盧靜， 李杰， 張瑩， 吳棟材

(1.北京市朝陽區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 口腔科, 北京 100020； 2.北京大學(xué)第一醫(yī)院 口腔科, 北京 100034)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是全球第六大最常見的惡性腫瘤[1-2]，美國每年報(bào)告有超過30萬例新病例[3]。盡管OSCC治療(包括手術(shù)、化學(xué)或放射治療)已取得進(jìn)展，但由于局部復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，OSCC的5年生存率仍低于60%[4]。因此，迫切需要研發(fā)治療OSCC的潛在分子靶標(biāo)。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)/激酶β(IKKβ)的抑制劑是IKK復(fù)合物的關(guān)鍵催化亞基，對(duì)激活NF-κB至關(guān)重要[5-6]。IKKβ可通過IKK介導(dǎo)的磷酸化誘導(dǎo)的IκB抑制劑降解來激活NF-κB二聚體，從而使NF-κB二聚體進(jìn)入細(xì)胞核并激活特定的靶基因表達(dá)[7]。在OSCC中，NF-κB的激活誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，NF-κB的高表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[8-9]。抑制IKKβ可降低SCC-25細(xì)胞的細(xì)胞侵襲性，可能對(duì)OSCC治療有用[10]。MicroRNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)[11,-13]。miR-22通過靶向包含3′NLR家族吡啶結(jié)構(gòu)域抑制OSCC中的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[14]。miR-199a-5p通過靶向IKKβ/NF-κB信號(hào)通路抑制OSCC細(xì)胞中的細(xì)胞侵襲和遷移，表明miR-140-5p在OSCC的臨床診斷和治療中可能具有潛在價(jià)值。本研究即探究MicroRNA-199a-5p對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1細(xì)胞 SCC-25、CAL-27、TCA-8113、SCC-4 OSCC和293細(xì)胞系獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2分組 將離體培養(yǎng)的SCC-25、CAL-27、TCA-8113、SCC-4 OSCC和293口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞分為空白對(duì)照組(n=24)、NC模擬組(n=24)和miR-199a-5p模擬物組(n=24)。

1.2 方法

1.2.1逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 根據(jù)說明書制備miRNA，NanoDrop 2000分光光度計(jì)確定總RNA的濃度和質(zhì)量。使用PrimeScript RT試劑盒合成cDNA進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄，TRIzol試劑分離總RNA，用SuperScript III第一鏈合成系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄，在ABI PRISM 7300序列檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行miRNA和mRNA的qPCR分析。20 μL PCR包括2 μL cdNA和10 μL 2X qPCR混合物、250 nmoL/L濃度的正向引物(1 μL)、反向引物(1 μL)和6 μL ddH2O，將反應(yīng)混合物在95 ℃變性30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，分別是95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s。用于RT-qPCR分析的引物，見表1。細(xì)胞中的miR-199a-5p和核因子κB激酶抑制劑(IKKβ)的表達(dá)分別標(biāo)準(zhǔn)化為U6和GAPDH的表達(dá)。

表1 RT-qPCR分析引物序列Tab.1 RT-qPCR analysis of primer sequences

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 SCC-25、CAL-27、TCA-8113、SCC-4 OSCC和293細(xì)胞在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中添加了10%胎牛血清(含100 m mol青霉素和100 ng/L鏈霉素)，在37 ℃和5%CO2的氣氛中。正常口腔黏膜細(xì)胞系用作對(duì)照，并維持在口腔角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基中，補(bǔ)充1%角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子和上皮生長(zhǎng)因子混合物置于37 ℃和5%CO2中。miR-199a-5p模擬物，模擬陰性對(duì)照(模擬NC組)為miR199a-5p抑制劑和NC抑制劑，購自上?；蛑扑幱邢薰?。miR-199a-5p模擬物，5′-CCC AGU GUU CAG ACU ACC UGU UC-3′；模仿NC，5′-CGG TGU GUU CAG ACU ACC UGU UC-3′。miR-199a-5p抑制劑，5′-AAC AGG TAG TCT GAA CAC T-3′；NC抑制劑，5′-TAA CAC GTC TAT ACG CCC A-3′。為了誘導(dǎo)IKKβ的過表達(dá)，通過PCR擴(kuò)增了IKKβmRNA的編碼結(jié)構(gòu)域序列，將其插入pcDNA 3.0載體以增強(qiáng)其表達(dá)，名為pcDNA-IKKβ；空的pcDNA3.1用作陰性對(duì)照(NC)。接種TCA-8113和SCC-4細(xì)胞(1.0×106/孔)，并在六孔板中過夜生長(zhǎng)；第2天時(shí)，使用Lipofectamine 2000試劑將細(xì)胞與miR-199a-5p模擬物(50 nmoL/L)、miR-199a-5p抑制劑(100 nmoL/L)或NC(100 nmoL/L)，而Oligofectamine轉(zhuǎn)染試劑則按照制造商的規(guī)程使用miR-199a-5p模擬物(50 nmoL/L)+2 μg pcDNA-IKKβ轉(zhuǎn)染48 h。

1.2.3細(xì)胞增殖、凋亡和周期分析 將TCA-8113和SCC-4細(xì)胞(5×103/孔)接種在96孔板中過夜。轉(zhuǎn)染后24、48和72 h，將CCK-8溶液添加到細(xì)胞中，并在37 ℃下再孵育2 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度，流式細(xì)胞儀確定細(xì)胞周期分布。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 根據(jù)核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒進(jìn)行核和細(xì)胞質(zhì)蛋白的提取和分離，BCA法測(cè)定總細(xì)胞蛋白的濃度。蛋白質(zhì)樣品(40 μg/泳道)在8%SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行分析，通過電印跡轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶將膜封閉1 h，與抗IKKβ的一抗孵育[總p65蛋白(Total p65)、核磷酸化(p-)p65、NF-κB(IκB)-α抑制劑、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(p-IκB-α)、組蛋白H3、β-肌動(dòng)蛋白和α-微管蛋白以及E 盒結(jié)合鋅指蛋白 1(ZEB1)Twist相關(guān)蛋白1(TWIST1)、波形蛋白(Vimentin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)]在4 ℃過夜。在室溫下與相應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔或山羊抗大鼠二抗孵育1 h后，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)條帶套件。使用ImageJ軟件分析感興趣譜帶的強(qiáng)度，β-肌動(dòng)蛋白和α-微管蛋白被用作細(xì)胞質(zhì)蛋白的內(nèi)部對(duì)照。組蛋白H3蛋白用作核蛋白的內(nèi)部對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5NF-κB活性測(cè)定 將TCA-8113和SCC-4細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種在6孔板中，使細(xì)胞附著過夜，在每個(gè)孔中分別用pGL4.32載體20 ng pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染；6 h后，將細(xì)胞用PBS洗滌，用miR-199a-5p模擬物和pcDNA-IKKβ轉(zhuǎn)染24 h，用PBS洗滌細(xì)胞，使用熒光素酶測(cè)定試劑盒定量熒光素酶活性。

1.2.6Transwell分析 將TCA-8113和SCC-4細(xì)胞接種到24孔板中16～18 h，用相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h。使用帶有Matrigel(用于入侵)或不帶Matrigel的Transwell室插入物進(jìn)行Transwell遷移和侵襲分析。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞接種到插入片段的上腔中(TCA-8113為6×104細(xì)胞，SCC-4為8×104細(xì)胞)。200 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，在插入物底部添加600 μL含20%FBS的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基。將TCA-8113細(xì)胞培養(yǎng)36 h進(jìn)行遷移，培養(yǎng)48 h進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，將SCC-4細(xì)胞遷移48 h并侵襲72 h；遷移或侵襲的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色并用顯微鏡照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-199a-5p在人OSCC細(xì)胞和細(xì)胞系中的表達(dá)

與正常口腔上皮細(xì)胞比較，在OSCC細(xì)胞中miR-199a-5p表達(dá)下調(diào)(P<0.01，圖1A)；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞(n=12)比較，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC細(xì)胞(n=28)中miR-199a-5p表達(dá)降低(P<0.05)。OSCC細(xì)胞SCC-25、cAL-27、TCA-8113和SCC-4中miR-199a-5p下調(diào)(P<0.05，圖1B)。

注：(1)與正?？谇簧掀ぜ?xì)胞比較，P<0.01；(2)與HOK組比較，P<0.05。圖1 miR-199a-5p在人OSCC細(xì)胞和細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-199A-5p in human OSCC cells and cell lines

2.2 miR-199a-5p模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)miR-199a-5p表達(dá)的影響

RTPCR分析顯示，與TCA-8113和SCC-4細(xì)胞的空白對(duì)照組比較，用miR-199a-5p模擬物轉(zhuǎn)染后，miR-199a-5p的表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。CCK 8分析表明，與模擬NC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比較，miR-199a-5p模擬物轉(zhuǎn)染抑制了細(xì)胞活力(表3)，在TCA-8113和SCC-4細(xì)胞中觀察到的凋亡誘導(dǎo)。流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果表明，miR-199a-5p的過表達(dá)通過提高TCA-8113和SCC-4細(xì)胞中G0/G1期的細(xì)胞百分比而導(dǎo)致G0/G1期停滯。miR-199a-5p通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯而部分降低了生存能力(圖2)。

表2 miR-199a-5p模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞促進(jìn)miR-199a-5p的表達(dá)上調(diào)(n=24)Tab.2 Expression of miR-199a-5p was significantly up-regulated after transfection with miR-199a-5p mimics(n=24)

表3 miR-199a-5p模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞抑制細(xì)胞活力(n=24)Tab.3 miR-199a-5p mimic transfected cells inhibited cell activity(n=24)

注：(1)與NC模擬物組比較，P<0.05。圖2 miR-199a-5p模擬物促進(jìn)TCA-8113和SCC-4細(xì)胞凋亡Fig.2 Apoptosis of TCA-8113 and SCC-4 cells promoted by miR-199a-5p mimics

2.3 miR-199a-5p對(duì)IKKβ表達(dá)的影響

如圖3所示，在miR-199a-5p過表達(dá)后，蛋白水平的IKKβ表達(dá)下調(diào)，但在TCA-8113和SCC-4細(xì)胞中敲低miR-199a-5p后，IKKβ的表達(dá)上調(diào)。

注：(1)與NC模擬物組比較，P<0.05。圖3 miR-199a-5p過表達(dá)對(duì)TCA-8113和SCC-4細(xì)胞中IKKβ表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of miR-199a-5p overexpression on IKKβ expression level in TCA-8113 and SCC-4 cells

由于在OSCC腫瘤樣品中miR-199a-5p被下調(diào)，因此IHC在OSCC腫瘤細(xì)胞和鄰近細(xì)胞中也檢測(cè)到IKKβ的表達(dá)水平，表明miR-199a-5p可通過靶向IKKβ來發(fā)揮抑癌作用。miR-199a-5p模擬物抑制了pIκB-α的水平，而IKKβ的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-199a-5p模擬物在TCA-8113和SCC-4細(xì)胞中的這些抑制作用(圖4A、表4和表5)。miR-199a-5p通過下調(diào)IKKβ抑制了NF-κB途徑的激活。miR-199a-5p模擬物在蛋白質(zhì)水平上均抑制了p65表達(dá)，p65的過表達(dá)抑制了ZEB1、TWIST1、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)(圖4B、表6)，減輕miR-199a-5p對(duì)OSCC細(xì)胞的遷移和侵襲的抑制(圖5、表7)，表明miR-199a-5p誘導(dǎo)的EMT取決于p65的表達(dá)。

圖4 miR-199a-5p抑制IKKβ介導(dǎo)的NF-κB途徑活化從而抑制EMTFig.4 Activation of IKKβ-mediated NF-κB pathway inhibited by miR-199a-5p

表4 TCA-8113干預(yù)后pIκB-α、IKKβ和Total p65蛋白水平Tab.4 Comparative analysis of pIκB-α, IKKβ and total p65 after TCA-8113

表5 SCC-4干預(yù)后pIκB-α、IKKβ和Total p65蛋白水平比較Tab.5 Comparative analysis of pIκB-α, IKKβ and Total p65 after SCC-4

表6 TCA-8113干預(yù)后ZEB1、TWIST1、Vimntin、E-cadherin和GAPDH蛋白水平Tab.6 Comparative analysis of ZEB1, TWIST1, Vimntin, E-cadherin and GAPDH levels after TCA-8113 intervention

表7 TCA-8113干預(yù)后ZEB1、TWIST1、Vimntin、E-cadherin和GAPDH蛋白水平Tab.7 Comparative analysis of ZEB1, TWIST1, Vimntin, E-cadherin and GAPDH levels after SCC-4 intervention

注：(1)與空白對(duì)照組相比較，P<0.05。圖5 miR-199a-5p抑制TCA-8113和SCC-4細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移(200×)Fig.5 Invasion and metastasis of TCA-8113 and SCC-4 cells inhibited by miR-199a-5p(200×)

3 討論

頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其預(yù)后較差的主要原因，有早期廣泛淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的傾向。EMT是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。EMT已經(jīng)被證明在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要作用。microRNA是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，是許多生理和病理過程的基因表達(dá)的重要調(diào)控者。microRNA可能通過影響細(xì)胞表型來調(diào)控EMT過程中的細(xì)胞狀態(tài)。miRNA在OSCC中可作為致癌基因或抑癌基因。miR-199a-5p在人類多種類型的癌癥中均被下調(diào)[11-13,19]。miR-199a-5p下調(diào)了其靶基因在不同類型腫瘤中的表達(dá)，包括CD44、GSK-3β和結(jié)締細(xì)胞生長(zhǎng)因子。IKKβ是IKK復(fù)合物的催化亞基，是NF-κB信號(hào)通路的抑制劑。IKKβ在不同類型的癌中起癌基因的作用。IKKβ通過抑制上皮細(xì)胞中線粒體途徑的凋亡來促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[9]。IKKβ促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，抑制其凋亡[14]。IKKβ充當(dāng)某些miRNA的下游分子，以介導(dǎo)miRNA在不同腫瘤類型中的作用，包括miR-429和miR-497。本研究使用在線信息工具可預(yù)測(cè)IKKβ是miR-199a-5p的靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系和OSCC細(xì)胞中的IKKβ水平高于HOK細(xì)胞和匹配的相鄰細(xì)胞中的IKKβ水平。在腫瘤細(xì)胞中miR-199a-5p和IKKβ之間存在負(fù)相關(guān)。IKKβ的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-199a-5p在OSCC細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)引起的抑制作用。這表明miR-199a-5p通過靶向IKKβ發(fā)揮其抗腫瘤作用。

NFK-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子,由一個(gè)復(fù)雜的體系組成。NF-κB在腫瘤的抗凋亡機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。NF-κB的激活在人類幾種類型腫瘤的發(fā)病機(jī)理中很重要。在OSCC中，NF-κB具有組成性活性，參與促進(jìn)OSCC細(xì)胞的侵襲，這表明抑制NF-κB的活性可能構(gòu)成治療OSCC侵襲性的有前途的治療方法。miR-92b的上調(diào)會(huì)加速腫瘤的生長(zhǎng)，這種作用可能與OSCC中NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p的上調(diào)通過抑制IKKβ降低了關(guān)鍵NF-κB通路蛋白的水平。miR-199a-5p抑制IKKβ以抑制NF-κB活性，因此抑制OSCC細(xì)胞的惡性腫瘤。NF-κB與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲密切相關(guān)。NF-κB的激活是腫瘤細(xì)胞抵抗TNF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制,而抑制NF-κB的激活可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的大量凋亡。通過基因治療來抑制NF-κB的活性,再輔以常規(guī)的化療將有望成為一種治療口腔鱗癌的有效方法。

綜上所述，miR-199a-5p在OSCC細(xì)胞和細(xì)胞系中下調(diào)。還證明了miR-199a-5p通過抑制IKKβ發(fā)揮腫瘤抑制作用，后者抑制NF-κB途徑的激活，從而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移。這表明，miR-199a-5p可能是預(yù)后預(yù)測(cè)和治療策略的潛在靶標(biāo)。