沈軒昂，郝良文，張燚，江湖，黃小林*，熊勇華

1(南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌，330031)2(南昌大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047) 3(南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌，330047)

β-腎上腺素受體激動(dòng)劑--鹽酸克倫特羅(clenbuterol, Clen)因具有促進(jìn)動(dòng)物生長并提高瘦肉/脂肪比例的效果，曾在畜牧養(yǎng)殖業(yè)廣泛濫用[1-3]。長期或大劑量攝入Clen殘留的肉類產(chǎn)品會引起多種嚴(yán)重生理副作用，如肌肉疼痛、頭暈、心動(dòng)過速、神經(jīng)質(zhì)等，甚至死亡[4-6]。目前大部分國家和地區(qū)已禁止使用Clen作為動(dòng)物促生長劑，但非法添加Clen來滿足經(jīng)濟(jì)利益的食品安全事件仍層出不窮。

檢測Clen常用的方法有高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)[7-8]、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS)[9-10]、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)[11-12]以及免疫層析方法(immunochromatographic assay, ICA)[13-16]等。其中，ICA方法因具有操作簡單、檢測速度快、易于使用、和低成本等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物尿樣中Clen殘留檢測。但是尿樣中復(fù)雜基質(zhì)，往往會干擾Clen檢測的靈敏度及準(zhǔn)確度。免疫磁分離技術(shù)(immunomagnetic separation, IMS)是借助抗原抗體的特異性反應(yīng)和磁性納米粒子的快速磁響應(yīng)特性，可用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中目標(biāo)抗原的高效分離和富集，該方法可有效消除尿液的基質(zhì)干擾，提高ICA方法的準(zhǔn)確性[17-19]。然而傳統(tǒng)的磁性納米粒子因摩爾消光系數(shù)偏低，導(dǎo)致信號輸出能力較差，限制了ICA方法的檢測靈敏度。

金磁雙功能納米材料由于兼具磁性納米粒子的磁分離、富集效應(yīng)和膠體金的信號輸出能力而受到廣泛的關(guān)注[20-23]。但傳統(tǒng)金磁雙功能納米材料主要是通過在磁性納米粒子表面還原一層金殼或者在氧化鐵表面偶聯(lián)金納米粒子制備獲得，此類材料一般呈現(xiàn)“金包磁”核殼納米結(jié)構(gòu)?！敖鸢拧奔{米材料因金殼層固有的磁屏蔽效應(yīng)，會極大地降低磁性材料的飽和磁化強(qiáng)度，進(jìn)而導(dǎo)致“金包磁”納米材料磁響應(yīng)性顯著減弱[24-26]。為了克服以上問題，本研究通過乳液自組裝法將油酸修飾的氧化鐵納米粒子(oleic acid-coated iron oxide nanoparticles, OC-IONPs)和油胺修飾的金納米粒子(oleylamine-coated gold nanoparticles, OA-AuNPs)共封裝在聚馬來酸酐-alt-1-十八碳烯[poly(maleic anhydride-alt-1-octadecene)，PMAO]中，形成具有“磁包金”核殼異質(zhì)結(jié)構(gòu)的新型MGNPs，并以此為新型標(biāo)記探針，構(gòu)建了準(zhǔn)確檢測豬尿中Clen的免疫層析試紙條新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PMAO、HAuCl4·3H2O、油胺、油酸、FeCl3·6H2O, FeCl2·4H2O、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochoride,EDC]、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA),Sigma公司；Clen標(biāo)準(zhǔn)品、Clen單克隆抗體、羊抗鼠二抗、豬尿樣品,中德無錫伯爾生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜(nitrocellulose，NC膜)、樣品墊、吸水紙及聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)底板,美國Millipore公司；OA-AuNPs[27]和OC-IONPs[28]根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的方法合成；其他試劑均為分析純。

XYZ3000型點(diǎn)膜儀、自動(dòng)切條儀,金標(biāo)生物科技公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、紫外可見光分光光度計(jì),上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JEOL JEM 2100型高分辨率透射電鏡,日本電子株式會社；ZEN3700納米粒度及電位分析儀,英國馬爾文公司；振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì),美國Micro Sense公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MGNPs的合成[29]

將5 mg PMAO、7 mg OA-AuNPs和3 mg OC-IONPs溶解于100 μL氯仿中，隨后加入250 μL 5 mg/mL SDS溶液，接著混合溶液于超聲波破碎儀超聲乳化2 min (功率76.8 W，工作5 s，暫停10 s)。制備好的微乳液于60 ℃下?lián)]發(fā)4 h，然后于13 500 r/min下離心15 min，棄上清液，沉淀復(fù)溶于1 mL超純水中備用。

1.2.2 檢測探針(MGNPs-mAb)的制備

采用EDC一步法合成檢測探針。將0.1 mg MGNPs和10 μg Clen單抗加入到200 μL 磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)中，混合溶液置于混勻儀反應(yīng)30 min。隨后每隔30 min加入10 μg EDC，重復(fù)3次。接著加入10 mg BSA和10 μg EDC繼續(xù)反應(yīng)30 min。最后，反應(yīng)混合液于13 500 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀溶解至50 μL復(fù)溶液，4 ℃保存待用。

1.2.3 MGNPs免疫層析試紙條的制備

將1 mg/mL Clen單抗和1 mg/mL羊抗鼠二抗分別噴涂于NC膜上作為試紙條的檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，處理后的NC膜于37 ℃干燥12 h。然后將NC膜、樣本墊及吸水紙依次貼在PVC底板上，相互之間接觸為2 mm，隨后切割成3.9 mm寬的小條，置于卡殼中，干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 MGNPs免疫層析試紙條定量檢測Clen的流程和原理

如圖1所示，將MGNPs-mAb檢測探針添加至待檢豬尿樣品中，孵育5 min后，外加磁場下分離10 min，棄上清，隨后加入70 μL PBS緩沖液將磁回收的MGNPs-mAb重新復(fù)溶，滴加至試紙條加樣孔中。當(dāng)豬尿樣品中無Clen時(shí)，MGNPs-mAb檢測探針與試紙條NC膜T線上BSA-Clen全抗原結(jié)合，產(chǎn)生紅色條帶；當(dāng)豬尿樣品中存在Clen時(shí)，MGNPs-mAb首先與Clen結(jié)合，從而使其不能與T線上BSA-Clen全抗原結(jié)合，不能產(chǎn)生紅色條帶。因此T線顯色強(qiáng)度與待檢豬尿樣品中Clen濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。而C線上噴涂羊抗鼠二抗，因此無論樣品中有無Clen，MGNPs-mAb均能被C線捕獲，產(chǎn)生紅色條帶。

圖1 MGNPs免疫層析試紙條定量檢測Clen的流程和原理Fig.1 The principle of quantitative detection of Clen by MGNPs-ICA

1.2.5 試紙條免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析

使用MGNPs試紙條檢測4種不同Clen質(zhì)量濃度(0、0.25、0.5、1 ng/mL)的加標(biāo)豬尿樣品，采用膠體金讀卡儀記錄其ODT/ODC值隨免疫反應(yīng)時(shí)間的變化規(guī)律。具體操作如下：將350 μL豬尿樣品與2 μL檢測探針室溫孵育5 min，然后置于磁力架上磁回收10 min，棄上清，沉淀復(fù)溶于70 μL PBS緩沖液中，隨后復(fù)溶液加至試紙條加樣孔，膠體金讀卡儀每隔30 s記錄試紙條ODT/ODC值(T、C線吸光度比值)，連續(xù)監(jiān)測 30 min。每個(gè)濃度重復(fù)3次，以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，ODT/ODC值為縱坐標(biāo)繪制免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，確定試紙條的最佳讀取時(shí)間。

1.2.6 MGNPs免疫層析試紙條定量檢測豬尿中的Clen

將質(zhì)量Clen標(biāo)準(zhǔn)品添加至陰性豬尿樣品中，配制Clen終濃度為0～160 ng/mL的系列加標(biāo)樣品，按1.2.3步驟進(jìn)行磁富集和試紙條檢測，反應(yīng)5 min后記錄ODT/ODC值，每個(gè)濃度重復(fù)3次。定義0加標(biāo)ODT/ODC值為B0，其他添加ODT/ODC值為B，以Clen濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，B/B0值為縱坐標(biāo)，繪制Clen試紙條競爭抑制曲線，計(jì)算試紙條的半數(shù)抑制濃度(half-maxinal inhibitory concentration，IC50)、最低檢測限(limit of detection，LOD)以及線性檢測范圍。

1.2.7 MGNPs免疫層析試紙條的性能評價(jià)

取與Clen結(jié)構(gòu)相似的其他7種常見β-腎上腺素受體激動(dòng)劑，即氯丁喘安(Tul)、噴布洛爾(Pen)、氯丙那林(Clo)、溴布特羅(Bro)、萊克多巴胺(Rac)、沙丁胺醇(Sal)和班布特羅(Bal)，配成終濃度為100 ng/mL樣本溶液，按1.2.4步驟采用Clen試紙條對上述溶液進(jìn)行檢測，重復(fù)測定3次，膠體金讀卡儀測定試紙條ODT/ODC值。1 ng/mL Clen加標(biāo)的樣本溶液和Clen空白樣本溶液分別作為陽性和陰性對照。

取Clen陰性豬尿樣品，分別添加Clen至終質(zhì)量濃度為0.313、0.625、1.25和2.5 ng/mL，采用與標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建同一批次試紙條進(jìn)行檢測，批內(nèi)分析為同一天內(nèi)重復(fù)測定4次，批間分析為連續(xù)測定3 d，批內(nèi)批間分析每個(gè)濃度重復(fù)測定4次，計(jì)算Clen試紙條的批內(nèi)批間加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)，評價(jià)試紙條的精密性和準(zhǔn)確性。

取Clen陰性的混合豬尿樣品，隨機(jī)添加至Clen終濃度為0～80 ng/mL，制備25份Clen加標(biāo)的陽性樣本，同時(shí)采用MGNPs試紙條和商業(yè)化ELISA試劑盒對上述樣本進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度重復(fù)測定3次，然后對2種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比對分析，評價(jià)該方法的實(shí)用性和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MGNPs的表征

MGNPs采用乳液自組裝法合成。透射電鏡(transmission election microslopy,TEM)分析顯示MGNPs呈現(xiàn)明顯的“磁包金”核殼式結(jié)構(gòu)，粒徑約為165 nm(圖2)。由于OA-AuNPs在TEM成像中較 OC-IONPs具有更高的對比度，因此核心部位的暗點(diǎn)為OA-AuNPs，殼層部位的亮點(diǎn)為OC-IONPs。圖3-a顯示了MGNPs的磁滯回線，結(jié)果顯示MGNPs具有優(yōu)異的超順磁性，其飽和磁化強(qiáng)度為25.8 emu/g，約為初始OC-IONPs(41.5 emu/g)的62.2%，表明本研究所合成的MGNPs具有優(yōu)異的磁學(xué)性能。其可能的原因是所形成的“磁包金”核殼結(jié)構(gòu)有效規(guī)避了由OA-AuNPs帶來的磁屏蔽效應(yīng)。為了探究MGNPs對試紙條T 線OD值的影響，在相同摩爾濃度(30 pmol/L)下，將MGNPs和30 nm膠體金分別噴涂至NC膜T線，結(jié)果顯示MGNPs的OD值達(dá)到200.8，較30 nm膠體金約高8倍(圖3-b)。上述結(jié)果表明，使用MGNPs替代傳統(tǒng)膠體金作為新型標(biāo)記物有助于提高免疫層析試紙條的檢測靈敏度。

圖2 MGNPs透射電鏡Fig.2 TEM image of MGNPs

a-OC-IONPs 和 MGNPs 的磁滯回線；b-30 nm 膠體金和MGNPs在試紙條T線上的吸光值圖3 OC-IONPs和MGNPs磁學(xué)和光學(xué)性能的比較Fig.3 A comparison of magnetic and optical performances of the OC-IONPs and MGNPs

2.2 MGNPs-mAb檢測探針的制備及優(yōu)化

由于Clen抗體為蛋白質(zhì)，其生物活性受溶液pH影響較大。因此本研究首先探究了偶聯(lián)pH對Clen抗體偶聯(lián)效率以及對MGNPs-mAb的生物活性影響。圖4結(jié)果表明，當(dāng)溶液pH為7.5 時(shí)，試紙條T線的OD值最大，暗示MGNPs-mAb與相應(yīng)抗原的結(jié)合活性最高。因此，pH 7.5被選擇作為MGNPs與mAb偶聯(lián)的最適反應(yīng)pH。

圖4 溶液pH對檢測探針偶聯(lián)效率的影響(n=3)Fig.4 Effect of solution pH on labeling efficiency of Clen antibodies on the surface of MGNPs (n=3)

2.3 免疫層析試紙的最佳工藝參數(shù)優(yōu)化

以T線上噴涂的Clen-BSA濃度、MGNPs的抗體標(biāo)記量以及MGNPs-mAb 檢測探針用量為因素，設(shè)計(jì)3因素3水平L9(33)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化試紙條最佳工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。由表1可知，最佳工藝參數(shù)如下：T線上Clen-BSA噴涂質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL、Clen抗體標(biāo)記量為100 μg/mg，每張?jiān)嚰垪lMGNPs-mAb探針使用量為0.5 μL。在上述條件下，試紙條T和C線均呈現(xiàn)清晰的紅色條帶，相應(yīng)的OD值分別為698.5±18.7和236.9±27.9。同時(shí)試紙條1.0 ng/mL Clen陽性添加的競爭抑制率最大，達(dá)56.7%。

2.4 MGNPs免疫層析試紙條免疫動(dòng)力學(xué)分析

MGNPs免疫層析試紙條T、C線顯色過程是MGNPs-mAb檢測探針與T線BSA-Clen抗原和C線二抗的免疫動(dòng)力學(xué)反應(yīng)過程。本研究通過記錄不同Clen添加下ODT/ODC值與免疫反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，構(gòu)建免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，試紙條反應(yīng)5 min后，不同Clen加標(biāo)濃度下ODT/ODC值均達(dá)到平衡，表明5 min的免疫反應(yīng)時(shí)間足以實(shí)現(xiàn)可靠的Clen定量檢測。

表1 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化MGNPs試紙條制備參數(shù)Table 1 Optimize the preparation parameters of MGNPs-ICA

圖5 MGNPs試紙條檢測Clen的免疫動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 Immunoreaction dynamic analysis curves of MGNPs-ICA

2.5 MGNPs免疫層析試紙條定量檢測Clen的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最佳條件下，采用本研究建立的MGNPs免疫層析試紙條檢測系列Clen加標(biāo)濃度的豬尿樣本，以Clen濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，B/B0值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建免疫層析試紙條的競爭抑制曲線，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)豬尿中Clen濃度從0 ng/mL增加到160 ng/mL時(shí)，B/B0值逐漸降低，其中Clen濃度在0.078～40 ng/mL時(shí)，試紙條B/B0值與Clen濃度顯示良好的線性關(guān)系，其回歸方程表示：y=-0.12lnx+0.522 4(R2=0.984 5)，其中y為B/B0，x是Clen的濃度。依據(jù)回歸方程計(jì)算得該試紙條的IC50和LOD分別為1.225和0.041 ng/mL。其中，LOD定義為試紙條競爭抑制率為10%時(shí)的Clen濃度。以上結(jié)果表明，該方法可用于豬尿中Clen的高靈敏檢測。

圖6 MGNPs試紙條定量檢測豬尿中Clen的標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=3)Fig.6 Calibration curve of quantitative detection of Clen in swine urine with MGNPs-ICA (n=3)

2.6 MGNPs免疫層析試紙條的性能評價(jià)

MGNPs免疫層析試紙條的特異性評價(jià)是通過使用本研究所建立的試紙條同時(shí)檢測Clen(1 ng/mL)和其他7種常見β-腎上腺素受體激動(dòng)劑(100 ng/mL)完成。此外陰性添加的0.01 mol/L PB緩沖液被用作為空白為對照，結(jié)果如圖7所示。與空白對照相比，檢測Clen時(shí)ODT/ODC值顯著降低，而在檢測其他7種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑時(shí)，ODT/ODC值變化可忽略不計(jì)，表明MGNPs試紙條對Clen具有良好的選擇性，與其他常見β-腎上腺素受體激動(dòng)劑無明顯交叉反應(yīng)。

取Clen陰性的豬尿樣品添加不同量的Clen標(biāo)準(zhǔn)品至Clen終濃度為0.313、0.625、1.25 和 2.5 ng/mL，隨后采用MGNPs試紙條進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度重復(fù)測定5次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價(jià)該方法的準(zhǔn)確性和精密度。結(jié)果如表2所示，MGNPs試紙條檢測Clen陽性添加的批內(nèi)和批間回收率為93.66%～114.80%，變異系數(shù)為4.28%～13.45%，表明MGNPs試紙條檢測豬尿中Clen具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

隨機(jī)制備25份含不同Clen濃度的陽性添加豬尿樣品，然后采用本研究所構(gòu)建的MGNPs免疫層析試紙條和商業(yè)化Clen ELISA試劑盒同時(shí)對上述樣品進(jìn)行檢測，依據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算Clen濃度，繪制相關(guān)性曲線,結(jié)果如圖8所示。2種方法檢測豬尿樣品中Clen具有較好的一致性，其相關(guān)系數(shù)為0.968 5，表明MGNPs試紙條對實(shí)際樣本中Clen的檢測具有較好的實(shí)用性和可靠性。此外將該方法與現(xiàn)行農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法(SB/T 10780—2012和DB22/T 1619—2011)比較，本研究方法的靈敏度高，特異性好，且操作簡單、快捷。

表2 MGNPs試紙條準(zhǔn)確性與精密度Table 2 Accuracy and precision of MGNPs-ICA

圖8 MGNPs試紙條和ELISA試劑盒檢測結(jié)果之間的相關(guān)性分析Fig.8 A correlation analysis of the detection results of MGNPs-ICA and ELISA kit

3 結(jié)論

本研究通過乳液自組裝方法成功制備了具有“磁包金”核殼異質(zhì)結(jié)構(gòu)的磁/金雙功能納米材料。相較于傳統(tǒng)的“金包磁”納米結(jié)構(gòu)，本研究所構(gòu)建的“磁包金”核殼異質(zhì)結(jié)構(gòu)有效規(guī)避了金殼層對磁核的磁屏蔽效應(yīng)，顯著提高了MGNPs的磁飽和強(qiáng)度以及光學(xué)信號強(qiáng)度。以其作為免疫層析試紙條新型標(biāo)記探針，該方法檢測豬尿中Clen的最低檢出限為0.041 ng/mL。此外相較于實(shí)驗(yàn)室常用ELISA和LC-MS，MGNPs-ICA檢測豬尿中Clen只需15 min，且不需昂貴的設(shè)備、專業(yè)的操作人員以及復(fù)雜的樣本前處理，適于Clen的現(xiàn)場檢測?？傊狙芯繛閺?fù)雜基質(zhì)樣本中待測物的高靈敏檢測提供了新的技術(shù)支撐。