陸銳均 陳為堅(jiān) 王曉飛

椎間盤退變性疾病是一類與年齡增長密切相關(guān)的疾病，隨著人們生活習(xí)慣的改變和老齡化社會的進(jìn)展，椎間盤退變性疾病的發(fā)病率逐年上升，并具有年輕化的趨勢，常常引起患者腰腿痛等癥狀，不僅使患者生活質(zhì)量顯著下降，同時(shí)也嚴(yán)重影響患者的生活和勞動能力，對社會和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展造成一定影響[1,2]。因此，臨床與科研工作中仍需要進(jìn)一步探討椎間盤退變的分子機(jī)制，為椎間盤退變性疾病的早期診治提供新的思路。研究證實(shí)，髓核細(xì)胞基質(zhì)代謝異常是椎間盤退變的重要病理特征之一，但其具體的誘發(fā)因素仍有爭議[3]。DOT1L是人體中重要的甲基化轉(zhuǎn)移酶，可以通過使組蛋白H3第79位賴氨酸發(fā)生甲基化，從而參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[4]。近年來的研究顯示，DOT1L是重要的軟骨保護(hù)因子，可以通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝過程而延緩骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[5]。髓核細(xì)胞作為一種類軟骨細(xì)胞，DOT1L是否也對其發(fā)揮保護(hù)作用，從而抑制椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展，目前尚未見報(bào)道。此外，髓核細(xì)胞中DOT1L受到何種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，目前也尚未明確。在本研究中，我們探索了DOT1L在髓核細(xì)胞基質(zhì)代謝中的具體作用，明確了Sp1是調(diào)控DOT1L表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清(Gibco，美國)；TNF-α、Ⅱ型膠原酶(R&D，美國)； PBS緩沖液、RIPA蛋白裂解液、蛋白定量試劑盒、氯仿、異丙醇、無水乙醇、DEPC水、SDS-PAGE配膠試劑盒、蛋白Loading Buffer、脫脂奶粉、TBST緩沖液、羊抗兔二抗(碧云天公司，中國)；Trizol提取液、蛋白電泳Marker、PCR引物(Life，美國)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒(TAKARA，日本)；兔抗人DOT1L抗體(77087)、兔抗人Sp1抗體(9389)、兔抗人total-catenin抗體(8480)、兔抗人active-catenin抗體(19807)、兔抗人GAPDH抗體(5174)(CST，美國)；ECL蛋白印跡發(fā)光液(Millipore，美國)；敲除/過表達(dá)慢病毒(吉瑪基因，中國)；離心管(15 ml、50 ml)、6孔板、96孔板、EP管、25 cm2培養(yǎng)瓶(Corning，美國)，移液器(Eppendorf，德國)。生物安全柜、CO2恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、低溫高速離心機(jī)、Nano分光光度計(jì)、PCR儀、凝膠成像儀(Thermo Fisher，美國)；Roche480熒光定量PCR儀(Roche，美國)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；蛋白電泳儀(BioRad，美國)。

1.2 髓核細(xì)胞體外分離、培養(yǎng) 本研究獲我院倫理委員會批準(zhǔn)，共收集15例腰椎間盤突出癥并行椎間孔鏡手術(shù)治療的患者髓核及10例脊柱側(cè)彎并行矯形手術(shù)治療的患者髓核，患者均知情并均簽署知情同意書，2組患者在性別比、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在無菌條件下仔細(xì)分離髓核，并將其修剪為1 mm3大小碎塊，隨后置入含 0.25%胰蛋白酶的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C下以消化30 min。移除消化液，用PBS緩沖液清洗剩余組織，用含0.025% Ⅱ型膠原酶的DMEM培養(yǎng)基于37℃下繼續(xù)消化3 h。消化完成后以1 500 r/min離心10 min，棄去上清，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)瓶中，每3天換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞長滿至80%～90%后傳代。以第1～2代髓核細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，髓核細(xì)胞以1×105cells/well的密度接種于6孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入腫瘤壞死因子-α(TNF-α)進(jìn)行刺激，濃度為10 ng/ml。

1.3 RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄 髓核細(xì)胞用PBS緩沖液輕輕清洗 3 次。每孔加入Trizol 1 ml，于冰上孵育5 min。將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中并三氯甲烷200 μl，劇烈震蕩混勻后靜置5 min，隨后12 000 r/min離心15 min。離心后吸取上層水相液體并轉(zhuǎn)移入新的EP 管中。每管加入異丙醇500 μl，室溫靜置10 min后12 000 r/min離心10 min。棄去上清，加入 75%乙醇1 ml洗滌RNA沉淀，7 500 r/min離心5 min。棄去上清，加入20 μl DEPC水。于Nanodrop紫外分光光度計(jì)下檢測RNA濃度與純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法，每管加入逆轉(zhuǎn)錄試劑2 μl、RNA 8 μl，于37℃孵育15 min。

1.4 熒光定量PCR EP管中分別加入cDNA 2 μl、引物0.2 μl、DEPC水 2.8 μl、SYBR Green 5 μl，總體積為10 μl，充分混勻后加入96孔板中。將PCR反應(yīng)板置入Roche480熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過軟件分析數(shù)據(jù)基因相對表達(dá)量。內(nèi)參GAPDH引物GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT、GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG；DOT1L引物CTGCCGGTCTACGATAAACATC、AGCTTGAGATCCGGGATTTCT； MMP-3引物AGTCTTCCAATCCTACTGTTGCT、TCCCCGTCACCTCCAATCC；MMP-13引物ACTGAGAGGCTCCGAGAAATG、GAACCCCGCATCTTGGCTT；Collagen Ⅱ引物TGGACGATCAGGCGAAACC、GCTGCGGATGCTCTCAATCT。Aggrecan引物ACTCTGGGTTTTCGTGACTCT、ACACTCAGCGAGTTGTCATGG。

1.5 Western Blot蛋白印跡 髓核細(xì)胞用PBS緩沖液輕輕清洗3次，每孔加入RIPA蛋白裂解液100 μl并于冰上孵育30 min，隨后通過離心機(jī)12 000 r/min離心30 min，吸取上清，按BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書測定蛋白濃度，隨后加入蛋白上樣緩沖液混勻，于沸水浴中5 min孵育。通過SDS-PAGE凝膠配置試劑盒進(jìn)行凝膠配置，將蛋白進(jìn)行于100 mA恒定電流下常規(guī)電泳80 min，隨后于180 V恒定電壓下轉(zhuǎn)膜2 h，將PVDF膜于5%脫脂牛奶中封閉1 h，于4℃中與DOT1L、Sp1、Total-catenin、Active-catenin、GAPDH一抗孵育過夜。用TBST清洗3次后，于室溫下與二抗孵育1 h，隨后通過ECL發(fā)光液在成像系統(tǒng)下獲取結(jié)果，相應(yīng)蛋白表達(dá)為條帶灰度值除以對應(yīng)GAPDH內(nèi)參條帶灰度值。

1.6 慢病毒轉(zhuǎn)染 敲除/過表達(dá)慢病毒均有上海吉瑪公司構(gòu)建并制備。髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)染最佳MOI值(Multiply of Infection；等于病毒個數(shù)/細(xì)胞個數(shù))為50，根據(jù)種板髓核細(xì)胞數(shù)量和慢病毒濃度計(jì)算MOI值，并將相應(yīng)慢病毒加入對應(yīng)孔板中，同時(shí)按5 μg/ml的濃度加入Polybrene，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后棄去轉(zhuǎn)染液，以后按1.2方法繼續(xù)培養(yǎng)或炎性因子刺激。后續(xù)實(shí)驗(yàn)按上述1.3～1.5方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 腰椎間盤突出癥患者髓核組織DOT1L表達(dá) 腰椎間盤突出癥患者髓核組織的DOT1L基因表達(dá)水平較脊柱側(cè)彎患者髓核組織顯著降低(3.46倍；P<0.001)。此外，我們提取2組患者髓核組織蛋白，通過Western blot證實(shí)腰椎間盤突出癥患者髓核組織的DOT1L蛋白水平也較脊柱側(cè)彎患者明顯減少，與基因水平結(jié)果一致(2.78倍；P<0.001)。見圖1。

圖1 腰椎間盤突出癥患者髓核組織的DOT1L基因(A)和蛋白(B)表達(dá)水平較脊柱側(cè)彎患者髓核組織降低

2.2 髓核細(xì)胞中敲除DOT1L導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路激活增加、基質(zhì)代謝相關(guān)分子表達(dá)改變 通過敲除慢病毒干擾其表達(dá)，發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染后髓核細(xì)胞DOT1L表達(dá)被顯著抑制，較轉(zhuǎn)染對照序列的NC組明顯降低90%(P<0.001)。隨后用TNF-α對轉(zhuǎn)染敲除慢病毒的髓核細(xì)胞進(jìn)行刺激，并檢測基質(zhì)代謝相關(guān)分子表達(dá)與Wnt/β-catenin通路激活水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除DOT1L表達(dá)后髓核細(xì)胞在TNF-α刺激下Wnt/β-catenin通路激活水平顯著升高(3.51倍；P<0.001)。此外，抑制髓核細(xì)胞DOT1L表達(dá)后，TNF-α刺激下MMP3、MMP13表達(dá)水平明顯升高(5.34倍、3.67倍；P<0.001；圖2C)，而Collagen Ⅱ、Aggrecan表達(dá)水平顯著降低(0.27倍、0.34倍；P<0.001)。見圖2。

圖2 A：慢病毒顯示DOT1L敲除效率達(dá)90%；B：敲除DOT1L后，髓核細(xì)胞在TNF-α刺激下Wnt/β-catenin通路激活水平顯著升高；C、敲除DOT1L后，髓核細(xì)胞在TNF-α刺激下MMP3、MMP13表達(dá)升高而Collagen Ⅱ、Aggrecan降低

2.3 TNF-α刺激下髓核細(xì)胞Sp1表達(dá) DOT1L啟動子區(qū)域存在Sp1和AP-1結(jié)合區(qū)域。對TNF-α刺激后髓核細(xì)胞的Sp1和AP-1表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激后髓核細(xì)胞的AP-1表達(dá)并無明顯改變(P=0.901)，而Sp1表達(dá)顯著升高(2.18倍；P=0.013)。見圖3。

圖3 TNF-α刺激后髓核細(xì)胞的Sp1表達(dá)顯著升高(A)，而AP-1表達(dá)無明顯改變(B)

2.4 Sp1參與調(diào)控髓核細(xì)胞DOT1L表達(dá) 在TNF-α刺激條件下，抑制髓核細(xì)胞Sp1表達(dá)后，其DOT1L表達(dá)也明顯降低(0.31倍；P=0.003)，而過表達(dá)Sp1表達(dá)后，髓核細(xì)胞的DOT1L表達(dá)水平顯著升高(7.82倍；P<0.001)。見圖4。

圖4 TNF-α刺激條件下，敲除髓核細(xì)胞的Sp1表達(dá)可致DOT1L表達(dá)顯著降低(A)，而過表達(dá)Sp1后髓核細(xì)胞DOT1L表達(dá)也明顯升高(B)

3 討論

隨著人口老齡化的不斷加快，椎間盤退變性疾病的發(fā)病率逐年增高，常常導(dǎo)致腰腿痛等癥狀。流行病學(xué)研究顯示，近80%的人群在其一生中經(jīng)歷過嚴(yán)重的下腰痛，每年有2.8%～5%的門診患者因腰腿痛而就診，而因腰腿痛所帶來的醫(yī)療支出和間接損失超過1 000億美元，不僅對患者的生活和工作造成很大影響，也對社會的經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成一定阻礙[6,7]。

近年來，為了探討椎間盤退變的病因與機(jī)制，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究，先后證實(shí)微損傷、炎性水平紊亂、局部代謝紊亂等均是導(dǎo)致椎間盤退變的重要原因，這些因素共同造成了椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的合成代謝紊亂，導(dǎo)致椎間盤髓核含水量下降，從而引起椎間盤結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的改變[8-10]。椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)主要由椎間盤內(nèi)髓核細(xì)胞所分泌，髓核細(xì)胞在各種病因作用下出現(xiàn)功能異常，是椎間盤退變的核心所在[11]。因此，進(jìn)一步闡明調(diào)控髓核細(xì)胞功能的分子生物學(xué)機(jī)制，有助于明確椎間盤退變性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，為椎間盤退變性疾病的早期診治提供新的思路。

表觀遺傳學(xué)是細(xì)胞生長、發(fā)育與功能的重要調(diào)控機(jī)制，組蛋白甲基化是其中的重要組成部分之一[12]。組蛋白甲基化受到細(xì)胞內(nèi)多種甲基化修飾相關(guān)酶的調(diào)控。DOT1L是一種新發(fā)現(xiàn)的甲基化轉(zhuǎn)移酶，首次發(fā)現(xiàn)于2002年，通過使組蛋白H3第79位賴氨酸發(fā)生甲基化，從而調(diào)控組蛋白的甲基化修飾過程。特別的是，DOT1L不具有SET結(jié)構(gòu)域，僅能甲基化位于核小體中的組蛋白H3，而不能催化從核小體分離出來的組蛋白H3[4]。許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，DOT1L參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，在白血病、黑色素瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤等發(fā)病機(jī)制中均有重要意義[13-15]。

Monteagudo等[16]研究顯示，敲除DOT1L表達(dá)后可誘發(fā)小鼠關(guān)節(jié)炎，提示DOT1L具有強(qiáng)大的軟骨保護(hù)功能；而Castano等[17]的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，DOT1L可以通過調(diào)控軟骨細(xì)胞分化及其基質(zhì)代謝，從而參與軟骨發(fā)育和關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生發(fā)展。椎間盤髓核細(xì)胞作為類軟骨細(xì)胞，DOT1L是否也對其發(fā)揮保護(hù)功能、從而抑制髓核細(xì)胞的衰老與退變？在本研究中，我們首次分析了髓核明顯變性的腰椎間盤突出癥患者髓核組織中的DOT1L表達(dá)，并與脊柱側(cè)凸患者髓核組織進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腰椎間盤突出癥患者髓核組織中的DOT1L表達(dá)顯著降低，這個結(jié)果提示DOT1L表達(dá)降低不僅是椎間盤退變的分子標(biāo)志之一，更以后可能是導(dǎo)致髓核功能異常的關(guān)鍵分子。

為了進(jìn)一步探討髓核細(xì)胞中DOT1L的具體作用，我們在體外對髓核細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染以敲除DOT1L表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOT1L表達(dá)下調(diào)后，炎性因子刺激下的Wnt/β-catenin通路激活水平顯著升高。Wnt/β-catenin通路是調(diào)控椎間盤生長發(fā)育、功能形成與退變的重要信號通路之一，在維持髓核細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中具有重要的作用。Hiyama等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路激活水平上升可以加速髓核細(xì)胞凋亡、促進(jìn)基質(zhì)溶解蛋白(MMP)表達(dá)上調(diào)，從而加速椎間盤退變的過程；Kondo等[19]研究也證實(shí)，Wnt/β-catenin通路在小鼠體內(nèi)過度激活可以導(dǎo)致椎間盤早期退變。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步提示，DOT1L是調(diào)控Wnt/β-catenin通路參與髓核細(xì)胞功能的上游分子，DOT1L正是通過抑制Wnt/β-catenin通路激活水平以發(fā)揮椎間盤保護(hù)功能。此外，我們還發(fā)現(xiàn)敲除DOT1L表達(dá)后髓核細(xì)胞中促進(jìn)髓核退變的分子表達(dá)顯著增多(MMP3、MMP13)而Collagen Ⅱ、Aggrecan表達(dá)顯著降低，這與軟骨細(xì)胞中的研究結(jié)果一致，說明DOT1L是通過影響Wnt/β-catenin通路活性以實(shí)現(xiàn)對髓核細(xì)胞基質(zhì)代謝的調(diào)控。

為了進(jìn)一步闡明影響DOT1L表達(dá)的上游分子，我們進(jìn)一步利用Jaspar軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示DOT1L啟動子區(qū)域存在Sp1與AP-1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，提示DOT1L的表達(dá)很有可能受到這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。此外，我們發(fā)現(xiàn)炎癥因子刺激髓核細(xì)胞后，AP-1表達(dá)并無明顯變化，而Sp1的表達(dá)顯著增多，提示Sp1可能在髓核細(xì)胞退變中具有更重要作用。Xu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Sp1參與調(diào)控髓核細(xì)胞中多種炎癥相關(guān)分子的表達(dá)，主要降低炎性因子對髓核細(xì)胞的代謝影響。結(jié)合軟件分析結(jié)果，我們推測Sp1參與調(diào)控DOT1L表達(dá)。通過慢病毒過表達(dá)或敲除Sp1，髓核細(xì)胞中的DOT1L表達(dá)也相應(yīng)增多/減少，進(jìn)一步證實(shí)了Sp1正是參與正性調(diào)控DOT1L表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄分子。

在本研究中，我們證實(shí)了DOT1L通過Wnt/β-catenin通路以影響髓核細(xì)胞的基質(zhì)代謝，而Sp1是調(diào)控DOT1L的關(guān)鍵分子。在正常條件下，髓核細(xì)胞在外界環(huán)境刺激下通過Sp1調(diào)控DOT1L表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin通路激活以穩(wěn)定髓核細(xì)胞的基質(zhì)代謝水平，從而維持椎間盤的正常生理代謝、防止退變；而病理?xiàng)l件下，由于DOT1L表達(dá)降低，引起Wnt/β-catenin通路過度激活，導(dǎo)致髓核細(xì)胞基質(zhì)代謝水平紊亂，最終參與了椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展。然而，本研究中還存在一些不足，為何退變椎間盤髓核細(xì)胞中DOT1L表達(dá)降低DOT1L又是如何影響Wnt/β-catenin通路激活這些問題仍需要在未來的研究中進(jìn)一步解決。