張婧怡，李 瑞△，曹昺焱，宋姍姍，金永祚，金奉奎，段浩茹

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)又稱為非胰島素依賴性糖尿病，臨床以慢性高血糖為主要癥狀，常合并多個代謝綜合征，如高血壓、高血脂，對人體危害性極大。根據(jù)2017年中國2型糖尿病防治指南[1]，我國患病率高達(dá)10.4%?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要以降糖藥物如二甲雙胍、α-糖苷酶抑制劑或胰島素注射等手段對患者血糖進(jìn)行控制，易有諸多不良反應(yīng)或藥物耐受等情況，且醫(yī)療支出高昂，對國家或地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展不利。針灸療法已被證實(shí)可有效降低T2DM患者血糖[2]，且具有高效、價廉和副作用小等優(yōu)點(diǎn)，臨床應(yīng)用價值極高。

胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)是T2DM的主要致病因素及病理生理學(xué)特征[3]，直接引起胰島素調(diào)控葡萄糖代謝能力下降。氧化應(yīng)激(Oxidativestress,OS)可通過激活蛋白激酶C[4]、cJun氨基末端激酶通路[5]和核轉(zhuǎn)錄因子[6]等多途徑，干擾胰島素信號通路，并且破壞線粒體形態(tài)功能，是引起IR的重要因素之一。本研究將選取優(yōu)勢經(jīng)驗(yàn)穴組，通過對T2DM大鼠血糖、自由基和抗氧化因子水平分析，結(jié)合電鏡觀察骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)，研究電針對2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激、線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的影響，探討電針治療2型糖尿病的治療機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取7只2月齡體質(zhì)量為140～160 g的SPF級雄性非糖尿病大鼠(Zucker lean,ZL)(fa/+)及14只2月齡同體質(zhì)量的SPF級雄性Zucker糖尿病肥胖大鼠(Zucker diabetic fatty rat,ZDF) (fa/fa)。兩種大鼠皆購自北京維通利華公司[許可證號SCXK(京)2016-0006]。實(shí)驗(yàn)大鼠均于室溫23°C，空氣流通良好，相對濕度50%～60%，且12 h晝夜循環(huán)光照環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)4周，期間全部大鼠自由飲食水。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

ACCU-CHEK血糖儀(德國羅氏公司，LOT 10129770);羅氏血糖試紙(LOT 24685431);Purina #5008飼料(粗蛋白≥23.0%，粗脂肪≥6.5%，粗纖維≤4.0%，高糖高脂飼料);中研太和牌針灸針0.13 mm×7 mm(212161123，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司);采血針(華鴻牌);電針儀(英迪牌電針儀);自制鼠套等。

1.3 模型建立與分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)后，全部大鼠均改為Purina #5008飼料持續(xù)喂養(yǎng)。4周誘導(dǎo)飼養(yǎng)后，取大鼠尾尖靜脈血，測其空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)及口服葡萄糖耐量試驗(yàn)2 h血糖(OGTT2h)，以二者血糖均>11.1 mmol/L為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)FBG水平將成模的ZDF大鼠隨機(jī)區(qū)組，分為模型組、電針組兩組。7只ZL大鼠為空白組。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 空白組及模型組 不干預(yù)。

1.4.2 電針組 將大鼠固定于自制棉鼠套靜置5 min，針刺雙側(cè)“后三里”“三陰交”“脾俞”“胃脘下俞”，并連通電針儀，電針一端連接于“后三里”，一端連接同側(cè)“胃脘下俞”，以連續(xù)波、頻率15 Hz、電流輸出強(qiáng)度2 mA刺激穴位，留針20 min，每日1次，共4周，第7、14、21、28天不進(jìn)行干預(yù)。

以上各種干預(yù)操作均于每日13:00—18:00期間進(jìn)行，連續(xù)干預(yù)4周。于干預(yù)第6、13、20、27天晚20:00禁食，次日早8:00檢測空腹體重、血糖。

1.5 指標(biāo)檢測

所有動物全部干預(yù)結(jié)束后，自由飲食水，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)晚22:00禁食，次日早8:00以2%戊巴比妥鈉溶液按照45 mg/kg的藥量比腹腔注射麻醉，腹主動脈取血5～10 mL離心管中，室溫靜置凝固后，于4℃條件下3 000 r/min離心15 min分離血清，運(yùn)用全自動生化分析儀檢測：總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量。

1.6 胰島素抵抗指數(shù)

根據(jù)胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)計算公式：HOMA-IR=(空腹血糖×空腹胰島素)/22.5，計算各組大鼠全部干預(yù)結(jié)束后胰島素抵抗指數(shù)。

1.7 統(tǒng)計分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG比較

由表1可知，造模前后，模型組與電針組大鼠FBG差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。造模后模型組與電針組較空白組FBG明顯升高(P<0.05)，提示造模成功。全部干預(yù)結(jié)束后，模型組與電針組較空白組FBG值仍有升高(P<0.05)；模型組較電針組FBG值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但全部干預(yù)后電針組FBG較干預(yù)前FBG有所降低(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而全部干預(yù)結(jié)束后模型組FBG較干預(yù)前FBG差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，顯示電針組具有一定降糖效果。

表1 各組大鼠造模前后與全部干預(yù)后FBG比較

2.2 各組大鼠全部干預(yù)后HOMA-IR比較

由表2可知,與空白組比較，模型組、電針組HOMA-IR值明顯升高(P<0.01)，模型組與電針組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)合MS比較，電針組HOMA-IR略低于模型組。

表2 各組大鼠全部干預(yù)后HOMA-IR比較

2.3 各組大鼠血清T-AOC、ROS、MDA和SOD水平比較

由表3可知，模型組、電針組與空白組相比，T-AOC、SOD降低(P<0.05)，ROS、MDA均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組ROS、MDA有所減少(P<0.05)，T-AOC較之增加(P<0.05)。而二者間SOD差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但結(jié)合MS分析，電針組SOD略高于模型組。

2.4 各組大鼠股四頭肌線粒體電鏡觀察

通過電鏡觀察可知，空白組大鼠股四頭肌線粒體多呈長橢圓形，線粒體嵴清晰，結(jié)構(gòu)完整，排列緊密；模型組線粒體出現(xiàn)不同程度結(jié)構(gòu)缺失，線粒體嵴模糊，結(jié)構(gòu)松散，排列稀疏松散，甚至部分呈空泡狀；電針組較模型組有所改善，大部分線粒體結(jié)構(gòu)正常，有部分嵴模糊，但基本具有完整結(jié)構(gòu)。見圖1。

表3 各組大鼠血清T-AOC、ROS、MDA和SOD水平比較

圖1 電鏡下各組大鼠股四頭肌線粒體(120 000×)

3 討論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體遭受有害刺激后，體內(nèi)活性氧(ROS)等自由基產(chǎn)生過多導(dǎo)致組織損傷[7]，而ROS主要來源之一就是線粒體。線粒體是機(jī)體最重要的能量供應(yīng)中心，提供了生命活動所需的90%三磷酸腺苷(ATP)。在合成ATP過程中，部分氧分子被還原成ROS。正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)具有完善的抗氧化系統(tǒng)，自由基與抗氧化因子保持著動態(tài)平衡，如超氧化物歧化酶(SOD)，可與O2-發(fā)生反應(yīng)，將對機(jī)體有害的自由基轉(zhuǎn)化為無害的H2O和O2，有效控制體內(nèi)自由基水平[8]。而病理狀態(tài)下，ROS過量產(chǎn)生，其水平超出氧化物清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，可引起生物膜結(jié)構(gòu)及其功能被破壞，最終降解為丙二醛(MDA)[9]。另一方面，由于線粒體結(jié)構(gòu)獨(dú)特，其DNA幾乎全部由編碼區(qū)構(gòu)成，沒有保護(hù)蛋白，也是ROS主要攻擊對象。OS狀態(tài)下，ROS可直接干擾線粒體DNA、RNA復(fù)制，破壞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)，引起線粒體功能障礙[10]。而線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，又會增加ROS產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)。由于ATP是人體能直接利用的唯一能源，且90%以上由線粒體的氧化磷酸化過程產(chǎn)生。線粒體結(jié)構(gòu)、功能損傷會導(dǎo)致其對葡萄糖的氧化分解減少、ATP生成減少，機(jī)體能量供應(yīng)不足，在宏觀上表現(xiàn)為胰島素抵抗和高血糖狀態(tài)[11]。

臨床上，針灸已被廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病患者[12]，且對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)有明顯改善作用。李海燕等[13]通過實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了針灸可降低人體膽固醇、甘油三酯和HOMA-IR等指標(biāo)。在治療氧化應(yīng)激方面，也有多個研究表明[14-16]，針灸具有良好抗氧化作用，可以有效降低機(jī)體MDA水平，提高SOD活性及其水平，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化因子的平衡，緩解氧化應(yīng)激。同時，針灸也可保護(hù)機(jī)體線粒體，高明等[17]發(fā)現(xiàn)針刺對線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)、數(shù)量有明顯的正向影響。李強(qiáng)等[18]對IR狀態(tài)下的大鼠進(jìn)行針刺干預(yù)，結(jié)果顯示針刺組較模型組ATP生成量增加，說明針灸提高了線粒體合成ATP能力，保護(hù)了線粒體正常形態(tài)及功能。

《靈樞·本臟》曰：“脾脆則善病消癉易傷”，說明消渴與中焦脾胃關(guān)系極為密切，脾胃失常可多方面影響機(jī)體，最終發(fā)為消渴。脾為后天之本，負(fù)責(zé)運(yùn)化水谷，輸布水谷精微，且脾主肌肉，這與現(xiàn)代研究中骨骼肌承擔(dān)80%葡萄糖的攝取及代謝不謀而合[19]。同時，脾虛者因其運(yùn)化水谷能力減弱，四肢百骸不得滋養(yǎng)而易乏力，也與2型糖尿病患者常見乏力癥狀相符。在IR狀態(tài)下，線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后代謝過程出現(xiàn)障礙，機(jī)體ATP生成減少，生命活動所需能量減少，易產(chǎn)生乏力、倦怠。因此，本研究中選取了足三里、脾俞、胃脘下俞3穴進(jìn)行針灸刺激。足三里、脾俞，一為胃經(jīng)要穴，一為背俞穴，可直接調(diào)理脾胃，改善機(jī)體水谷運(yùn)化，調(diào)節(jié)氣機(jī)；《難經(jīng)》記載:“脾重二斤三兩，扁廣三寸，長五寸，有散膏半斤”，結(jié)合現(xiàn)代解剖學(xué)分析，中醫(yī)之脾也包括胰腺，即“散膏”也，因此選取胃脘下俞調(diào)節(jié)脾胃功能，且胃脘下俞也為治療消渴經(jīng)驗(yàn)用穴；三陰交為肝、脾、腎三陰經(jīng)交會穴，肝藏血，脾統(tǒng)血，腎藏精，精血相生，對與血相關(guān)的疾病有明顯治療作用。

本研究中，經(jīng)電針刺激后三里、脾俞、胃脘下俞、三陰交4穴后，電針組大鼠較模型組：T-AOC升高(P<0.05)，抗氧化因子SOD含量也有所提高，反之ROS、MDA降低(P<0.05)，說明電針可緩解機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)。從電鏡觀察可知，電針組大部分線粒體嵴清晰，細(xì)胞器膜完整，分布緊密，說明氧化應(yīng)激得到緩解后，骨骼肌線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)受損程度減輕。與此同時，這也使得線粒體途徑產(chǎn)生ROS減少，形成良性循環(huán)。通過分析比較兩組HOMA-IR可知，電針組胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)較模型組有所改善，證實(shí)了氧化應(yīng)激與胰島素抵抗存在關(guān)聯(lián)性，且電針可減緩IR。比較兩組血糖，可發(fā)現(xiàn)電針組血糖得到良好控制(P<0.05)，明顯優(yōu)于模型組，電針具有顯著改善2型糖尿病大鼠血糖作用。

綜上所述，電針可通過調(diào)控氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)，由此保護(hù)線粒體免受氧化應(yīng)激損傷，維護(hù)線粒體正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少其功能障礙、數(shù)量減少，增加2型糖尿病大鼠葡萄糖代謝能力，以此改善胰島素抵抗、降低血糖。