測蛋白水平用RIPA裂解液提取各實驗組蛋白，隨后用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定并配平。以10% SDS-PAGE進行蛋白分離，之后轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1 h，隨后加入相應(yīng)I抗（抗IL-1β、TNF-α、α-SMA、OPN、KLF4、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK抗體）4℃孵育過夜。第2天加入相應(yīng)II抗室溫孵育2 h，最后加ECL發(fā)光液于自動曝光機下進行曝光。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及Tukey法。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　Aβ1-40可促進VSMCs發(fā)生炎癥反應(yīng)

以不同濃度的Aβ1-40干預(yù)血管平滑肌細胞24 h之后，評估各組細胞炎癥水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著Aβ1-40濃度的逐漸增加，VSMCs的炎癥因子（IL-1β和TNF-α）水平逐漸升高（<0.05），見圖1。這提示Aβ1-40可促進VSMCs發(fā)生炎癥反應(yīng)，且呈濃度依賴性。

Figure 1.　Effects of Aβ1-40 on inflammation of VSMCs. The protein expression levels of IL-1β and TNF-α were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

2　Aβ1-40對VSMCs活力及遷移能力的影響

以不同濃度的Aβ1-40干預(yù)血管平滑肌細胞，分別于0 h、24 h、36 h和48 h之后用CCK-8實驗檢測細胞活力。結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)（<2.5 μmol/L），隨著Aβ1-40濃度的增加，VSMCs的活力逐漸升高（<0.05）；但當(dāng)以更高濃度（5 μmol/L）的Aβ1-40處理VSMCs時， VSMCs活力下降，見圖2A。用不同濃度Aβ1-40干預(yù)VSMCs 24 h后， Transwell實驗結(jié)果顯示，一定濃度范圍內(nèi)（<2.5 μmol/L），隨著Aβ1-40濃度的增加，VSMCs的遷移能力逐漸增強（<0.05）；而以更高濃度（5 μmol/L）的Aβ1-40干預(yù)細胞，VSMCs的遷移能力下降，見圖2B。這些結(jié)果提示，在一定濃度范圍內(nèi)，Aβ1-40可增強VSMCs的活力和遷移能力。

Figure 2.　Effect of Aβ1-40 on the viability and migration ability of VSMCs. A: the viability of VSMCs treated with different concentrations (0.5, 2.5 and 5.0 μmol/L) of Aβ1-40 was measured by CCK-8 assay; B: the migration ability of VSMCs was detected by Transwell assay. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs 2.5 μmol/L Aβ1-40 group.

3　Aβ1-40可促進VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化

以不同濃度的Aβ1-40干預(yù)VSMCs 24 h之后，檢測各組細胞表型轉(zhuǎn)化指標(biāo)α-SMA、OPN和KLF4的表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著Aβ1-40濃度的逐漸增加， α-SMA表達水平逐漸下降，而OPN和KLF4的表達水平逐漸升高（<0.05），見圖3。這提示Aβ1-40可促進VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，且呈濃度依賴性。

Figure 3.　Effect of Aβ1-40 on phenotypic switching of VSMCs. The protein expression levels of α-SMA, OPN and KLF4 were determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

4　Aβ1-40通過MAPKs信號通路發(fā)揮其作用

以不同濃度的Aβ1-40干預(yù)VSMCs 24 h之后，檢測各組細胞MAPKs信號通路活性。Western blot結(jié)果顯示，隨著Aβ1-40濃度的逐漸提高， p-p38 MAPK、p-ERK1/2和p-JNK蛋白水平均逐漸增加（<0.05），而總p38 MAPK、ERK1/2和JNK的蛋白水平無顯著變化，提示p38 MAPK、ERK1/2和JNK通路的逐漸激活，見圖4。該結(jié)果表明MAPKs系列通路參與了Aβ1-40對VSMCs的作用過程。

Figure 4.　Effect of Aβ1-40 on activation of MAPKs pathway in VSMCs. The relevant protein levels of p38 MAPK, p-p38 MAPK, ERK1/2, p-ERK1/2, JNK and p-JNK were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

5　抑制MAPKs信號通路可緩解Aβ1-40誘導(dǎo)的VSMCs炎癥反應(yīng)和表型轉(zhuǎn)化

為進一步驗證MAPKs信號通路在Aβ1-40誘導(dǎo)的VSMCs炎癥和表型轉(zhuǎn)化中的作用，我們使用p38 MAPK、ERK1/2和JNK的特異性抑制劑SB203580、U0126和SP600125對細胞進行預(yù)處理，之后再以2.5 μmol/L Aβ1-40干預(yù)VSMCs。結(jié)果顯示，與Aβ1-40組相比，3種通路抑制劑均能顯著降低VSMCs的炎癥水平（IL-1β和TNF-α水平下降），并抑制細胞的表型轉(zhuǎn)化（α-SMA表達升高，OPN和KLF4表達下降），見圖5。此結(jié)果進一步證實了MAPKs信號通路在Aβ1-40誘導(dǎo)的VSMCs的炎癥和表型轉(zhuǎn)化中的作用，并且阻斷上述通路可顯著抑制VSMCs的功能變化。

Figure 5.　Effects of specific inhibitors of MAPKs signaling pathway on Aβ1-40-induced changes in VSMCs. The protein levels of IL-1β, TNF-α, α-SMA, OPN and KLF4 were determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs Aβ1-40 group.

討論

動脈粥樣硬化是一種常見的心血管疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜多樣，但可以明確的是炎癥和VSMCs的增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化在其中發(fā)揮著重要作用［7］。而同為系統(tǒng)退行性病變， AD被越來越多的研究證明與動脈粥樣硬化之間存在許多共性及聯(lián)系［8］。Aβ1-40作為AD的標(biāo)志性蛋白之一，因其對冠心病和心力衰竭等心血管疾病的促進作用，吸引了大量心血管學(xué)者的關(guān)注［9-10］，但目前尚無明確研究揭示其在動脈粥樣硬化中的作用。本實驗用不同濃度Aβ1-40處理VSMCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aβ1-40可以導(dǎo)致VSMCs發(fā)生炎癥反應(yīng)，促進VSMCs增殖和遷移并誘導(dǎo)其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，且存在濃度依賴性。

MAPKs是一類廣泛表達于真核生物的絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括ERK1/2、JNK和p38 MAPK三個家族成員［11］。MAPKs可接受多種細胞外信號刺激，并通過逐層級聯(lián)磷酸化激活導(dǎo)致下游一系列反應(yīng)，進而調(diào)控細胞炎癥、增殖和分化等活動［12］。我們通過對MAPKs家族磷酸化水平的檢測及相應(yīng)抑制劑的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)， ERK1/2、JNK及p38 MAPK信號通路均參與了Aβ1-40誘導(dǎo)的VSMCs變化，而抑制相應(yīng)的通路則可降低VSMCs的炎癥水平和表型轉(zhuǎn)化程度。

綜上所述，本研究證明了Aβ1-40可誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生炎癥反應(yīng)和表型轉(zhuǎn)化，且在一定濃度內(nèi)可促進VSMCs的活力和遷移，而這個過程中MAPKs信號通路發(fā)揮了重要作用。我們的結(jié)果可能會為動脈粥樣硬化的治療提供一種新思路。然而，動物及臨床等進一步研究還有待開展。

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Aβ1-40 induces inflammation and phenotypic switching via activation of MAPKs signaling pathway in vascular smooth muscle cells

ZHANG Jie， HUANG Xing-xiao， CHI Ju-fang

［，（，），312000，］

To investigate the effects of amyolid β-protein 1-40 （Aβ1-40） on inflammation， viability， migration and phenotypic switching in vascular smooth muscle cells （VSMCs）， and to analyze the underlying mechanisms.The VSMCs were treated with Aβ1-40 at different concentration gradients for appropriate time. CCK-8 and Transwell assays were performed to evaluate the viability and migration ability of VSMCs. The levels of inflammatory factors including interleukin-1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α）， phenotypic switching-related proteins including α?smooth muscle actin （α?SMA）， osteopontin （OPN） and Krüppel?like factor 4 （KLF4）， and mitogen-activated protein kinases （MAPKs） signaling pathway-related proteins including p-p38 MAPK， p-ERK1/2 and p-JNK were determined by Western bolt.After Aβ1-40 treatment， the levels of inflammatory factors IL-1β and TNF-α in the VSMCs were significantly increased （<0.05）， and the expression of phenotypic switching-related proteins was altered， as indicated by down-regulation of α?SMA and up-regulation of OPN and KLF4 （<0.05）. Treatment with Aβ1-40 within a certain concentration range promoted the viability and migration of the VSMCs. In addition， the protein levels of p-p38 MAPK， p-ERK1/2 and p-JNK were significantly increased by Aβ1-40 treatment （<0.05）. Furthermore， pretreatment with specific inhibitors of MAPKs pathway significantly reduced the levels of IL-1β and TNF-α （<0.05）， and inhibited the phenotypic switching， as indicated by up-regulation of α?SMA and down-regulation of OPN and KLF4 （<0.05）.Treatment with Aβ1-40 induces the inflammation and phenotypic switching in VSMCs via activation of MAPKs signaling pathway.

Amyolid β-protein 1-40；Vascular smooth muscle cells； Inflammation； Phenotypic switching； MAPKs signaling pathway

R749.1+6； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.007

1000-4718（2020）11-1966-06

2020-04-27

2020-07-01

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81873120）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研資助項目（No.2018KY172）

Tel： 0575-88228888； E-mail： chijufang@zju.edu.cn

▲共同第一作者:并列第1作者

（責(zé)任編輯：宋延君，羅森）