黃政， 涂榮會， 鐘國強， 方存明， 馬小林， 胡學(xué)俊

缺氧后適應(yīng)中HSP90對補體介導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用*

黃政1，2， 涂榮會2△， 鐘國強2， 方存明1， 馬小林1， 胡學(xué)俊1

（1宣城市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 宣城 242000；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣西 南寧 530022）

探討缺氧后適應(yīng)（HPC）中熱休克蛋白90 （HSP90）對補體介導(dǎo)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷的作用及機(jī)制。大鼠H9c2心肌細(xì)胞按處理方式不同分為7組：（1）對照組（常氧培養(yǎng)10 h）；（2） H/R組（缺氧4 h后復(fù)氧6 h）；（3） HPC組（缺氧4 h后行復(fù)氧5 min/缺氧5 min，重復(fù)3次，再復(fù)氧6 h）；（4） HPC+格爾德霉素（GA）組（缺氧前20 min加入1 μmol/L的HSP90特異性抑制劑GA后行HPC）；（5）陰性對照組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒后行HPC）；（6） C3過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染C3a質(zhì)粒后行HPC）；（7） C5過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染C5a質(zhì)粒后行HPC）。采用Hoechst 33242染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡， Western blot檢測HSP90、C3a、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。HPC在上調(diào)HSP90的同時顯著減少H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并抑制C3a、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6和Bax的表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)，上述效應(yīng)可被GA阻斷。過表達(dá)C3a和C5a后HPC對NF-κB p65表達(dá)及細(xì)胞凋亡的抑制作用被抵消。HPC中HSP90通過補體/NF-κB信號通路減輕H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷。

缺氧后適應(yīng)；缺血再灌注損傷；熱休克蛋白90；補體；炎癥

再灌注治療是挽救缺血心肌，改善急性心肌梗死預(yù)后的最有效措施。然而，心肌血流恢復(fù)的同時也常伴隨不同程度的缺血再灌注損傷，由其導(dǎo)致的心律失常、無復(fù)流、心肌頓抑、心肌細(xì)胞凋亡和壞死等極大地降低了再灌注治療帶來的獲益。缺血后適應(yīng)（hypoxic postconditioning， HPC）是被大量研究證實能夠有效減輕心肌缺血再灌注損傷的方法，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)多種促生存的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及蛋白激酶有關(guān)［1-3］。近年來的研究表明，免疫炎癥反應(yīng)的過度激活是心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，缺血后適應(yīng)可能通過抑制免疫炎癥反應(yīng)參與再灌注心肌的保護(hù)［4］，然而具體機(jī)制仍有待闡明。

補體系統(tǒng)激活是心肌缺血再灌注損傷的重要特征。補體激活后除直接造成心肌細(xì)胞損傷外，還可激活NF-κB等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)下游炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、壞死［5］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，缺血后適應(yīng)能夠上調(diào)熱休克蛋白90 （heat shock protein 90， HSP90）表達(dá)，減輕缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡、壞死。然而，HPC中HSP90對補體系統(tǒng)是否具有調(diào)節(jié)作用，目前尚不明確。

本研究通過建立離體心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation， H/R）損傷模型，實施IPC，體外模擬心肌缺血再灌注損傷，從細(xì)胞水平探討缺血后適應(yīng)心肌保護(hù)作用的機(jī)制。

材料和方法

1　材料

大鼠H9c2心肌細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco； Lipofectamine 2000試劑盒購自Invitrogen； C3a和C5a過表達(dá)質(zhì)粒載體購自Addgene；格爾德霉素（geldanamycin， GA）購自Sigma；大鼠抗腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細(xì)胞介素1β （interleukin-1β， IL-1β）、IL-6、C3a、C5a、NF-κB p65、Bcl-2、Bax和β-actin抗體購自北京博奧森； Hoechst 33242染色和BCA試劑盒購自上海碧云天； annexin V/APC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基。

2　方法

2.1細(xì)胞處理及分組H9c2心肌細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。細(xì)胞缺氧時更換為DMEM無糖培養(yǎng)基，并置于含5% CO2、95% N2混合氣體的厭氧罐中。細(xì)胞復(fù)氧時再次更換為DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中。按處理方式不同分為7組：（1）對照（control）組（常氧培養(yǎng)10 h）；（2） H/R組（缺氧4 h后復(fù)氧6 h）；（3） HPC組（缺氧4 h后行復(fù)氧5 min/缺氧5 min，重復(fù)3次，再復(fù)氧6 h）；（4） GA+HPC組（缺氧前20 min加入1 μmol/L GA后行HPC）；（5）陰性對照（negative control， NC）組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒48 h后行HPC）；（6） C3過表達(dá)組（C3組，轉(zhuǎn)染C3a質(zhì)粒載體后行HPC）；（7） C5過表達(dá)組（C5組，轉(zhuǎn)染C5a質(zhì)粒載體后行HPC）。

2.2Hoechst 33242染色觀察細(xì)胞形態(tài)取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)至約80%融合時進(jìn)行分組處理。處理結(jié)束后棄去培養(yǎng)基， PBS漂洗后加入4%多聚甲醛，室溫固定10 min，再加入終濃度為10 mg/L的Hoechst 33242染色液，避光染色5 min后加入抗熒光淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡各組細(xì)胞胰酶消化，離心后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，加入適量的1×結(jié)合緩沖液輕輕吹打重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL annexin V-APC，混勻，室溫孵育15 min。再加入5 μL PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.4Western blot檢測蛋白表達(dá)各組細(xì)胞加入RIPA裂解液中冰上裂解30 min，14 000 r/min離心10 min后取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白上樣，SDS-PAGE分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入Ⅰ抗溶液（濃度1∶1 000）中4℃孵育過夜，再加入Ⅱ抗溶液室溫孵育1 h。經(jīng)洗滌、顯影、灰度掃描后，用Odyssey 3.0軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值測定。蛋白的表達(dá)量以目的條帶與β-actin的灰度比值表示。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析處理全部數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示；多組間比較采用單因素方差分析法，采用SNK-法進(jìn)行組間兩兩比較。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　HPC上調(diào)H9c2心肌細(xì)胞HSP90表達(dá)

與control組比較， H/R組HSP90表達(dá)顯著增多（<0.05）； HPC組HSP90表達(dá)較H/R組進(jìn)一步增多（<0.05），而GA+HPC組HSP90表達(dá)較HPC組顯著減少（<0.05），見圖1。

Figure 1.　Relative expression levels of HSP90 in different groups. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs H/R group; △P<0.05 vs HPC group.

2　HPC中HSP90對H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33342染色可見control組細(xì)胞核形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形，淡藍(lán)色，未見凋亡細(xì)胞； H/R組可見較多細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白的凋亡細(xì)胞； HPC組凋亡細(xì)胞較H/R組明顯減少； GA+HPC組凋亡細(xì)胞較HPC組明顯增多，見圖2。

Figure 2.　Morphological changes in the nucleus observed by Hoechst 33342 staining (×200). Apoptotic cells showed condensation of chromatin and nuclear fragmentations.

與Hoechst染色結(jié)果一致，流式細(xì)胞術(shù)檢測H/R組的凋亡細(xì)胞均較control組顯著增多（<0.05）；與H/R組比較， HPC組的凋亡細(xì)胞顯著減少（<0.05）；而GA+HPC組的凋亡細(xì)胞較HPC組顯著增多（<0.05），見圖3。

Figure 3.　Apoptosis of the H9c2 cells determined by flow cytometry. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs H/R group; △P<0.05 vs HPC group.

3　HPC中HSP90對補體C3a/C5a和NF-κB表達(dá)的影響

H/R組補體C3a、C5a和NF-κB表達(dá)較control組顯著增多（<0.05）；與H/R組比較， HPC組C3a、C5a和NF-κB表達(dá)較H/R顯著減少（<0.05）；而GA+HPC組C3a、C5a和NF-κB表達(dá)較HPC組顯著增多（<0.05），見圖4。

Figure 4.　The protein expression of C3a, C5a and NF-κB was detected by Western blot. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs H/R group; △P<0.05 vs HPC group.

4　HPC中HSP90對炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響

與control組比較，H/R組TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)顯著升高（<0.05）； HPC組TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)顯著低于H/R組（<0.05），而GA+HPC組的TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)顯著高于HPC組（<0.05），見圖5。

5　HPC中HSP90對Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

H/R組的Bcl-2表達(dá)顯著低于control組（<0.05）， Bax表達(dá)顯著高于control組（<0.05）；與H/R組比較， HPC組Bcl-2表達(dá)顯著升高（<0.05）， Bax表達(dá)顯著下降（<0.05）；而GA+HPC組Bcl-2表達(dá)較HPC組顯著下降（<0.05）， Bax表達(dá)較HPC組顯著升高（<0.05），見圖5。

Figure 5.　The results of Western blot showed the effects of HSP90 on the expression of TNF-α, IL-1β, IL-6, Bcl-2 and Bax in the H9c2 cells. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs H/R group; △P<0.05 vs HPC group.

6　HPC中補體-NF-κB信號通路對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的影響

轉(zhuǎn)染C3a過表達(dá)質(zhì)粒載體后C3a的表達(dá)較陰性對照組顯著增多（<0.05），同時NF-κB p65的表達(dá)顯著增多（<0.05），心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（<0.05）。轉(zhuǎn)染C5a過表達(dá)質(zhì)粒載體后C5a表達(dá)較陰性對照組顯著增多（<0.05），同時NF-κB p65的表達(dá)顯著增多（<0.05），H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率顯著升高（<0.05），見圖6。

Figure 6.　The effects of C3a and C5a over-expression on the expression of NF-κB in the H9c2 cells and H9c2 cell apoptosis. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NC group.

討論

本研究探討了HPC減輕H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的作用及機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)， HPC在增加HSP90表達(dá)的同時顯著減少H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并抑制補體系統(tǒng)激活及炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，而這種效應(yīng)可被HSP90特異性抑制劑格爾德霉素阻斷。研究結(jié)果提示，HPC可能通過上調(diào)HSP90表達(dá)減輕補體介導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷及免疫炎癥反應(yīng)。

補體系統(tǒng)異常激活是缺血再灌注損傷的重要病理生理特征。補體激活后除通過攻膜復(fù)合體直接造成細(xì)胞損傷外，一些補體成分和裂解片段還可通過NF-κB、ERK1/2和JNK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)TNF-α、IL-1和IL-6等炎癥因子表達(dá)，間接導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡、壞死［5-6］。因此，抑制補體系統(tǒng)激活可能有助于減輕缺血再灌損傷、改善再灌注治療的預(yù)后。已有多個研究報道，應(yīng)用補體抑制劑或敲除補體基因可減少缺血再灌注動物模型心肌細(xì)胞凋亡、壞死，縮小心肌梗死面積，改善心臟功能［7-10］。Tanhehco等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理可顯著減少兔缺血再灌注局部心肌C1、C3、C8和C9的mRNA表達(dá)，減小心肌梗死面積。缺血預(yù)適應(yīng)與缺血后適應(yīng)均是被大量研究證實能夠有效減輕心肌缺血再灌注損傷的措施，兩者作用機(jī)制有許多類似之處。然而，缺血后適應(yīng)能否作用于補體系統(tǒng)，目前尚無報道。本研究從離體細(xì)胞水平探討HPC對心肌細(xì)胞補體系統(tǒng)的作用，研究發(fā)現(xiàn)HPC可顯著減少H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞C3和C5a表達(dá)及細(xì)胞凋亡，提示抑制補體系統(tǒng)激活可能是HPC心肌細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制的一部分。

大量白細(xì)胞浸潤引起過度放大的炎癥級聯(lián)反應(yīng)是缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一。炎癥反應(yīng)過程中釋放的一些炎癥因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等）可誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡、壞死和血管內(nèi)皮功能紊亂［12-14］。而補體系統(tǒng)對炎癥反應(yīng)具有促進(jìn)作用。補體激活過程中釋放的過敏毒素（如C3a、C5a等）和一些裂解片段具有很強的趨化效應(yīng)，可吸引大量具有相應(yīng)受體的白細(xì)胞向補體激活的區(qū)域聚集。另外，補體也可通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)下游炎癥細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等）表達(dá)，進(jìn)一步增強炎癥反應(yīng)［15］。缺血后適應(yīng)能夠減少缺血再灌注心肌炎癥細(xì)胞因子表達(dá)［4］，但具體機(jī)制仍有待研究。本研究中我們觀察到，HPC在抑制補體系統(tǒng)的同時伴隨有NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡的顯著減少，而過表達(dá)C3a和C5a后HPC對NF-κB和心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用被抵消，提示HPC的心肌細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)與抑制補體-NF-κB信號通路介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。

HSP90是細(xì)胞遭受不良刺激后新合成或合成增多的一種保護(hù)性蛋白，主要生物學(xué)功能是作為分子伴侶參與客戶蛋白的正確折疊、復(fù)性和移位，從而維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，防止細(xì)胞進(jìn)一步損傷。Sreedhar等［16］的研究發(fā)現(xiàn)， HSP90抑制劑GA、根赤殼菌素和順鉑等可增強補體介導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞裂解。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，缺氧（缺血）后適應(yīng)通過上調(diào) HSP90調(diào)節(jié)蛋白激酶C和線粒體縫隙連接蛋白43表達(dá)，減輕H/R心肌細(xì)胞及缺血再灌注心肌氧化應(yīng)激損傷［17-18］。然而， HPC上調(diào)HSP90表達(dá)的同時是否對補體及其介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)產(chǎn)生影響，此前尚無報道。在本研究中，心肌細(xì)胞遭受H/R損傷刺激后HSP90表達(dá)增多，HPC進(jìn)一步上調(diào)HSP90的同時顯著抑制C3和C5a表達(dá)，并減少NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6及促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，而應(yīng)用HSP90特異性抑制劑GA后這種效應(yīng)被抵消，提示缺血后處理抑制補體激活、免疫炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)HSP90有關(guān)。事實上，缺血再灌注時激活補體和炎癥反應(yīng)的始動因素是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，而后處理通過上調(diào)HSP90表達(dá)以及其他機(jī)制減輕了細(xì)胞損傷，進(jìn)而減輕了補體激活和免疫炎癥反應(yīng)。

綜上所述，HSP90介導(dǎo)HPC對H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，其機(jī)制可能為抑制補體-NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少補體-NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)及細(xì)胞凋亡。

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Effects of HSP90 on complement-mediated hypoxia/reoxygenation injury of H9c2 cardiomyocytes during hypoxic postconditioning

HUANG Zheng1，2， TU Rong-hui2， ZHONG Guo-qiang2， FANG Cun-ming1， MA Xiao-lin1， HU Xue-jun1

（1，，242000，；2，，530022，）

To investigate the effects and mechanisms of heat shock protein 90 （HSP90） on complement-mediated hypoxia/reoxygenation （H/R） injury of rat H9c2 cardiomyocytes during hypoxic postconditioning （HPC）.Rat H9c2 cardiomyocytes were divided into 7 groups according to different treatments：（1） control group （cultured for 10 h under normal oxygen）；（2） H/R group （hypoxia for 4 h and reoxygenation for 6 h）；（3） HPC group （3 cycles of 5 min H/R after hypoxia for 4 h， followed by reoxygenation for 6 h）；（4） HPC+geldanamycin （GA） group （1 μmol/L HSP90 inhibitor GA was added 20 min before HPC）；（5） negative control group （empty plasmid was transfected before HPC）；（6） C3 over-expression group （C3a plasmid was transfected before HPC）；（7） C5 over-expression group （C5a plasmid was transfected before HPC）. Morphological changes of the H9c2 cells were detected by Hoechst 33242 staining. The effects of HPC on the apoptosis of H9c2 cells were examined by flow cytometry. The protein levels of HSP90， C3a， C5a， NF-κB p65， TNF-α， IL-1β， IL-6， Bcl-2 and Bax were determined by Western blot.With up-regulation of HSP90， HPC significantly reduced H/R-induced apoptosis of the H9c2 cells， inhibited the expression of C3a， C5a， NF-κB p65， TNF-α， IL-1β， IL-6 and Bax， and increased the expression of Bcl-2. These effects were blocked by GA. The inhibitory effects of HPC on NF-κB p65 expression and H9c2 cell apoptosis were offset after over-expression of C3a or C5a.HSP90 attenuates H/R injury of H9c2 cardiomyocytes by inhibiting complement-NF-κB signaling pathway during HPC.

Hypoxic postconditioning； Ischemia/reperfusion injury； Heat shock protein 90； Complement； Inflammation

R329.2+5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.006

1000-4718（2020）11-1960-06

2020-02-11

2020-06-19

國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項目（No.81560068）；宣城市科技計劃項目（No.1817）

Tel： 13707885734； E-mail： 912881781@qq.com

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）