周麗君，楊苗苗，魏春艷，潘長(zhǎng)沛，黃時(shí)海

(廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西壯族自治區(qū) 南寧，530000)

益生菌是人和動(dòng)物體腸道內(nèi)的正常菌群，可用來(lái)開(kāi)發(fā)功能性食品。功能性食品是新興領(lǐng)域，可促進(jìn)健康，為消費(fèi)者提供多種食品選擇[1]。乳酸桿菌作為動(dòng)物體內(nèi)重要的益生菌，可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力和抵抗力[2]。在乳酸桿菌屬中，唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)和發(fā)酵乳桿菌是人類(lèi)唾液中最常見(jiàn)的2種菌[3-4]。唾液乳桿菌具有極大的黏附咽黏膜的潛力[5]，且具有抗部分腸道或陰道乳酸桿菌和根除無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae，GBS)的效果,可用于新型乳基益生菌發(fā)酵食品[6-7]。其他唾液乳桿菌菌株都已被證明在動(dòng)物模型[8]和人體臨床試驗(yàn)[9]中均有良好的耐受性和安全性，包括孕婦在內(nèi)[10-12]。唾液乳桿菌作為一種具有極大潛力的益生性乳桿菌已成為近年研究的熱點(diǎn)，正被廣泛用于制成適用于人和動(dòng)物的益生菌制劑[13-16]。目前由唾液乳桿菌制備的相關(guān)益生菌制劑已在市場(chǎng)上銷(xiāo)售[17]。隨著對(duì)唾液乳桿菌的深入研究，將會(huì)有更多的適用于人和動(dòng)物的微生態(tài)制劑問(wèn)世。

高抗氧化型乳酸菌能提高植物抗氧化活性和植物化學(xué)濃度[18]，幫助清除人體內(nèi)自由基，提高細(xì)胞抗氧化能力，增強(qiáng)免疫力[19]。乳酸菌被認(rèn)為是兼性厭氧型細(xì)菌，抗氧脅迫機(jī)制尚不完善。在O2存在的情況下，菌株自身代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧族，嚴(yán)重危害菌株的生長(zhǎng)和生存。因此降低活性氧族的傷害，是提高乳酸菌生物量和菌體存活的有效手段之一[20]。可從2個(gè)方面入手，一方面是向培養(yǎng)基中直接添加過(guò)氧化氫酶。由于乳酸菌生長(zhǎng)是不斷酸化的過(guò)程，處于細(xì)胞外的過(guò)氧化氫酶可能由于pH值不斷降低導(dǎo)致其活性也不斷降低。另一方面，對(duì)部分菌株而言，在培養(yǎng)過(guò)程中加入特定物質(zhì)以激活呼吸鏈，表達(dá)內(nèi)源過(guò)氧化氫酶[21-22]，從而達(dá)到促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，并減弱活性氧族的威脅，提高細(xì)胞的存活力等目的[23]。

一條有功能的呼吸鏈，至少具備獲取電子及H+的脫氫酶類(lèi)，負(fù)責(zé)傳遞電子的醌類(lèi)物質(zhì)和將電子及H+交給分子氧的細(xì)胞色素氧化酶這3個(gè)部分[20]。在有氧培養(yǎng)過(guò)程中，隨著血紅素(heme)或血紅素與四烯甲萘醌(VK2)獲得及O2的參與，呼吸鏈將被激活，乳酸乳球菌、植物乳桿菌等具備有氧呼吸潛力的菌株可以由發(fā)酵作用進(jìn)入有氧呼吸階段。通過(guò)研究基因信息對(duì)比證實(shí)唾液乳桿菌呼吸鏈組成，在外源添加血紅素的情況下，乳酸菌的細(xì)胞色素氧化酶能被激活，使菌株能夠進(jìn)行有氧呼吸[21]。值得注意的是，雖然唾液乳桿菌具備了多數(shù)有氧呼吸所需要的基因，但是沒(méi)有報(bào)道、實(shí)驗(yàn)中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該菌具有有氧呼吸的潛力。另一方面在有氧培養(yǎng)過(guò)程中乳酸菌會(huì)產(chǎn)生大量的H2O2，高濃度的H2O2并不能通過(guò)有氧呼吸進(jìn)行降解，唾液乳桿菌具有血紅素依賴(lài)的過(guò)氧化氫酶基因[20]，因此可以探究?jī)?nèi)源過(guò)氧化氫酶和外源過(guò)氧化氫酶對(duì)唾液乳桿菌的作用。

傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵多為無(wú)氧或靜置培養(yǎng)，菌株生長(zhǎng)過(guò)程中較少接觸到分子氧，受到的氧脅迫作用較為有限；但現(xiàn)代化工廠(chǎng)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)、儲(chǔ)存及銷(xiāo)售過(guò)程，則往往難以避免O2的接觸，氧脅迫對(duì)菌株生存生長(zhǎng)造成的不利影響更為明顯[20]。本實(shí)驗(yàn)就唾液乳桿菌抗氧脅迫、有氧生長(zhǎng)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

唾液乳桿菌GDW1994(Lactobacillussalivarius)由廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院自主分離、篩選和保藏。

MRS 肉湯: 蛋白胨 10 g/L，牛肉浸汁 10 g/L，酵母浸汁 10 g/L，葡萄糖 5 g/L，吐溫-80 1 mL/L， 番茄汁 200 g/L；pH 6.2， 115 ℃高壓蒸汽滅菌 30 min。

MRS瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸汁10 g/L，酵母浸汁10 g/L，葡萄糖5 g/L，吐溫-80 1 mL/L，番茄汁200 g/L，瓊脂15 g/L；pH 6.2，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

30%(體積分?jǐn)?shù))H2O2、四烯甲萘醌(VK2)、血紅素(heme)、過(guò)氧化氫酶(catalase)、Marker DNA，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MQD-S3R恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海旻泉儀器有限公司；NanoDrop one微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì),Thermo Fisher；LRH-250A生化培養(yǎng)箱,韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；biometra tone基因擴(kuò)增儀,德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司；Czone 8菌落計(jì)數(shù)儀,杭州訊數(shù)科技有限公司；Toledo 320 pH計(jì),METTLER TOLEDO。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化與保藏

MRS肉湯為篩選培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)。稀釋涂布，培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯單菌落，挑選形態(tài)飽滿(mǎn)單菌落至MRS液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行多次劃線(xiàn)傳代培養(yǎng)后，挑選形態(tài)特征與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[22]對(duì)乳酸菌描述(圓形、表面光滑、乳白色等)相一致的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，生理生化鑒定及16S rDNA 測(cè)序鑒定。將篩選的菌株接種于MRS肉湯中，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)12 h，并傳至3代備用。將純化后的菌種富集培養(yǎng)，再與30%(體積分?jǐn)?shù))甘油以體積比1∶1混合至-80 ℃冰箱中保藏[22]。

1.3.2 菌種鑒定

采用《乳酸細(xì)菌現(xiàn)代研究實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[23]中所述方法對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。將篩選出抗氧化性強(qiáng)的乳酸菌進(jìn)行16S rDNA 序列分析。采用《乳酸細(xì)菌現(xiàn)代研究實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[23]中所述方法提取基因組DNA。設(shè)計(jì)細(xì)菌的16S rDNA 序列引物。正向引物：TGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物：TACGGCTACCTTGTTA-CGAC。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如表1和表2所示[24]。

表1 PCR反應(yīng)體系 單位：μL

表2 PCR反應(yīng)程序Table 2 PCR response procedure

將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定

發(fā)酵液中的活菌數(shù)按GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[25]中的方法測(cè)定，并轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.4 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

將分離純化后的唾液乳桿菌接種至MRS液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，取活化后的菌液以接種量為1%接種至50 mL的MRS培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔3 h取1次樣，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)生物量[3]。然后以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，生物量為縱坐標(biāo)，繪制唾液乳桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.5 有氧培養(yǎng)對(duì)生物活性的影響

將菌株按1%接種量在MRS培養(yǎng)基中分別進(jìn)行有氧條件、無(wú)氧條件培養(yǎng)，每隔7 h后取1 mL菌液稀釋相應(yīng)的3個(gè)梯度，涂布平板，每個(gè)梯度3個(gè)平行，將平板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀記錄細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 菌株GDW1994對(duì)酸的耐受性測(cè)定

將菌株在MRS培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)15 h，取1 mL菌液使用高速冷凍離心機(jī)8 000 r/min 4 ℃離心10 min收集菌體，使用蒸餾水洗滌3次，分別用 pH值為2、3、4、5、6的新鮮MRS培養(yǎng)基重懸菌體，37 ℃靜止保溫1 h后，稀釋平板涂布，同時(shí)統(tǒng)計(jì)1 mL未經(jīng)酸處理的菌液中活菌數(shù),處理后的活菌數(shù)與未處理的活菌數(shù)之比為細(xì)胞存活率。

1.3.7 菌株GDW1994對(duì)H2O2的耐受性測(cè)定

將菌株按1%接種量接種于 MRS 液體培養(yǎng)基中，有氧培養(yǎng)15 h，取1 mL菌液使用高速冷凍離心機(jī)8 000 r/min，4 ℃離心10 min收集菌體，使用蒸餾水洗滌3次，分別用濃度為2、3、4、5、6 mmol/L H2O2的新鮮MRS培養(yǎng)基重懸菌體，37 ℃靜止保溫1 h后，稀釋平板涂布，同時(shí)統(tǒng)計(jì)1 mL未經(jīng)H2O2處理的菌液中活菌數(shù)。處理后的活菌數(shù)與未處理的活菌數(shù)之比為細(xì)胞存活率。

1.3.8 菌株GDW1994內(nèi)源有氧呼吸

菌株GDW1994接入優(yōu)化的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中分別加入VK2、heme、VK2+ heme，進(jìn)行有氧培養(yǎng)12 h，測(cè)活菌數(shù)。

1.3.9 外源及內(nèi)源過(guò)氧化氫酶對(duì)菌株的影響

將菌株GDW1994接入MRS液體培養(yǎng)基中，分別加入VK2和血紅素，為實(shí)驗(yàn)組，加入30 g/L過(guò)氧化氫酶，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)為對(duì)照組。進(jìn)行有氧培養(yǎng)12 h，每隔3 h取樣，測(cè)生物量。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均在 160 r/min、 37 ℃ 搖床中培養(yǎng)12 h，放入4 ℃冰箱中保存，每隔2 d測(cè)1次活菌數(shù)。

1.3.10 培養(yǎng)基的優(yōu)化

以MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后，以生物活性為考察目標(biāo)[26]。葡萄糖為碳源，蛋白胨、酵母粉和牛肉膏為混合碳源，利用L9(43)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)9種增殖培養(yǎng)基，將唾液乳桿菌過(guò)夜培養(yǎng)后，以1%接種量分別接種于上述增殖培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h 后，將所有三角瓶放入冰箱中終止培養(yǎng)，進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè)[27]。L9(43)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3所示。

表3 MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基碳氮源正交優(yōu)化 單位：g/L

無(wú)機(jī)鹽為CH3COONa、MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O，在確認(rèn)最適宜碳源、氮源質(zhì)量濃度后，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)9種增殖培養(yǎng)基，如表4所示。唾液乳桿菌經(jīng)MRS培養(yǎng)基過(guò)夜活化后，以1%接種量分別接種于上述增殖培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，放入冰箱終止培養(yǎng)，進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè)。

表4 MRS無(wú)機(jī)鹽正交優(yōu)化 單位：g/L

1.3.11 培養(yǎng)條件優(yōu)化

在培養(yǎng)基配方優(yōu)化完成的基礎(chǔ)上，以接種量1%(體積分?jǐn)?shù))，過(guò)氧化氫酶20 g/L，起始pH 6.0，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度分別為30、34、47、40、44 ℃下培養(yǎng)12 h。全部放置冰箱中終止培養(yǎng)，進(jìn)行稀釋涂布活菌計(jì)數(shù)。

在培養(yǎng)基配方優(yōu)化完成的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基調(diào)至初始pH值分別為5.5、6.0、6.2、6.4、6.9，接種量1%，過(guò)氧化氫酶20 g/L，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度37 ℃的搖床中培養(yǎng)12 h后，全部移至冰箱終止培養(yǎng)，進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè)。

在培養(yǎng)配方優(yōu)化完成的基礎(chǔ)上，起始pH值為6.4，過(guò)氧化氫酶20 g/L，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，放置轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度37 ℃的搖床中培養(yǎng)12 h后，全部移至冰箱中終止培養(yǎng)，進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè)。

在培養(yǎng)基配方優(yōu)化完成的基礎(chǔ)上，接種量為4%，起始pH值為6.4，過(guò)氧化氫酶20 g/L轉(zhuǎn)速分別為 140、 160、 180、 200、 220 r/min，溫度37 ℃搖床中培養(yǎng)12 h后，全部移至冰箱終止培養(yǎng)，進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè)。

在培養(yǎng)基配方優(yōu)化完成的基礎(chǔ)上，接種量為4%，起始pH值為6.4，過(guò)氧化氫酶分別為0、10、20、30、40 g/L，放置轉(zhuǎn)速160 r/min，溫度37 ℃的搖床中培養(yǎng)12 h后，全部移至冰箱終止培養(yǎng)，進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè)[26]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)均為平行測(cè)定3次以上取平均值，并計(jì)算出正負(fù)標(biāo)準(zhǔn)偏差，用誤差線(xiàn)表示。使用Stat-graphics Centurion XVI程序通過(guò)簡(jiǎn)單和多變量的方差分析以及95%的置信水平評(píng)估，在所獲得的結(jié)果上考慮不同變量的統(tǒng)計(jì)顯著性程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

GDW1994菌株在MRS培養(yǎng)基上稀釋涂布培養(yǎng)后，生長(zhǎng)良好，MRS瓊脂上菌落大小為0.6～1.5 mm，圓形、呈乳白色、邊緣整齊、表面光滑并凸起。革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性，生理生化鑒定如表5所示，根據(jù)《伯杰氏菌種鑒定手冊(cè)》[22]對(duì)比，可以初步鑒定所分離的菌株為乳桿菌屬。

表5 菌株GDW1994的生理生化鑒定表Table 5 Physiological and biochemical identification form of GDW 1994

菌株GDW1994擴(kuò)增后得到1 500 bp左右的DNA序列如圖1所示。將結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可確定為唾液乳桿菌。菌株GBE17 與Lactobacillussalivariusstrain(JQ837457.1)，GBE29與L.salivariusstrain (CP029616.1)有最接近的親緣關(guān)系，相似度達(dá)到96%。

1-Marker；2-菌株GDW1994圖1 菌株GDW1994 PCR電泳圖Fig.1 GDW1994 PCR electrophoresis of strain

圖2 菌株GDW1994的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Systemic tree of strain GDW1994

2.2 唾液乳桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)

由圖3可知，菌株GDW1994在經(jīng)過(guò)3 h的延滯期后，即開(kāi)始快速生長(zhǎng)，6 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在此期間菌體生長(zhǎng)繁殖速度較快，pH值隨代謝產(chǎn)物乳酸及其他有機(jī)酸的累積而下降較快。在培養(yǎng)了約15 h以后，菌體進(jìn)入平穩(wěn)期，菌體密度基本維持不變。

圖3 菌株GDW1994的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.3 Growth curve of GDW1994

2.3 有氧培養(yǎng)對(duì)菌株GDW1994的影響

2.3.1 有氧培養(yǎng)對(duì)生物活性的影響

如圖4所示，在無(wú)氧培養(yǎng)條件下，唾液乳桿菌培養(yǎng)14 h后，活菌數(shù)達(dá)到最高為1.45×109CFU/mL，此后隨著時(shí)間的增加，活菌數(shù)開(kāi)始迅速下降，當(dāng)培養(yǎng)49 h后，活菌數(shù)開(kāi)始呈數(shù)量級(jí)下降，說(shuō)明無(wú)氧培養(yǎng)會(huì)使唾液乳桿菌到達(dá)穩(wěn)定并死亡；而有氧培養(yǎng)的發(fā)酵乳桿菌細(xì)胞活力比較穩(wěn)定，在49 h內(nèi)活菌數(shù)一直穩(wěn)定在8×108CFU/mL左右。說(shuō)明有氧培養(yǎng)對(duì)唾液乳桿菌的生物活性和保存時(shí)間具有積極作用。另一方面，有氧培養(yǎng)的最高菌密度比無(wú)氧培養(yǎng)低，從提高唾液乳桿菌的抗氧脅迫能力和優(yōu)化有氧培養(yǎng)條件對(duì)達(dá)到高密度且不易死亡來(lái)說(shuō)具有一定意義。

圖4 有氧培養(yǎng)對(duì)菌株GDW1994的影響Fig.4 Effect of strain GDW1994 on aerobic culture

2.3.2 有氧條件下對(duì)酸的耐受性測(cè)定

唾液乳桿菌應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，必須要有耐酸能力。由圖5可知，有氧條件下，菌株在pH值為3時(shí)，存活率可達(dá)80%左右，當(dāng)pH值為2時(shí)菌株存活率降至17%左右。說(shuō)明pH對(duì)唾液乳桿菌活性有一定影響，可以推斷唾液乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸使培養(yǎng)基中pH值降低，從而造成菌株迅速死亡。在有氧條件下，菌株培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基終pH值為4.5左右；無(wú)氧條件下，菌株培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基終pH值為3.7左右，由此也可說(shuō)明有氧培養(yǎng)更有利于菌株培養(yǎng)與保藏。

圖5 pH對(duì)菌株GDW1994的影響Fig.5 Effect of pH on strain GDW1994

2.3.3 H2O2的耐受性測(cè)定

有氧培養(yǎng)過(guò)程中，菌株沒(méi)有產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的能力，導(dǎo)致培養(yǎng)基中H2O2的積累，從而對(duì)菌株產(chǎn)生毒性作用。由圖6可知，當(dāng)H2O2的濃度為2 mmol/L時(shí)，菌株GDW1994的存活率約為81%；隨著H2O2濃度的增加，菌株存活率開(kāi)始下降；當(dāng)H2O2濃度為6 mmol/L時(shí)，菌株存活率僅為32%，說(shuō)明H2O2對(duì)菌株活性影響較大。

圖6 H2O2對(duì)菌株GDW1994的影響Fig.6 Effect of H2O2 on strain GDW1994

2.4 菌株GDW1994內(nèi)源有氧呼吸結(jié)果

菌株若要進(jìn)行有氧呼吸，必須具備執(zhí)行該功能的所有組分，既必須要有一條可以發(fā)揮功能的呼吸鏈。由圖7可知，菌株GDW1994不具備完整的醌類(lèi)物質(zhì)合成能力，其呼吸鏈的激活需要同時(shí)外加heme和VK2，從而內(nèi)源產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶。最高活菌數(shù)可達(dá) 3×109CFU/mL。

圖7 內(nèi)源過(guò)氧化氫酶對(duì)菌株GDW1994的作用Fig.7 Effect of endogenous catalase on GDW1994

2.5 外源及內(nèi)源過(guò)氧化氫酶對(duì)菌株GDW1994的影響

由圖8可知，有氧呼吸對(duì)菌株GDW1994帶來(lái)顯著變化是發(fā)生在指數(shù)后期、穩(wěn)定期。加入過(guò)氧化氫酶或VK2和heme，生物量明顯增高，細(xì)胞生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)。由于細(xì)胞外環(huán)境復(fù)雜多變，外源過(guò)氧化氫酶的酶活性不斷降低，菌株GDW1994的活性必然會(huì)受到影響。菌株GDW1994具有內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，由圖9可知，隨著heme與VK2的獲得及O2的參與，菌株GDW1994在4 ℃冰箱中保存可長(zhǎng)達(dá)30 d，活菌數(shù)為108CFU/mL。存活率是沒(méi)有加heme和VK2和O2參與的100倍，是外源過(guò)氧化氫酶的20倍。由于胞內(nèi)環(huán)境相對(duì)溫和發(fā)揮作用更加長(zhǎng)久且直接，相對(duì)于外源過(guò)氧化氫酶，能使菌株更為強(qiáng)壯且存活時(shí)間更加持久。在工業(yè)生產(chǎn)中，需要高密度發(fā)酵菌株，菌株的生物量和生物活性為指標(biāo)，選擇內(nèi)源過(guò)氧化氫酶更有價(jià)值。

圖8 外源及內(nèi)源過(guò)氧化氫酶對(duì)菌株生物量的影響Fig.8 Effect of exogenous and endogenous catalase on the biomass of strain

圖9 外源及內(nèi)源過(guò)氧化氫酶對(duì)菌株保存時(shí)間的作用Fig.9 Effect of exogenous and endogenous catalase on the preservation time of strain

2.6 培養(yǎng)基配方及條件優(yōu)化

2.6.1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化

設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表，對(duì)培養(yǎng)基中碳、氮源和無(wú)機(jī)鹽成分進(jìn)行優(yōu)化，以活菌數(shù)為判斷指標(biāo)，結(jié)果如表6和表7所示。碳氮源4號(hào)配方和無(wú)機(jī)鹽3號(hào)配方為最佳配方。優(yōu)化后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為蛋白胨10 g/L、酵母膏2.5 g/L、葡萄糖20 g/L、牛肉膏15 g/L、CH3COONa 2 g/L、MgSO40.6 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L。優(yōu)化前最高活菌數(shù)為3.13×108CFU/mL，優(yōu)化后最高活菌數(shù)為1.37×109CFU/mL，活菌數(shù)提高約 4.4倍。

表6 唾液乳桿菌GDW1994培養(yǎng)基碳氮源L9(43)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal test results of GDW1994 culture medium carbon nitrogen source L9(43)

表7 唾液乳桿菌GDW1994培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽L9(43)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Orthogonal results of GDW1994 culture medium inorganic salt L9(43)

2.6.2 培養(yǎng)基條件優(yōu)化

由圖10可知，隨著發(fā)酵溫度的上升，活菌數(shù)呈先增加后下降的趨勢(shì)，菌株GDW1994最適溫度為37 ℃，最高活菌數(shù)為1.142×109CFU/mL。起始最適pH值為6.4，最高活菌數(shù)為1.175×109CFU/mL。隨接種量的增高菌株活菌數(shù)增高，接種量為5%時(shí)，活菌數(shù)增加幅度最大，最高活菌數(shù)為2.0×109CFU/mL，考慮到過(guò)高的接種量對(duì)發(fā)酵體系物質(zhì)消耗的因素以及菌體自溶帶來(lái)的影響，選擇接種量為4%為最適接種量。通過(guò)搖瓶培養(yǎng)，增加通氧量，隨著轉(zhuǎn)速的增加，氧對(duì)細(xì)胞的毒性增加，轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，細(xì)胞活菌數(shù)最高。隨著過(guò)氧化氫酶濃度的增高，菌株GDW1994活菌數(shù)依次增加，當(dāng)過(guò)氧化氫酶質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，活菌數(shù)最高，可達(dá)2.07×109CFU/mL,選擇過(guò)氧化氫酶質(zhì)量濃度30 g/L。通過(guò)單因素試驗(yàn)得到最適培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量4%、起始pH 6.4、最佳轉(zhuǎn)速160 r/min及最適過(guò)氧化氫酶質(zhì)量濃度30 g/L。培養(yǎng)條件優(yōu)化后活菌數(shù)提高約1.5倍。

a-發(fā)酵溫度；b-發(fā)酵起始pH值；c-接種量；d-發(fā)酵轉(zhuǎn)速；e-過(guò)氧化氫酶圖10 培養(yǎng)基條件對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.10 Effect of medium conditions on the number of viable bacteria注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

自然條件下，乳酸菌大多生長(zhǎng)在無(wú)氧或微氧環(huán)境中，但現(xiàn)代化發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中，乳酸菌常常需要進(jìn)行有氧增殖。影響乳酸菌生長(zhǎng)的主要兩大決定因素分別是低酸度環(huán)境和活性氧族的毒性。本研究分離的菌株對(duì)酸和抗氧脅迫有較好的耐受性。菌株GDW1994在無(wú)氧培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸不利于菌株活力的長(zhǎng)期保持；在有氧培養(yǎng)過(guò)程中，菌株積累大量H2O2雖然降低了菌株活菌數(shù)，但提高了菌株存活時(shí)間。改變其傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)方式，通入氧氣和外加酶解的辦法清除、分解已生成的活性氧族，探究呼吸鏈的完整性，提高抗氧脅迫能力，從而降低對(duì)細(xì)胞的傷害。通過(guò)對(duì)菌株GDW1994內(nèi)源有氧呼吸的研究，菌株GDW1994不具備完整的對(duì)醌類(lèi)物質(zhì)合成能力，其呼吸鏈的激活需要同時(shí)外加heme和VK2，最高活菌數(shù)可達(dá)3×109CFU/mL。對(duì)普通的MRS培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使唾液乳桿菌菌株GDW1994活菌數(shù)提高4.4倍。優(yōu)化出唾液乳桿菌GDW1994最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵時(shí)間15 h、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵起始pH值6.4、接種量4%、轉(zhuǎn)速160 r/min、過(guò)氧化氫酶質(zhì)量濃度30 g/L，在此條件下發(fā)酵液中唾液乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)2.07×109CFU/mL，在培養(yǎng)基優(yōu)化后的基礎(chǔ)上唾液乳桿菌菌株活菌數(shù)再提高約1.5倍。通過(guò)改變發(fā)酵方式，菌株GDW1994細(xì)胞生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，菌體存活性延長(zhǎng)。對(duì)酸脅迫和氧脅迫等不良環(huán)境的抗性能力大幅度提升?；罹鷶?shù)明顯提高，最終收獲的菌體總量顯著增多。從生產(chǎn)角度考慮，為使發(fā)酵劑菌株更為強(qiáng)壯，獲得存活性長(zhǎng)、菌體數(shù)目高的發(fā)酵工藝為最終目的。特殊風(fēng)味產(chǎn)量更大往往是人們所追求的目標(biāo)，乳酸菌的有氧呼吸有著十分廣闊的應(yīng)用前景。