何雁鴻 廖平明 沈麗莉 劉歐亞 吳臘梅

intensive care unit

凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase negative staphylococcus,CNS)是臨床上重要的致病菌之一[1]。臨床調查結果顯示CNS的感染率呈逐漸升高的趨勢，其在革蘭陽性菌群中的檢出率可達30%以上[2,3]，這表明CNS耐藥性和治療困難性的增加。耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)報道逐漸增多，其檢出率甚至可高達90%[4-6]，并且MRCNS菌株藥敏結果顯示其具有多重耐藥性[4,5]，因此CNS的耐藥性分析提出新的挑戰(zhàn)。CNS的感染率在重癥患者以及免疫力低下(老年、兒童或者重癥患者)、內科病房、接受介入治療患者中的感染率較高[7-9]，據(jù)報道處于重癥監(jiān)護病房(ICU)的患者感染CNS以及MRCNS比例更高[6]。絕大多數(shù)CNS和MRCNS菌株對萬古霉素表現(xiàn)為敏感性，而部分ICU的MRCNS表現(xiàn)為萬古霉素耐藥性[6]，且表現(xiàn)為多重耐藥性[4,5]。因此，分析ICU和非ICU科室老年患者CNS在耐藥性上的差異，對2組CNS區(qū)別治療具有一定的臨床參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑 抗菌紙片和培養(yǎng)基購自英國Oxoid 公司；MicroScan WalkAway-40全自動微生物鑒定儀購自德國西門子公司；PCR檢測試劑盒、PCR引物、蛋白酶K均購自大連生工有限公司(中國)；PCR儀上海宏石SLAN96P；金黃色葡萄球菌(ATCC25923)購自上海市臨床檢驗中心。

1.2 菌株來源及培養(yǎng) 收集2016年6月至2018年6月在本院住院老年患者(年齡≥ 60歲)的臨床樣本，從血液、痰、腦脊液及其他體液標本的混合物中分離出100株CNS菌株，菌株的分離嚴格按照《全國檢驗技術操作規(guī)程》第3版標準進行菌株，采用MicroScan WalkAway-40全自動微生物鑒定儀鑒定菌株。所有菌株的培養(yǎng)均采用增菌培養(yǎng)法。

1.3 藥敏實驗 藥敏試驗采用美國臨床實驗室標準化委員會方法和判斷標準[10]進行Kirby-Bauer紙片擴散法實驗，檢測菌株對萬古霉素、替考拉寧、青霉素、氯霉素、克林霉素、慶大霉素、復方新諾明、左氧氟沙星、氨芐西林、紅霉素、四環(huán)素、頭孢唑啉，苯唑西林、利奈唑胺和亞胺培南等15種(英國Oxoid 公司)藥物的敏感性。根據(jù)CLSI判斷標準將藥敏實驗結果分為敏感(sensitivity,S)、中介(intermediary,I)、耐藥(resistance,R)3個類別進行統(tǒng)計。細菌耐藥率的計算：耐藥率=組內耐藥菌株數(shù)/檢測總株數(shù)×100%。

1.4 耐藥基因檢測 采用半定量PCR法測定CNS標本中的6個相關耐藥基因：mecA、aph(3’)-Ⅲ、tetM、aac(3’)/aph(2’’)、ermA和crf，收集細菌培養(yǎng)液400 μl，8 000 r/min離心 2 min，重懸菌液，菌株DNA抽提法采用一步法裂解液、100℃消煮10 min，12 000 r/min離心5 min，耐藥基因的檢測采用30 μl的PCR反應體系(含10 μl ddH2O、1 μl引物、17 μl mix和2 μl DNA模板)。PCR反應程序為：94℃預變性10 min；94℃變性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸60 s，共40個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。采用瓊脂糖凝膠(1%)電泳法檢測PCR結果，目標條帶陽性即認為耐藥基因陽性，耐藥檢驗的檢出率：耐藥基因菌株數(shù)/檢測總株數(shù)×100%。

1.5 細菌耐藥基因篩選 采用Illumina HiSeq2500測序平臺檢測1個CNS株中的基因。菌株DNA抽提如上述方法，采用試劑盒構建測序文庫，對測序樣本進行過濾、組裝和注釋，預測鑒定CNS基因組中的基因，并對所有基因進行功能富集分析(Gene Ontology 和KEGG pathway)，樣品準備，測序和數(shù)據(jù)分析由上海楚豫生物科技有限公司完成。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，ICU和非ICU組中CNS菌株的耐藥率比較采用χ2檢驗，2組患者年齡比較采用Mann-Whitney U 檢驗，對年齡是否為CNS耐藥性和抗生素敏感性的危險因素進行Logistiics 回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 菌株耐藥性和敏感性分析 100株CNS標本中，男性患者38份(38.00%)，平均年齡68歲(63～81歲)，其中mecA、aac(3’)/aph(2’’)、aph(3’)-Ⅲ和tetM 4個耐藥基因的檢出率分別為63%、85%、54%和65%，100株CNS標本中并未檢出Cfr和ermA?？股孛舾行苑治鼋Y果顯示，100株CNS中有89、85、78、46、36和35株對青霉素、氨芐西林、紅霉素、苯唑西林、復方磺胺、慶大霉素和左氧氟沙星耐藥，有95、96、74、73、73和64株CNS對氯霉素、利奈唑胺、亞胺培南、頭孢唑啉、四環(huán)素和左氧氟沙星敏感。未檢出萬古霉素耐藥株。見表1、2。

表1 患者基本資料和抗生素敏感性統(tǒng)計結果

2.2 ICU和非ICU組耐藥基因PCR陽性比較 ICU和非ICU科患者年齡和性別組成上差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ICU組MecA、aac(3’)/aph(2’’)、aph(3’)-Ⅲ PCR檢測陽性率均顯著高于非ICU組(P<0.05)。見表3、4。

表2 100株CoNS標本的抗生素敏感性分析結果 %

2.3 ICU和非ICU藥敏試驗結果比較 藥敏試驗結果顯示ICU組CNS對氨芐西林、苯唑西林、頭孢唑啉、慶大霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、克林霉素和復方磺胺的抗藥性較非ICU組高(P<0.05)，來自ICU科的26株(100%)CNS全部表現(xiàn)為青霉素和氨芐西林耐藥性，同時具有較高的紅霉素、左氧氟沙星和苯唑西林耐藥性，而非ICU組74株CNS對紅霉素、左氧氟沙星和苯唑西林耐藥性相對較低(P<0.05)。見表5。

表3 ICU和非ICU組患者性別和年齡比較

表4 ICU和非ICU組耐藥基因PCR檢測陽性率比較 株(%)

表5 ICU和非ICU組藥敏試驗比較 例(%)

2.4 年齡是CNS耐藥性和抗生素耐藥性的危險因素 2組Logistics回歸分析顯示年齡是mecA基因PCR陽性以及苯唑西林、頭孢唑啉、左氧氟沙星、亞胺培南和利奈唑胺耐藥性的獨立危險因素(P<0.05)。見表6。

2.5 CNS耐藥性相關基因分析 一株具有多重耐藥表型和基因型的細菌， Illumina HiSeq2500測序共得到17 313 955條clean reads，GC含量為33.67%。經(jīng)過注釋和篩選，共得到2 458個基因，其中包括銜接蛋白基因mecA及其復合體comK和clpc、異分支酸合酶men家族成員(A-F/H)、胱硫醚γ合酶基因mccB和 met家族成員(B/C/E/I/K/N/Q/X)。另外我們還篩選到幾個藥物耐性相關的基因及其家族，包括博來霉素抗藥性基因phnB/C/D/E；喹諾酮抗藥性基因norA/B/C；加氧西林抗性基因femA/B/X和fmhB；莰酮抗性基因crcB；耐藥外排蛋白基因emrE；季銨化合物耐性基因ykkC/D和smvA；以及氯霉素敏感性基因rarD等。同時我們還檢測到幾類重要的轉運因子，包括耐藥轉運因子lmrS、sdrM(MFS-type)；bceA/B、abcA(ABC type)；重金屬轉運因子znuA/B/C(ABC type)；砷轉運因子arsB；磷壁酸轉運因子tagD/E/F/G/H(ABC type)等。對這些基因的富集結果顯示，met 家族成員主要富集在“ABC transporters”和“Biosynthesis of antibiotics” 通路上而mecA、femA/B/X、fmhB 主要富集在“Peptidoglycan biosynthesis”通路上，mecA基因與“beta-lactam resistance”有關。見表7。

表6 患者年齡的單因素logistics回歸分析

表7 CNS株基因的耐藥相關基因富集通路KEGG富集分析結果

3 討論

ICU患者中存在更多的介入治療，如在ICU內中心靜脈置管介入治療的患者中，革蘭陽性菌占所有致病菌的44%[7]。介入性治療所帶來的皮膚黏膜損傷會增加CNS感染風險[9]，并且介入治療的時間長短也與CNS感染成正向相關[9]，以及抗生素的使用會促使CNS 產(chǎn)生抗藥性[8]。

多個研究顯示，CNS感染率的增加與患者置管時間和機體免疫功能有關[7,9,10]，F(xiàn)uruichi等[9]分析里新生兒重癥監(jiān)護室里CNS的感染，發(fā)現(xiàn)中心靜脈導管滯留時間長會增加新生兒CNS感染和菌血癥發(fā)病率。

我們的分析結果顯示ICU組患者CNS標本較非ICU組具有更高的MecA、aac(6’)/aph(2”)和aph(3’)-Ⅲ基因PCR陽性率，ICU組和非ICU組患者的CNS標本均不具有Cfr和ermA基因PCR陽性以及萬古霉素耐藥性。另外，ICU患者CNS株具有更高的耐藥性。王幫勇等[11]報道結果顯示ICU科室CNS對不同的抗菌藥物耐藥性差別較大，但對萬古霉素不表現(xiàn)耐藥性，林鐲等[4]對MRCNS的藥敏試驗結果顯示其對萬古霉素不具備耐藥性。朱任媛等[6]對ICU患者CNS的藥敏試驗結果顯示葡萄球菌屬對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺、復方磺胺、磷霉素、利福平等抗生素較為敏感，耐藥性較低。他們進一步研究顯示，ICU患者的屎腸球菌和糞腸球菌中均出現(xiàn)對萬古霉素耐藥菌株，檢出率高于普通病房[6]。

CNS的erm家族基因(A/B/C)可以表達紅霉素甲基化酶，促進病原菌生物膜表型改變，使其產(chǎn)生耐藥性[4]，生物膜表型修復力度較大的菌株，ermC基因表達越高，對紅霉素抗性也就越大[12]，本文在ICU和非ICU患者中均為檢測出ermA基因，但卻有78株CNS表現(xiàn)為紅霉素耐藥性，這表明介導CNS抗性的主導基因可能不是ermA，而是其他家族成員，如ermC[12]。研究表明comK-mecA-clpc復合體只有在comS小分子蛋白存在的情況下才能被激活[13]，而本次測序并沒有檢測到comS，表明comK-mecA-clpc復合體及其所介導的抗藥性可能沒有被激活。然而，其他耐藥基因(包括femA/B/X和fmhB)的檢出表明CNS株可能具有加氧西林抗性。

tetM基因編碼四環(huán)素類藥物外排泵蛋白，tetM基因PCR陽性菌株大多表現(xiàn)為四環(huán)素耐藥性[4,14]，本研究結果顯示65株CNS表現(xiàn)為tetM陽性，其中有26株(40%)表現(xiàn)為四環(huán)素耐藥性，同樣我們檢測到85%和54%的CNS分別表達aac(6’)/aph(2”)和aph(3’)-Ⅲ[4,15]，但卻有36%的CNS表現(xiàn)為慶大霉素耐藥性。這表明tetM、aac(6’)/aph(2”)和aph(3’)-Ⅲ等這些基因對CNS的調控不僅控制四環(huán)素和慶大霉素的耐藥性，還可能與其他生物活性有關。林鐲等[4]報道erm家族基因A/B/C共同表達和MRCNS的耐藥性表現(xiàn)一致；茅挺[15]對萬古霉素敏感性減低葡萄球菌分析發(fā)現(xiàn)mecA、aac(6’)/aph(2”)和aph(3’)-Ⅲ基因表達率較高，本文結果表明，與ICU組比較，非ICU患者CNS同時具有較低的耐藥基因檢出率和耐藥率，這說明多重耐藥性基因檢測能夠提供更精確的CNS多重耐藥性機制。

測序分析結果顯示，CNS細胞株中具有耐藥外排蛋白基因emrE、喹諾酮抗藥性基因norA/B/C、季銨化合物耐性基因ykkC/D和smvA等多個耐藥相關基因。這表明CNS可能會對氟喹諾酮類藥物、喹諾酮類藥物和季銨化合物等具有多重以及不同程度的耐藥性，而氯霉素敏感性基因rarD的檢出表明CNS可能不具有氯霉素抗性，這與本研究中CNS具有較低的氯霉素耐藥性(5%)結果一致。

另外，本文第一次明確表明CNS耐藥率與年齡正相關，據(jù)衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(Mohnarin)2011～2012年度血流感染細菌耐藥監(jiān)測報告顯示，CNS在成年人(15～64歲)中血流病原菌的耐藥菌株的檢出率最高(58.8%)，其次是老年人(>65歲，31.3%)[16]。Mehri等[17]對CNS的流行情況調查顯示CNS在20歲以下的患者中檢出率最高(35%)，其次是45歲以上人群(33%)，并且女性患者多于男性(69% vs.31%)，這點與本研究中的男∶女比例為38%∶62%相符。而本研究發(fā)現(xiàn)，在老年人群中年齡是CNS菌株中mecA基因PCR陽性以及苯唑西林、頭孢唑啉、左氧氟沙星和亞胺培南的獨立危險因素。這些差異可能歸于調查對象以及對抗生素的使用歷史的不同，也可能是因為年齡越大使用抗生素時間越長[18,19]，進而導致抗生素耐藥性越高。這與患者對抗生素使用的認知情況有關，因此適當?shù)募哟罂股卣_使用的認知推廣，有助于降低CNS耐藥性。

綜上所述，本研究結果顯示老年人ICU患者較非ICU患者的CNS耐藥性高，對青霉素、氨芐西林、紅霉素、苯唑西林、頭孢唑啉等抗生素的耐藥性高，但2組均未出現(xiàn)萬古霉素耐藥株，且對氯霉素、利奈唑胺、替考拉寧表現(xiàn)敏感，表明氯霉素、利奈唑胺、替考拉寧可以推廣為CNS的首選藥物。Logistics分析發(fā)現(xiàn)年齡是苯唑西林、頭孢唑啉、左氧氟沙星和亞胺培南耐藥性的獨立危險因素，多中耐藥基因的檢出對探究CNS的多重耐藥性機制奠定了一定的分子基礎。