張月，崔旋旋，劉英學，蓋永強，樸美子*

1(青島農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266109)2(青島中一監(jiān)測有限公司，山東 青島，266100)

茯磚茶，又稱茯茶、福磚，是我國特有的一種黑茶品種，從外觀看呈長方磚形，色澤黑褐油潤，花香濃郁純正，因其藥效類似土茯苓，故又得名“茯磚”[1]。茯磚茶內部長有大量金黃色顆粒物質，俗稱為“金花”[2]。茯磚茶發(fā)花的本質就是利用溫度、濕度等外部條件加快益生菌——冠突散囊菌的生長繁殖，同時抑制其他菌落的生長，形成金黃色閉囊殼——金花，這是茯磚茶獨特品質形成的關鍵工序，也是其區(qū)別于其他黑茶制作的獨特工序[3]，使茯磚茶具有特有的菌落花香，使其滋味更加醇和清香[4-5]。

研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌具有抗氧化[6-7]、抑菌[7-8]、降脂[9-10]、產(chǎn)酶[11-12]等活性，受到越來越多研究者的關注。SALAZAR等[13]的研究結果表明冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物具有抑制細胞生長的作用，可能對抗腫瘤具有一定功效。李佳蓮等[14]發(fā)現(xiàn)“金花菌”發(fā)酵液對細菌有較強的抑制作用且對一定的溫度、紫外光和酸堿穩(wěn)定。唐萬達等[15]的研究結果表示，涇陽茯磚茶具有抗氧化酶活性且其與茶磚發(fā)花期產(chǎn)生的赤散囊菌有關。歐陽梅等[16]將“金花菌”接種到散茶中并測定發(fā)酵散茶的抗氧化活性，結果顯示，發(fā)酵散茶的抗氧化活性較散茶有一定提高，表明“金花菌”具有抗氧化活性。先前對冠突散囊菌的研究，主要集中在對茶葉固態(tài)發(fā)酵風味形成的影響以及菌種與其他原料共同發(fā)酵的功能活性，對純菌種發(fā)酵條件及活性研究較少，這也限制了基于冠突散囊菌的生產(chǎn)應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯磚茶，由青島農(nóng)業(yè)大學中韓食品生物技術研究所提供；馬鈴薯，購于青島大潤發(fā)春陽路店。

大腸桿菌1.873 2(Escherichiacoli)、腸沙門氏菌1.107 54(Salmonellaenterica)、枯草芽孢桿菌1.425 5(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌1.107 12(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌1.872 1(Staphylococcusaureus)，由青島農(nóng)業(yè)大學中韓食品生物技術研究所提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(patato dextrose agar，PDA)，北京陸橋技術股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖水(potato dextrose，PD)，青島高科園海博生物技術有限公司；DPPH·、三羥甲基氨基甲烷(Tris),美國Sigma公司；鄰苯三酚，國藥集團化學試劑有限公司；二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)，Solarbio公司；鄰二氮菲、鐵氰化鉀，天津廣成化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHP-9032電熱恒溫培養(yǎng)箱，中國龍口市先科儀器有限公司；IS-RDV3立式恒溫振蕩器，美國精騏有限公司；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器有限公司；YXQ-LS-SII高壓滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；DU-800型紫外分光光度計，美國貝克曼公司；RE-6000旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 茯磚茶中冠突散囊菌的分離及鑒定

1.3.1.1 菌株的分離、純化

無菌條件下，直接挑取茯磚茶上的金花閉囊殼，接種于PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，待菌落生長成黃色時，用無菌接種環(huán)挑取適量菌體進行平板劃線，多次劃線直到菌株初步純化。挑取平板上的金黃色單菌落，接種到PDA平板上，繼續(xù)培養(yǎng)直至菌落生長成黃色，得到目標菌株。挑取適量目標菌株的黃色閉囊殼至裝有100 mL無菌蒸餾水與玻璃珠的錐形瓶中，制成均勻的菌懸液，并進行10倍梯度稀釋。取10-3～10-6稀釋度的菌懸液200 μL分別涂布到PDA培養(yǎng)基上，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)3 d。選取長有單菌落的平板，得到的菌落即為目標單菌落，觀察菌落形態(tài)，并用顯微鏡觀察個體形態(tài)特征。

1.3.1.2 分離菌株的鑒定

將分離純化后的菌株接種至PDA培養(yǎng)基上，生長3 d，從培養(yǎng)皿中刮取菌絲，采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB)法提取真菌DNA，采用引物ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reation，PCR)擴增體系為：DNA模板1.0 μL；10×Buffer(含2.5 mmol/L Mg2+)，5.0 μL；Taq聚合酶 1.0 μL；脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)(10 mmol/L)，1.0 μL；ITS1引物1.5 μL；ITS4引物1.5 μL；ddH2O 39.0 μL；總體積50.0 μL。PCR反應參數(shù)：預變性，95 ℃，5 min；變性，95 ℃，30 s；退火，58 ℃，30 s；延伸，72 ℃，1 min；終延伸，72 ℃，7 min；35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)處理后送往上海生物工程股份有限公司進行測序。測序獲得的ITS基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中使用Blast進行比對。

1.3.2 GT-1菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化

以GT-1菌株發(fā)酵液提取物對DPPH·的清除能力為指標，確定該菌株的最佳發(fā)酵工藝。

1.3.2.1 GT-1菌株發(fā)酵液提取物的制備

將分離的單菌落接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～6 d，待斜面菌落由白色變?yōu)榈S色再變?yōu)榛液稚笳f明孢子成熟。用生理鹽水沖洗斜面制備孢子懸液，使其孢子濃度為1×108CFU/mL。取適量GT-1菌株孢子懸液接入滅菌后的PD中于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中25 ℃，160 r/min培養(yǎng)9 d，得到GT-1菌株發(fā)酵液。

發(fā)酵液過濾菌絲體，旋轉蒸發(fā)至原體積的1/10，加入3倍體積的無水乙醇，醇沉12 h后5 000 r/min離心10 min，取上清液旋蒸并冷凍干燥，得到GT-1菌株發(fā)酵液提取物。

1.3.2.2 GT-1菌株發(fā)酵液提取物清除DPPH·活性測定

將GT-1菌株發(fā)酵液提取物凍干粉配制成2.5 mg/mL的溶液，采用BOUGATEF等[17]的方法測定其對DPPH·的清除率。

1.3.2.3 GT-1菌株發(fā)酵條件單因素試驗

(1)碳源對發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響

在原有PD液體培養(yǎng)基的基礎上，分別改變其中的碳源為蔗糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖、乳糖，在40%裝液量、2%接種量，160 r/min，25 ℃條件下發(fā)酵9 d，比較發(fā)酵液提取物清除DPPH·活性的差異。

(2)氮源對發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響

在原有PD液體培養(yǎng)基的基礎上，分別改變其中的氮源為NaNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、酵母膏、蛋白胨，在40%裝液量、2%接種量，160 r/min，25 ℃條件下發(fā)酵9 d，比較發(fā)酵液提取物清除DPPH·活性的差異。

(3)發(fā)酵時間對發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響

裝液量40%、接種量3%，160 r/min，25 ℃，分別發(fā)酵3、6、9、12、15 d，比較不同發(fā)酵時間發(fā)酵液提取物清除DPPH·的活性。

(4)裝液量對發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響

分別以10%、20%、30%、40%、50%的裝液量，3%的接種量條件接種，于160 r/min，25 ℃條件下培養(yǎng)9 d，比較發(fā)酵液提取物清除DPPH·活性的差異。

(5)接種量對發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響

分別以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的接種量，40%的裝液量，于160 r/min，25 ℃條件下培養(yǎng)9 d，比較發(fā)酵液提取物清除DPPH·活性的差異。

1.3.2.4 GT-1菌株發(fā)酵條件正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結果，采用L9(33)正交試驗，以發(fā)酵時間、裝液量、接種量3個因素為影響因素，以清除DPPH·的能力為指標，對發(fā)酵工藝進行正交優(yōu)化，因素水平見表1。

表1 L9(33)正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels in L9(33) orthogonal experiment design

1.3.3 GT-1菌株發(fā)酵液提取物抗氧化活性研究

通過正交試驗得到GT-1菌株的最佳發(fā)酵條件，研究此條件下發(fā)酵液提取物的抗氧化活性。

(1)GT-1菌株發(fā)酵液提取物對DPPH·清除能力的測定采用BOUGATEF等[17]的方法，由清除率曲線擬合回歸曲線，并計算樣品清除DPPH·的IC50值。

(3)GT-1菌株發(fā)酵液提取物還原能力的測定采用鐵氰化鉀還原測定法[19]。

1.3.4 GT-1菌株發(fā)酵液提取物抑菌活性研究

將供試菌株活化后制備成菌濃度為106～108CFU/mL的菌懸液，以50 μg/mL青霉素為陽性對照，采用打孔法[20]對不同濃度發(fā)酵液提取物的抑菌活性進行研究。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化及鑒定結果

2.1.1 菌株的分離純化及形態(tài)特征

圖1為分離菌株在PDA培養(yǎng)基平板中的菌落特征，可以看出菌株是邊緣較為整齊的圓形菌落。培養(yǎng)初期，菌落為白色菌絲，3 d后菌落慢慢變?yōu)榈S色。最終成熟后菌落的邊緣為淡黃色，越往內部顏色越深，中心部位為褐色。菌落背面無脊無褶，呈深褐色。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of bacterial colonies

由圖2可知，分離菌株菌落由菌絲體及子囊果構成，子囊果呈球形，這與已發(fā)現(xiàn)的散囊菌的菌絲體及子囊果的形態(tài)結構非常相似[21]，內部具有許多小的子囊孢子和分生孢子，孢子外壁較粗糙，有刺狀突起。

a-分離菌株子囊果;b-分離菌株菌絲體圖2 分離菌株菌絲體及子囊果Fig.2 Mycelia and ascospores of isolated strains

2.1.2 菌株分子鑒定結果

經(jīng)PCR擴增后菌株的ITS區(qū)序列電泳結果如圖3所示。由電泳結果可知，擴增的菌株ITS區(qū)序列片段長度約為550 bp。經(jīng)上海生工測序后的結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，比對結果表明該序列與數(shù)據(jù)庫中Eurotiumcristatumstrain IT1824259(Sequence ID：KR812327.1)的相似度為99.57%，比對結果見圖4。綜合形態(tài)學和分子鑒定結果，鑒定該菌為冠突散囊菌，命名為Eurotialessp.GT-1。

圖3 ITS基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.3 PCR amplification product of ITS gene

圖4 分離菌株Blast比對結果圖Fig.4 Result of Blast comparison of isolated strain

2.2 GT-1菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 GT-1菌株發(fā)酵條件單因素試驗結果

GT-1菌株發(fā)酵條件單因素試驗結果如圖5所示。由圖5-a可知，當GT-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為麥芽糖時，所得發(fā)酵液提取物對DPPH·清除率為93.1%，顯著高于(P<0.05)其他組，故采用麥芽糖作為該菌株發(fā)酵的最佳碳源；由圖5-b可知，當GT-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源為酵母膏時，所得發(fā)酵液提取物對DPPH·清除率為95.3%，顯著高于(P<0.05)其他組，故采用酵母膏作為該菌株發(fā)酵的最佳氮源；由圖5-c可知，當發(fā)酵時間為9 d時，所得發(fā)酵液提取物對DPPH·清除率為90.9%，顯著高于(P<0.05)其他發(fā)酵時間；由圖5-d可知，當裝液量為10%時，所得發(fā)酵液提取物對DPPH·清除率為90.8%，顯著高于(P<0.05)其他裝液量；由圖5-e可知，當接種量為2%時，所得發(fā)酵液提取物對DPPH·清除率為90%，顯著高于(P<0.05)其他接種量。

2.2.2 GT-1菌株發(fā)酵條件正交實驗結果

如表2所示，3個單因素中，對菌株發(fā)酵液提取物DPPH·清除率影響順序為裝液量>接種量>發(fā)酵時間，最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間9 d、裝液量13%、接種量2.2%。

表2 正交試驗結果表Table 2 Results of the orthogonal experiment

a-碳源對發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響;b-氮源對發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響;c-發(fā)酵時間對發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響;d-裝液量對發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響;e-接種量對發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響圖5 單因素試驗結果Fig.5 The results of single factor experiment注：圖中不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05(下同)

在上述最優(yōu)條件下進行3次驗證實驗，得到GT-1菌株發(fā)酵液提取物對DPPH·的清除率達(93.9±1.12)%。

2.3 GT-1菌株發(fā)酵液提取物抗氧化活性研究

2.3.1 不同濃度GT-1菌株發(fā)酵液提取物對DPPH·的清除能力

如圖6所示，發(fā)酵液提取物對DPPH·的清除率隨著濃度增加而升高。當提取物的質量濃度為2.5 mg/mL時，其DPPH·清除率達到了93.9%，顯著高于(P<0.05)其他濃度，其IC50值為0.78 mg/mL。由此可知，GT-1菌株發(fā)酵液提取物具有較好的清除DPPH·的活性，與顏正飛等[22]的結論一致。

圖6 發(fā)酵液提取物濃度對DPPH·清除率的影響Fig.6 Effect of extract concentration of fermentation broth on DPPH free radical scavenging rate

圖7 發(fā)酵液提取物濃度對清除率的影響Fig.7 Effect of extract concentration of fermentation broth on free radical scavenging rate

2.3.3 不同濃度GT-1菌株發(fā)酵液提取物還原能力的測定

如圖8所示，發(fā)酵液提取物具有很強的還原性，隨提取物濃度增大還原力增強。當提取物質量濃度為3 mg/mL時，其還原力為0.98。

圖8 發(fā)酵液提取物濃度對還原能力的影響Fig.8 Effect of extract concentration of fermentation broth on reducing power

綜上所述，GT-1菌株發(fā)酵液具有較好的抗氧化活性，這可能與其菌體孢子壁質地堅硬可抗腐蝕且自身具備一定自由基清除能力有關。另外，其在發(fā)酵過程中可能產(chǎn)生過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等具有抗氧化活性的酶類及苯甲醛類、多酚類代謝產(chǎn)物也是其具有較強的抗氧化活性的原因之一[7,15,22-24]。

2.4 GT-1菌株發(fā)酵液提取物抑菌活性研究

如表3所示，GT-1菌株發(fā)酵液提取物對大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌及腸沙門氏菌均具有一定的抑菌效果，且隨發(fā)酵液提取物濃度的增加而有顯著性增強(P<0.05)，這可能與其發(fā)酵液中含有大黃素蒽醌類、苯甲醛類、酚類和苯甲酸類這4種具有良好抑菌效果的化合物密切相關[7]。

表3 發(fā)酵液提取物濃度對抑菌活性的影響Table 3 Effect of extract concentration of fermentation broth on antimicrobial activity

3 結論