林佑妮

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱冠心病)是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧引起的心臟病[1]，是臨床常見的心血管疾病，具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量[2]。有研究證實(shí)，高同型半胱氨酸血癥是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因多態(tài)性導(dǎo)致同型半胱氨酸(homocysteinemia，Hcy)的代謝過(guò)程受阻，引起Hcy在體內(nèi)聚集增多，進(jìn)而導(dǎo)致血管粥樣硬化發(fā)生[4]。本研究采用回顧性分析方式，分析粵東地區(qū)MTHFR基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生及冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性，進(jìn)一步分析冠心病的危險(xiǎn)因素，以期為冠心病診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年7月—2018年10月我院心內(nèi)科住院的疑似冠心病病人300例為研究對(duì)象，根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影檢查結(jié)果分為冠心病組(冠狀動(dòng)脈中前降支、回旋支、右冠狀動(dòng)脈存在50%以上狹窄病變或左主干存在30%以上狹窄病變)與對(duì)照組(冠狀動(dòng)脈無(wú)明顯病變)。冠心病組200例，男119例，女81例，年齡47～80歲；對(duì)照組100例，男55例，女45例，年齡48～77歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2014年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)《冠心病診治指南》制定的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；漢族，且為粵東地區(qū)常駐居民；性別不限，年齡40～80歲；病人和(或)家屬均知情同意并簽署知情同意書[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：病人病歷資料不完整；肝、腎功能不全；惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病；具有明確感染病灶的急性、慢性感染；半年內(nèi)已服用葉酸、維生素B6(VitB6)、維生素B12(VitB12)及其他內(nèi)分泌疾病影響Hcy水平；急性心肌梗死病人；繼發(fā)性高血壓及高血壓合并腦卒中病人[6]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo) 收集所有病人性別、年齡等一般資料，記錄兩組病人Gensini評(píng)分及Hcy水平及MTHFR C677T基因型(CC型、CT型及TT型)與等位基因(C、T兩種等位基因)。

1.2.1 生化指標(biāo) 抽取靜脈取血1 mL，加至EDTA抗凝管中；抗凝全血在室溫保存不超過(guò)7 d，2～8 ℃不超過(guò)1個(gè)月，-20 ℃不超過(guò)7周，血液樣品反復(fù)凍融不超過(guò)5次。全血運(yùn)輸必須遵循國(guó)家和當(dāng)?shù)赜嘘P(guān)規(guī)定。另外5 mL置于惰性分離膠促凝管2 h內(nèi)送至我院檢驗(yàn)科，測(cè)定腎功能、肝功能、血脂、Hcy等生化指標(biāo)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增儀：有熱蓋，使用0.2 mL薄壁管。BaiO?e-Hyb全自動(dòng)雜交儀：BSE03011上海百傲科技有限公司，或采用類似的溫控精度為±0.5 ℃的恒溫裝置。BaiO?BE-2.0生物芯片識(shí)讀儀：BSE01011上海百傲科技有限公司提供。臺(tái)式高速離心機(jī)：離心速度≥10 000 r/min。金屬浴：溫度范圍室溫至100 ℃或采用類似的恒溫水浴裝置。漩渦振蕩器，微量移液器：精度應(yīng)符合要求，可消毒處理。

1.2.3 基因檢測(cè)方法 樣本DNA制備：按照血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取和純化DNA。DNA濃度10～60 ng/μL，A260/A280比值為1.5～2.0。若DNA必須被稀釋，使用pH 7.6的TE緩沖溶液作為稀釋劑。樣品DNA在2～8 ℃貯存1周或-20 ℃貯存1個(gè)月，反復(fù)凍融≤3次。

1.2.3.1 PCR擴(kuò)增液準(zhǔn)備 準(zhǔn)備無(wú)菌的0.2 mL薄壁管、吸頭；將試劑從試劑盒中取出，放置室溫解凍后，低速離心，之后將MTHFR擴(kuò)增液分裝到0.2 mL薄壁管中，每管22 μL，并做好標(biāo)記，每管可檢測(cè)1份；根據(jù)需要檢測(cè)的樣本數(shù)量，選取同等數(shù)量的擴(kuò)增管，在各擴(kuò)增管中分別加1.0 μL反應(yīng)液A；在各擴(kuò)增管加入2 μL提取好的樣品DNA溶液，混勻。

1.2.3.2 PCR擴(kuò)增 將各試管放入PCR儀中，按下列條件擴(kuò)增：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，56 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。取出擴(kuò)增產(chǎn)物，2～8 ℃保存。

1.2.3.3 雜交顯色 取出BaiO?雜交顯色試劑盒。將反應(yīng)液B低速離心，吸取10 μL加入雜交緩沖液瓶中混勻，備用，剩余試劑2～8 ℃保存。使用前，取出1支抗體，低速離心，加入1 mL抗體稀釋劑，振蕩混勻，制成抗體使用液，備用，剩余試劑需-20 ℃保存。按照BaiO?e-Hyb全自動(dòng)雜交儀要求，設(shè)置雜交程序，詳見表1。取出基因芯片，做好標(biāo)記，將MTHFR基因芯片放入雜交儀片架中，旋緊密封旋鈕。將各試劑按要求分裝到2 mL離心管中，插入試劑架相應(yīng)位置中，詳見表1。吸取190 μL雜交緩沖液，加入10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻，制成雜交反應(yīng)液，加入試管中，放入試管架B位置。將試管架放入雜交儀中，運(yùn)行雜交程序。反應(yīng)結(jié)束后，取出芯片。將芯片放入生物芯片識(shí)讀儀中，使用BaiO?基因芯片圖像分析軟件(Baio Array Doctor)V 2.0進(jìn)行圖像掃描數(shù)據(jù)分析，輸出檢測(cè)結(jié)果，具體操作按照儀器使用說(shuō)明。

表1 雜交程序及試管擺放位置

1.2.3.4 結(jié)果判讀 使用Array Doctor 2.0軟件輸入以下參數(shù)：陣列行數(shù)為3，列數(shù)為9。軟件輸出各探針點(diǎn)信號(hào)值后，將同一探針6個(gè)點(diǎn)信號(hào)值取平均值，之后按照以下域值判斷基因型：純合/雜合判定域值為0.4；只要“基因芯片圖像分析軟件(Baio Array Doctor)V2.0”輸出的野生型探針和突變型探針信號(hào)平均值比值(小信號(hào)值與大信號(hào)值比值)>0.4，認(rèn)為該檢測(cè)位點(diǎn)為雜合子；上述比值<0.4，即認(rèn)為該檢測(cè)位點(diǎn)為大信號(hào)值探針對(duì)應(yīng)純合子。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，若“基因芯片圖像分析軟件(Baio Array Doctor) V 2.0”輸出檢測(cè)探針信號(hào)平均值>10，認(rèn)為實(shí)驗(yàn)過(guò)程有污染的可能。

1.2.4 冠狀動(dòng)脈造影 采用Judkins法，由專業(yè)醫(yī)師將超滑導(dǎo)絲或尼龍導(dǎo)絲送至主動(dòng)脈竇底，沿導(dǎo)絲將Tig左、右冠狀動(dòng)脈造影導(dǎo)管或Cordis左、右冠狀動(dòng)脈造影導(dǎo)管送至冠狀動(dòng)脈開口，左冠狀動(dòng)脈一般采用4個(gè)常見體位：左前斜頭位、右前斜頭位、肝位、蜘蛛位，必要時(shí)加用正頭位及正足位，右冠狀動(dòng)脈一般采用兩個(gè)體位即左前斜位和左前頭，若病變?cè)谥卸吻覟槠男圆∽兗佑糜仪靶蔽?右前斜RAO300，觀察右冠狀動(dòng)脈近段、中段和分支)。以多體位投照完成冠狀動(dòng)脈造影，冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果由兩名專業(yè)醫(yī)師采用目測(cè)法多方位評(píng)估每支血管每處病變程度，之后根據(jù)病情決定是否需要進(jìn)一步行冠狀動(dòng)脈介入治療，術(shù)后上肢一般采用腕帶壓迫止血、下肢縫合器或壓迫器止血。

冠心病組：冠狀動(dòng)脈造影采用Judkin′s 法，每條血管至少進(jìn)行兩個(gè)以上的多體位投照，造影結(jié)果由兩名專業(yè)醫(yī)師分析完成。左主干直徑狹窄程度>30%或左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈中任何1支直徑狹窄程度>50%診斷為具有臨床意義的狹窄，根據(jù)主要分支支數(shù)分為單支病變、雙支病變和多支病變(≥3支病變)，左主干病變按兩支計(jì)算。對(duì)照組：冠狀動(dòng)脈造影未見冠狀動(dòng)脈斑塊、狹窄、痙攣(冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)為0)。

1.3 冠狀動(dòng)脈狹窄程度Gensini評(píng)分 評(píng)估冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度：冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果由兩名專業(yè)醫(yī)師，采用目測(cè)法分析冠狀動(dòng)脈病變部位、病變血管數(shù)量及病變程度，并計(jì)算Gensini評(píng)分。冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果：左主干直徑狹窄程度>30%或左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈中任何1支直徑狹窄程度>50%診斷為冠心病。冠狀動(dòng)脈狹窄程度Gensini評(píng)分計(jì)算方法：首先評(píng)估每支血管狹窄程度，狹窄<25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)4分，76%～90%計(jì)8分，91%～99%計(jì)16分，100%計(jì)32分；各段冠狀動(dòng)脈病變系數(shù)：左主干為5，前降支及回旋支近段為2.5，前降支中段為1，前降支遠(yuǎn)段為1，回旋支中遠(yuǎn)段為1，右冠狀動(dòng)脈近中遠(yuǎn)段為1，第一對(duì)角支為1，第二對(duì)角支為1，右心室后支為1，其他小分支為0.5。以冠狀動(dòng)脈每個(gè)狹窄部位基本評(píng)分乘以該病變部位病變系數(shù)，即為該病變血管評(píng)分，各病變血管得分總和即為該病人冠狀動(dòng)脈狹窄程度總分。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組收縮壓、舒張壓、高血壓比例、Gensini評(píng)分及Hcy水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組臨床資料比較

2.2 兩組MTHFR C677T基因型及等位基因頻率比較 兩組MTHFR C677T基因型(CC型、CT型及TT型)與等位基因(C、T兩種等位基因)頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；冠心病組基因型CT型、TT型及T等位基因頻率均高于對(duì)照組，冠心病組基因型CC型及C等位基因頻率均低于對(duì)照組(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組MTHFRC677T基因型及等位基因頻率比較 單位：例(%)

2.3 不同病變支數(shù)冠心病病人Gensini評(píng)分及Hcy水平比較 不同病變支數(shù)冠心病病人Gensini評(píng)分及Hcy水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；多支病變組、雙支病變組Gensini評(píng)分及Hcy水平均高于單支病變組，多支病變組Gensini評(píng)分及Hcy水平均高于雙支病變組(P<0.05)。詳見表4。

表4 不同病變支數(shù)冠心病病人Gensini評(píng)分及Hcy水平比較(±s)

P<0.05。

2.4 不同病變支數(shù)冠心病病人MTHFR C677T基因型及等位基因頻率比較 不同病變支數(shù)冠心病病人MTHFR C677T基因型(CC型、CT型及TT型)與等位基因(C、T兩種等位基因)頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；多支病變組、雙支病變組基因型CT型、TT型及T等位基因頻率均高于單支病變組，多支病變組基因型CT型、TT型及T等位基因頻率均高于雙支病變組(P<0.05)；多支病變組、雙支病變組基因型CC型及C等位基因頻率均低于單支病變組，多支病變組基因型CC型及C等位基因頻率均低于雙支病變組(P<0.05)。詳見表5。

表5 不同病變支數(shù)冠心病病人MTHFRC677T基因型及等位基因頻率比較 單位：例(%)

2.5 冠心病發(fā)生危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析 以冠心病發(fā)生為因變量，對(duì)單因素分析中冠心病發(fā)生的可能危險(xiǎn)因素收縮壓、舒張壓、高血壓、Gensini評(píng)分、Hcy水平、基因型CC型、基因型CT型、基因型TT型、C等位基因及T等位基因進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：高血壓、Gensini評(píng)分、Hcy水平、基因型CT型、基因型TT型及T等位基因是冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。詳見表6。

表6 冠心病發(fā)生危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

3 討 論

冠心病是臨床常見病、多發(fā)病，是世界范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率較高的疾病之一[7]。2011年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)心肌梗死病人約250萬(wàn)人，城市人口中因冠心病導(dǎo)致的死亡率為0.1%，農(nóng)村為0.07%，且呈逐年升高趨勢(shì)[8]。目前，已明確的傳統(tǒng)冠心病危險(xiǎn)因素主要包括高血壓、糖尿病、高脂血癥、飲酒、吸煙、肥胖等，但較多冠心病病人無(wú)上述危險(xiǎn)因素[9-10]，因此，分析冠心病新型危險(xiǎn)因素，并采取有效的措施降低這些危險(xiǎn)因素，以延遲動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是冠心病防治的重要課題。已有研究發(fā)現(xiàn)，高同型半胱氨酸血癥可增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，促進(jìn)斑塊破裂，導(dǎo)致急性冠脈綜合征發(fā)生，是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11]。

MTHFR是Hcy代謝途徑中的關(guān)鍵酶，該酶的遺傳缺陷引起Hcy代謝受阻，導(dǎo)致體內(nèi)Hcy水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致血管粥樣硬化發(fā)生。MTHFR C677T是一個(gè)常見的突變位點(diǎn)，分為CC型、CT型、TT型3種基因型[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因突變是冠狀動(dòng)脈血管疾病的危險(xiǎn)因素[13]。Bellia等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因型、血漿Hcy水平、維生素B12水平是冠心病病人重要的不穩(wěn)定基因因素，且證實(shí)多支病變冠心病病人Hcy水平高于單支、雙支、三支病變病人，MTHFR基因型TT型頻率、Hcy水平高于其他基因型。張良峰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Hcy是中國(guó)人冠心病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且葉酸、MTHFR C677T基因型TT型與Hcy水平密切相關(guān)，表明葉酸和MTHFR C677T基因型TT型均可影響Hcy水平。陳芷菱等[16]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病組與健康對(duì)照組MTHFR C677T基因多態(tài)性頻率分布差異明顯，提示MTHFR C677T基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生關(guān)系密切。

目前已有研究分析MTHFR基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)性[17-18]，但MTHFR基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生及冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度相關(guān)性報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，冠心病組病人Gensini評(píng)分及Hcy水平均高于對(duì)照組，冠心病組基因型CT型、TT型及T等位基因頻率均高于對(duì)照組，表明Hcy水平、基因型CT型、TT型及T等位基因與冠心病發(fā)病密切相關(guān)。多支病變組、雙支病變組Gensini評(píng)分及Hcy水平均高于單支病變組，多支病變組Gensini評(píng)分及Hcy水平均高于雙支病變組；多支病變組、雙支病變組基因型CT型、TT型及T等位基因頻率均高于單支病變組，多支病變組基因型CT型、TT型及T等位基因頻率均高于雙支病變組，表明隨著冠心病病人冠狀動(dòng)脈病變程度加重，Hcy水平明顯升高，基因型CT型、基因型TT型、T等位基因頻率均明顯升高，說(shuō)明基因型CT型、基因型TT型、T等位基因頻率高時(shí)Hcy水平升高。進(jìn)一步多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示：高血壓、Gensini評(píng)分、Hcy水平、基因型CT型、基因型TT型及T等位基因是冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，為冠心病病人診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。本研究存在的不足：研究時(shí)間較短，選取的樣本量有限，研究人員之間的差異可能造成各分類變量統(tǒng)計(jì)結(jié)果偏差，因此，粵東地區(qū)MTHFR基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生及冠狀動(dòng)脈病變程度相關(guān)性有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入探討。

總之，冠心病病人Gensini評(píng)分及Hcy水平均明顯升高，基因型CT型、TT型及T等位基因頻率均高于冠狀動(dòng)脈無(wú)明顯病變病人，且Gensini評(píng)分、Hcy水平及MTHFR C677T基因型CT型、TT型為粵東地區(qū)冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。