楊玉賢，高云濤，鄒維，丁崗芯，崔恩浩，熊華斌，石峰

1(云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明，650500)2(云南民族大學(xué)，生物基材料綠色制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明， 650500)

花椒屬于蕓香科灌木，是一種有較高食用和藥用價(jià)值的植物資源[1]。我國的花椒資源十分豐富，主要產(chǎn)于四川、重慶、陜西、甘肅、山東等省[2-3]?；ń纷鳛椤鞍舜笳{(diào)味品”之一，不僅具有獨(dú)特的香麻味，還具有抗氧化、抗癌、降血脂、祛風(fēng)除濕、麻醉、殺蟲和抑菌等多種功效[4-8]。四川漢源主要有竹葉花椒(習(xí)稱青花椒)、紅花椒2種品種，在香氣感官等方面具有很大的差異。竹葉花椒主要在未成熟時(shí)采收，果皮顏色為綠色，氣香，味微甜而辛，比紅花椒的醇類物質(zhì)含量高2～3倍，主要是特征揮發(fā)性成分芳樟醇[9]。竹葉花椒含有豐富的生物堿、揮發(fā)油及酰胺類化合物等成分[10-11]，具有重要的科學(xué)研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

花椒中含有多種揮發(fā)性風(fēng)味成分，在揮發(fā)性成分研究中受到廣泛關(guān)注[12-14]。蒲鳳琳等[15]用水蒸氣蒸餾法提取，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析，從花椒中鑒定出37種揮發(fā)性風(fēng)味成分。頂空分析的研究日益受到關(guān)注，孟佳敏等[16]通過頂空固相微萃取，經(jīng)GC-MS分析從花椒中鑒定出42種揮發(fā)性風(fēng)味成分；張玉霖等[17]同樣采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS方法對市售花椒油揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析，共鑒定出47種揮發(fā)性風(fēng)味成分。固相微萃取操作方便、無需溶劑、靈敏度高，但其萃取頭成本較高，多次使用后可能出現(xiàn)萃取頭交叉污染等問題[18-19]。單滴微萃取因其成本低、溶劑用量少、操作簡便快速，應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)受到關(guān)注，但存在萃取液滴體積小，懸掛穩(wěn)定性差，易揮發(fā)，有機(jī)溶劑揮發(fā)損失過快的缺點(diǎn)，導(dǎo)致無法使用乙酸乙酯、正己烷等揮發(fā)性有機(jī)溶劑萃取[20-21]。

針對上述方法存在的問題，本文設(shè)計(jì)制作了一種新型微池頂空萃取裝置，在此基礎(chǔ)上建立一種以乙酸乙酯、正己烷為萃取劑的雙溶劑微池頂空溶劑萃取方法，以實(shí)現(xiàn)竹葉花椒揮發(fā)性風(fēng)味成分的溶劑頂空微萃取，并結(jié)合GC-MS對竹葉花椒揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，并與頂空固相微萃取進(jìn)行了對照。以探究乙酸乙酯和正己烷為萃取劑的雙溶劑微池頂空萃取方法的實(shí)際應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及材料

儀器：ISQ120839 THERMOFISHER(ISO)氣-質(zhì)聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技公司；CPA2014C348-32氣相色譜儀，島津企業(yè)管理有限公司；57328-U 50/30 μm (DVB/CAR/PDMS)固相微萃取SPME纖維頭，美國Supelco公司；微量進(jìn)樣器(50.0 μL、10.0 μL),上海安亭科學(xué)儀器廠；20 mL鉗口頂空瓶。

試劑：乙酸乙酯、正己烷,均為色譜純；無水氯化鈣,分析純。

竹葉花椒干品(產(chǎn)自四川漢源地區(qū))，購于成都川味水滸之香料王食品店。

1.2 微池頂空萃取裝置

本文采用的微池頂空萃取裝置如圖1所示，該裝置由鉗口頂空瓶和微萃取池組件兩部分組成，鉗口頂空瓶包括瓶體及瓶蓋兩部分，瓶蓋包括硅膠及四氟乙烯雙層墊片，微萃取池組件包括圓底脫水微池、尖底萃取微池、吸盤和掛柱，萃取微池、脫水微池、掛柱和吸盤均為聚乙烯醇材料，掛柱下端分別與萃取微池、脫水微池黏接，掛柱上端與吸盤黏接，吸盤與頂空瓶蓋下層四氟乙烯墊片吸合，墊片置于瓶蓋，并與瓶口密閉鉗合，將萃取微池、脫水微池探入頂空瓶上方。

a-微池頂空萃取裝置；b-微萃取組件；c-結(jié)構(gòu)和實(shí)物圖1 微池頂空萃取裝置圖Fig.1 Micro cell headspace extraction device

1.3 方法

1.3.1 雙溶劑微池頂空萃取操作

使用時(shí)，稱取1.0 g竹葉花椒樣品于頂空瓶中，在脫水微池中預(yù)置入無水氯化鈣等脫水劑，用微量進(jìn)樣針吸取適量萃取劑，針頭刺破頂空瓶墊將乙酸乙酯、正己烷2種萃取劑分別注入不同萃取微池中，在50 ℃條件下萃取30 min[6]，用進(jìn)樣針吸出萃取微池中的剩余萃取劑1.0 μL進(jìn)行后續(xù)的氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

1.3.2 頂空固相微萃取

采用固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)纖維頭和SPME纖維組件支架共同組裝而成的固相微萃取裝置，稱取竹葉花椒樣品1.0 g，50 ℃條件下萃取30 min，按照文獻(xiàn)[17]頂空測試微萃取方法進(jìn)行操作，進(jìn)行后續(xù)GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS分析

色譜條件：色譜柱：DB-WAX(30 m×0.25 m×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度260 ℃，檢測器溫度220 ℃；柱初溫50 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升到95 ℃持續(xù)1 min；以2 ℃/min升到110 ℃，保持1 min；以4 ℃/min升到170 ℃，保持1 min；再以15 ℃/min升到200 ℃，保持3 min保持；高純氦氣(純度>99.999%)；載氣流速0.8 mL/min；分流比8∶1；進(jìn)樣量1.0 μL，溶劑延遲時(shí)間3 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度260 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍30～500m/z。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味成分的分析

竹葉花椒樣品中各未知揮發(fā)性風(fēng)味成分的定性通過計(jì)算機(jī)檢索，利用儀器所配置的NIST 11譜庫檢索匹配，選取相似度(SI與RSI值均大于800時(shí)可予以選擇)，并結(jié)合保留時(shí)間及參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]所得。同時(shí)采用峰面積歸一化法確定竹葉花椒中不同揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量，如公式(1)所示：

(1)

式中：A1為單組分揮發(fā)性風(fēng)味成分的峰面積；A2為揮發(fā)性風(fēng)味成分總峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 微池頂空萃取裝置的設(shè)計(jì)及制備

本文提出一種以易揮發(fā)溶劑如乙酸乙酯和正己烷作為萃取劑的微池頂空萃取方法，首先制作了如圖1所示的微池頂空萃取裝置，通過尖底萃取微池中放置的揮發(fā)性溶劑對揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行萃取。同時(shí)在微池頂空萃取池下方設(shè)置一圓底脫水微池以去除混于揮發(fā)性風(fēng)味成分的水分。

微萃取池組件中的掛柱和吸盤材料均為聚乙烯醇，材料易得，以方便黏合。微池頂空萃取組件通過吸盤式結(jié)構(gòu)，以便于與光滑的聚四氟乙烯墊片吸合。微池頂空萃取池設(shè)計(jì)為尖底結(jié)構(gòu)，以方便進(jìn)樣針針頭取樣。采用如圖1所示結(jié)構(gòu)，其優(yōu)勢在于不僅不改變已有頂空瓶的基本結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)精小但方便制作，且已有的頂空瓶及進(jìn)樣系統(tǒng)，可以將近200.0 μL易揮發(fā)的萃取劑置于其中，避免了萃取劑懸掛穩(wěn)定性差和有機(jī)萃取劑揮發(fā)損失過快等問題。

為了進(jìn)一步研究，易揮發(fā)的萃取劑在微池頂空萃取裝置中揮發(fā)穩(wěn)定性的問題，通過溶劑頂空萃取在50 ℃條件下萃取30 min后，乙酸乙酯和正己烷等萃取劑初始體積與剩余體積關(guān)系如圖2所示。

圖2 微池頂空萃取裝置中乙酸乙酯和正己烷的揮發(fā)穩(wěn)定性Fig.2 The stability problem of ethyl acetate and n-hexane in micro cell headspace extraction device

由圖2可知，用乙酸乙酯和正己烷萃取劑萃取竹葉花椒中的揮發(fā)性成分時(shí)，乙酸乙酯的初始體積在35.0～60.0 μL時(shí)，近乎呈線性變化；正己烷的初始體積在50.0～70.0 μL時(shí)，正己烷萃取劑的剩余體積隨初始體積的增加而增多。在30 min頂空萃取平衡時(shí)間內(nèi)，萃取劑剩余量仍然保留有近10.0 μL，滿足后續(xù)萃取物GC-MS分析，故選用乙酸乙酯、正己烷等萃取劑的初始體積分別為40.0、60.0 μL 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.2 竹葉花椒揮發(fā)性成分雙溶劑微池頂空萃取

本文采用微池頂空萃取裝置(圖1)，結(jié)合GC-MS分析，研究了乙酸乙酯和正己烷2種萃取劑對竹葉花椒揮發(fā)性風(fēng)味成分的萃取行為，并與頂空固相微萃取進(jìn)行對照，圖3-a、3-b和3-c分別是正己烷、乙酸乙酯和頂空固相微萃取物的GC-MS總離子流圖。通過計(jì)算機(jī)檢索，并用NIST 11譜庫檢索相互匹配進(jìn)行定性分析，將相似度(SI與RSI值均大于800)的組分先進(jìn)行選擇，再結(jié)合保留時(shí)間及參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]對GC-MS檢測結(jié)果進(jìn)行鑒定，確定相應(yīng)化合物的名稱。各組分相對含量按峰面積歸一化法計(jì)算公式[公式(1)]計(jì)算。將竹葉花椒中各類揮發(fā)性風(fēng)味成分的數(shù)量和相對含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)匯總，見表1。

a-正己烷；b-乙酸乙酯；c-頂空固相微萃取圖3 雙溶劑微池頂空萃取物GC-MS總離子流圖Fig.3 The GC-MS total ion flow diagram of double solvent micro cell headspace extract

表1 正己烷和乙酸乙酯萃取物中的揮發(fā)性風(fēng)味成分Table 1 The main volatile flavor components in n-hexane and ethyl acetate extracts

續(xù)表1

由表1可以看出，從正已烷和乙酸乙酯萃取物中分別鑒定出27種、30種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中重合的有22種揮發(fā)性成分，不重合的有13種揮發(fā)性成分，共鑒定出35種，與頂空固相微萃取獲得的34種相接近，可實(shí)現(xiàn)基于正己烷和乙酸乙酯等揮發(fā)溶劑的頂空溶劑萃取，且說明雙溶劑微池頂空萃取中2種溶劑具有一定的萃取互補(bǔ)作用。

雙溶劑微池頂空萃取獲得竹葉花椒中的主要揮發(fā)性風(fēng)味成分(出現(xiàn)在兩相的成分，以含量高的為參考結(jié)果)芳樟醇的相對含量(43.38%)明顯優(yōu)于頂空固相微萃取(26.02%)。芳樟醇來源于天然產(chǎn)物，屬于鏈狀萜烯醇類，不僅有鈴蘭香氣，香氣柔和透發(fā)，還具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)靜催眠及其他多種香味成分和藥理活性，芳樟醇及其衍生物在香化和日化工業(yè)上應(yīng)用廣泛[22-25]。

本文進(jìn)一步對正己烷、乙酸乙酯萃取物中各類揮發(fā)性風(fēng)味成分的數(shù)量和相對含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin 2018作圖軟件繪制雷達(dá)區(qū)域分布圖，各類揮發(fā)性風(fēng)味成分的數(shù)量及相對含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4。

a-數(shù)量；b-相對含量圖4 各類揮發(fā)性風(fēng)味成分的數(shù)量和相對含量統(tǒng)計(jì)Fig.4 Quantity and relative content statistics for various volatile flavor components

由圖4可以看出，變化較大的烯烴類化合物(雙溶劑微池頂空萃取共鑒定出18種，相對含量為74.42%；優(yōu)于頂空固相微萃取鑒定出的15種，相對含量為42.47%)是竹葉花椒各類揮發(fā)性風(fēng)味成分中數(shù)量及相對含量最多的一類物質(zhì)，其次是醇類、酯類，而醛類、酮類、烷烴類、醚類和芳香烴則變化差異不大。從圖4-a各類揮發(fā)性風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量的整體統(tǒng)計(jì)雷達(dá)區(qū)域分布圖來看，雙溶劑微池頂空萃取可達(dá)到與頂空固相微萃取相接近的效果，對于烯烴和酯類物質(zhì)的萃取效果要比頂空固相微萃取的萃取效果更佳。而由圖4-b各類揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量整體統(tǒng)計(jì)雷達(dá)區(qū)域分布圖來看，雙溶劑微池頂空萃取得到的揮發(fā)性風(fēng)味成分相對含量所占總面積要大大優(yōu)于頂空固相微萃取的結(jié)果。

3 結(jié)論

本文針對乙酸乙酯、正己烷等揮發(fā)性萃取劑在萃取過程中不穩(wěn)定、易揮發(fā)損失的特點(diǎn)，在已有頂空瓶的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一種新型微池頂空萃取裝置，裝置不改變已有頂空瓶的基本結(jié)構(gòu)，小巧但易于制作，解決了溶劑頂空萃取穩(wěn)定性差的問題，實(shí)現(xiàn)了基于乙酸乙酯和正己烷等揮發(fā)溶劑的頂空萃取。在此基礎(chǔ)上，建立了以不同極性的易揮發(fā)性溶劑乙酸乙酯和正己烷為萃取劑的雙溶劑微池頂空萃取方法，利用GC-MS對竹葉花椒萃取物中揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了分析，操作簡單、快速，獲得揮發(fā)性風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量上與頂空固相微萃取相接近，相對含量總體上優(yōu)于頂空固相微萃取。本法靈敏度高，精密度好，相對于已有的頂空固相微萃取或單滴頂空微萃取法，分析成本大幅度降低，不僅明顯改進(jìn)了頂空過程中萃取劑的穩(wěn)定性問題，而且結(jié)果表明，雙溶劑微池頂空萃取中2種溶劑起到良好的互補(bǔ)萃取作用，簡單、快速、在獲得各類揮發(fā)性風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量以及相對含量上的整體萃取效果要優(yōu)于頂空固相微萃取法，為揮發(fā)性風(fēng)味成分的頂空分析提供了一種新的思路。