彭子芳, 李 琴, 張光瑞, 趙無(wú)垛, 練鴻振, 張書(shū)勝*

(1. 鄭州大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 河南 鄭州 450001; 2. 鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所, 河南 鄭州 450008;3. 南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 南京 210023)

酚類是重要的有機(jī)化工原料,硝基苯酚因具有高毒、難降解等特點(diǎn)已被美國(guó)、歐洲等國(guó)家列為優(yōu)先防治污染物,因生產(chǎn)中產(chǎn)生大量含酚有害廢水[1,2],我國(guó)對(duì)排放污水中硝基苯酚類的含量也有嚴(yán)格要求[3]。環(huán)境雌激素己烯雌酚(DES)是一種內(nèi)分泌干擾物[4-6],長(zhǎng)期暴露于DES的環(huán)境中會(huì)引發(fā)免疫性和生殖性等疾病[7,8]。因此,準(zhǔn)確測(cè)定水中硝基苯酚及己烯雌酚含量對(duì)于環(huán)保及疾病預(yù)防具有重要意義[9,10]。

目前,用于環(huán)境水中酚類物質(zhì)的檢測(cè)方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11]、毛細(xì)管電泳法[12-14]、酶聯(lián)免疫測(cè)定法[15]、高效液相色譜法(HPLC)[16,17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-20]等,其中HPLC因其操作簡(jiǎn)單、成本低、重現(xiàn)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。在檢測(cè)痕量酚類物質(zhì)時(shí),常用液-液萃取(LLE)[21,22]和固相萃取(SPE)[23]對(duì)其進(jìn)行提取和凈化。其中,SPE因其所需溶劑少、萃取效率高、在線富集等優(yōu)點(diǎn)被優(yōu)先采用。我們課題組自制的四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪(tetraaza[2]arene[2]triazine, NCS)主體化合物具有多種作用位點(diǎn)[24],與溶質(zhì)可以發(fā)生π-π、包結(jié)、配位、氫鍵、陰離子交換作用[25],其作為SPE吸附劑已成功用于多種物質(zhì)的富集和純化[26]。

本文基于本實(shí)驗(yàn)室制備的四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪鍵合硅膠(NC-Si)吸附劑[27],研究建立SPE-HPLC同時(shí)測(cè)定河水中3種硝基苯酚和己烯雌酚的新方法,實(shí)現(xiàn)河水中硝基苯酚及己烯雌酚的準(zhǔn)確、可靠和靈敏檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀,內(nèi)置G1314VWD紫外檢測(cè)器、配備G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)Agilent公司); Bruker Vector 22紅外吸收光譜儀(Bruker,美國(guó)); Flash EA 1112元素分析儀(PE,美國(guó));姚儀牌TTL-DC Π型氮吹儀(北京華儀通泰科技有限公司);Milli Q Advantage超純水制備儀 (美國(guó)Millipore公司); KQ-3200E超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司); Mettler Toledo Xp205電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司); DHL-A電腦恒流泵(上?？等A生化儀器制造廠); YXJ-3離心機(jī)(江蘇石氏儀器廠); UV1600紫外分光光度計(jì)(浙江福立); pHS-25B數(shù)字酸度計(jì)(北京曙光明儀器公司)。移液槍(德國(guó));微孔濾膜:0.22 μm; 空固相萃取小柱(3 mL)和篩板(20 μm)(迪馬科技); C8色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,安捷倫公司,美國(guó))。

對(duì)硝基苯酚、2,4-二硝基酚、2,4,6-三硝基酚、己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)。氮?dú)?純度≥99.999%。甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠,色譜純);二氯甲烷(DCM)(分析純);氨水(純度為30%,北京伊諾凱科技有限公司);氨水-甲醇溶液(2∶98, v/v);研究過(guò)程中所使用的純水均經(jīng)過(guò)Milli-Q純水系統(tǒng)純化。

NCS的合成和NC-Si吸附劑的制備均參照本課題組之前的工作,分別見(jiàn)文獻(xiàn)[28]和文獻(xiàn)[27]。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及模擬水樣的配制

分別準(zhǔn)確稱取0.1 g(精確到0.1 mg)對(duì)硝基苯酚、2,4-二硝基苯酚、2,4,6-三硝基苯酚、己烯雌酚4種標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于冰箱中避光保存(酚類物質(zhì)暴露在空氣中容易被氧化變成紅色或褐色)。

4種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:分別取上述4種標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于100 mL容量瓶中,配制質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

模擬水樣的制備:取10 mg/L的4種酚的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于99 mL高純水中,超聲混勻,配制成含4種酚的模擬水樣。

1.3 樣品前處理

分別將黃河水(黃河水利委員會(huì)提供)、金水河水(取自鄭州市內(nèi)河)在4 000 r/min的速度下離心10 min,取上清液,經(jīng)過(guò)0.22 μm水系濾膜得到水樣,該水樣置于冰箱中備用。

準(zhǔn)確稱取0.1 g NC-Si裝入空的萃取小柱(3 mL,聚丙烯),用5 mL甲醇活化、5 mL水平衡。將待分析的100 mL水樣用0.1% (v/v,下同)磷酸調(diào)至pH 5后以5 mL/min的速度上樣。上樣后的固相萃取小柱用2 mL氨水-甲醇(2∶98, v/v)洗脫,洗脫液用氮吹儀吹干,然后用1 mL流動(dòng)相(甲醇-0.1%磷酸,40∶60,v/v)溶解超聲,0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)液相色譜儀檢測(cè)。

1.4 色譜條件

色譜柱:C8柱;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:20 μL;二元梯度洗脫,流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為0.1%磷酸溶液。洗脫程序?yàn)?0～11 min, 40%B; 11～15 min, 40%B～80%B; 15～20 min, 80%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)及色譜柱的選擇

紫外吸收結(jié)果表明,對(duì)硝基苯酚、2,4-二硝基酚、2,4,6-三硝基酚、己烯雌酚4種物質(zhì)在280 nm處吸收較弱,在210～230 nm、245～260 nm范圍有較強(qiáng)吸收,實(shí)驗(yàn)選取254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了在1 mL/min流速、檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm、30 ℃柱溫的相同色譜條件下,C8和C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,安捷倫公司,美國(guó))分離4種酚類物質(zhì)的效果,結(jié)果表明4種酚類物質(zhì)在C18柱上易拖尾,最終選用C8作為分離4種酚類物質(zhì)的色譜柱。

2.2 液相色譜流動(dòng)相的優(yōu)化

為了使4種酚的分離效果達(dá)到最佳,考察了不同體積比的甲醇和水對(duì)分離效果的影響,在甲醇含量較高時(shí),3種硝基酚的出峰時(shí)間都較早,不能完全分離。在甲醇-水(40∶60, v/v)時(shí)前3種物質(zhì)有較好的分離,但2,4-二硝基酚和2,4,6-三硝基酚易受到溶劑峰的影響,且?guī)追N物質(zhì)的峰形不對(duì)稱?；诜宇愇镔|(zhì)的弱酸性特征,可在流動(dòng)相中加酸抑制酚類弱酸的解離?？疾炝瞬煌w積比的甲醇-0.1%磷酸溶液對(duì)各物質(zhì)出峰情況的影響,結(jié)果表明在甲醇-0.1%磷酸(40∶60, v/v)時(shí),3種硝基酚在5～10 min出峰,分離較好,峰形對(duì)稱,但己烯雌酚在27 min出峰。為實(shí)現(xiàn)4種物質(zhì)同時(shí)、快速檢測(cè),實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫,取得了滿意的分離效果,4種酚標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的HPLC圖見(jiàn)圖1。

圖 1 4種酚類物質(zhì)的HPLC圖Fig. 1 Chromatogram of the mixture of four phenolic substances Conditions: C8 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase A, methanol; mobile phase B, 0.1% (v/v) phosphoric acid solution; the elution program: 0-11 min, 40%B; 11-15 min, 40%B-80%B; 15-20 min, 80%B; flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength, 254 nm; injection volume, 20 μL; column temperature, 30 ℃. Peaks: 1. 2,4,6-trinitrophenol; 2. p-nitrophenol; 3. 2,4-dinitrophenol; 4. diethylstilbestrol.

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

為實(shí)現(xiàn)對(duì)4種酚的高效富集,我們對(duì)影響SPE效率的洗脫劑種類、洗脫劑體積、樣品溶液pH等因素進(jìn)行了詳細(xì)考察,對(duì)模擬水樣(4種酚的質(zhì)量濃度為0.1 mg/L)平行測(cè)定3次,獲得SPE的優(yōu)化條件。

圖 2 (a)洗脫劑用量、(b)上樣體積、(c)樣品pH、(d)上樣速率和(e)重復(fù)利用次數(shù)對(duì)4種酚類物質(zhì)回收率的影響Fig. 2 Effects of (a) eluent dosage, (b)loading volume, (c) sample pH, (d) loading rate, and (e) reusable time on the recoveries of the four phenolic substances

2.3.1洗脫劑種類

考察了二氯甲烷、甲醇、正己烷這些常用的洗脫劑對(duì)4種物質(zhì)回收率的影響,二氯甲烷和甲醇可實(shí)現(xiàn)對(duì)硝基苯酚的高效洗脫。3種洗脫劑對(duì)2,4-二硝基苯酚、2,4,6-三硝基苯酚、己烯雌酚的洗脫率較低。在中性或酸性范圍下,NC-Si吸附劑上的氮原子質(zhì)子化而呈現(xiàn)陽(yáng)離子狀態(tài),提供了與陰離子相互作用的位點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)對(duì)4種酚的高效吸附。研究結(jié)果表明,在甲醇中加入少量氨水作為洗脫劑洗脫效果較好,可提高回收率。使用氨水-甲醇(2∶98, v/v)洗脫4種物質(zhì)的回收率在72%～95%之間。

2.3.2洗脫劑用量

考察了氨水-甲醇(2∶98, v/v)洗脫劑的用量(0.5、1、2、3、4 mL)對(duì)4種酚回收率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2a,洗脫劑用量為2 mL時(shí),4種物質(zhì)的回收率可達(dá)80%以上,因此選擇洗脫劑體積為2 mL。

2.3.3上樣體積

分別取1 mL 10 mg/L的4種酚的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入高純水中,制備25、50、100、250 mL 4種模擬水樣。上樣后用2 mL氨水-甲醇(2∶98, v/v)洗脫。結(jié)果(見(jiàn)圖2b)表明,回收率隨上樣量的增加并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。當(dāng)處理100 mL水樣時(shí),整個(gè)前處理過(guò)程可在30 min內(nèi)完成,實(shí)現(xiàn)快速高效富集。

2.3.4pH值

樣品溶液的pH值同時(shí)影響NC-Si和溶質(zhì)的質(zhì)子化,從而影響NC-Si吸附劑與酚類物質(zhì)的相互作用和保留,最終對(duì)富集效率產(chǎn)生較大的影響。將模擬水樣pH用1%H3PO4調(diào)節(jié)至3～7、用氨水調(diào)至7～9后分別上樣,進(jìn)行SPE實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖2c)表明,在pH 5～7時(shí),4種酚的回收率較大,pH>8時(shí)回收率快速降低。pH 5最佳。

2.3.5上樣速率的選擇

上樣速率也會(huì)對(duì)酚類物質(zhì)的保留產(chǎn)生影響,在上樣速率分別為2、3、4、5、6、7、8 mL/min時(shí),4種酚的SPE回收率結(jié)果見(jiàn)圖2d,可以看出,上樣速率在2～6 mL/min時(shí),回收率基本保持不變,流速大于6 mL/min時(shí),回收率會(huì)迅速降低,因此選取5 mL/min作為最佳上樣流速。

2.3.6NC-Si吸附劑的重復(fù)使用次數(shù)

將NC-Si固相萃取小柱反復(fù)使用5次后,回收率未見(jiàn)明顯降低(見(jiàn)圖2e),表明該NC-Si吸附劑具有良好的重復(fù)使用性能。

2.4 方法學(xué)考察

用流動(dòng)相(甲醇-0.1%磷酸,40∶60, v/v)逐級(jí)稀釋4種酚的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配成不同質(zhì)量濃度(1.0～50 μg/L)的100 mL水樣后,按1.3節(jié)方法處理后,取20 μL濾液進(jìn)行液相色譜分析,得到方法的線性方程、檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10),見(jiàn)表1。

表 1 方法的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定及回收率、精密度考察

用所建方法,對(duì)金水河和黃河水實(shí)際樣品中的酚進(jìn)行富集和測(cè)定,通過(guò)向?qū)嶋H樣品中加入低、中、高3個(gè)不同水平的4種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,依次進(jìn)行SPE富集和HPLC測(cè)定,計(jì)算回收率,見(jiàn)表2。結(jié)果表明,方法的加標(biāo)回收率在75.5%～104.2%(n=5)之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤6.3%,該方法呈現(xiàn)良好的回收率和精密度。相關(guān)色譜圖見(jiàn)圖3。

圖 3 實(shí)際河水樣品和加標(biāo)樣品經(jīng)過(guò)SPE處理后的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the real river water samples and spiked samples treated with SPE a. Yellow River water sample; b. the spiked Yellow River water sample; c. Jinshui River water sample; d. the spiked Jinshui River water sample. Conditions are the same as in Fig. 1.

表 2 水樣中4種酚的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

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3 結(jié)論

本文基于NC-Si吸附劑,獲得了NC-Si SPE富集河水中痕量的硝基苯酚及己烯雌酚的最佳條件,建立了SPE-HPLC測(cè)定水中4種痕量酚的分析方法。所建方法快速、準(zhǔn)確、可靠,可對(duì)4種痕量酚實(shí)現(xiàn)高效富集,成功地用于河水中4種酚的靈敏測(cè)定。