欒 娜 鐘祥鍵 王 欣 冀麟麟 李金杰 尚小雅

（北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能北京市重點實驗室 北京100191）

山茱萸（Cornus officinalis）是山茱萸科山茱萸屬植物，主產(chǎn)于我國安徽、河南和山西等地，其干燥成熟果肉被作為一種藥食同源藥材使用，具有補益肝腎、澀精固脫等功效，主要用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸軟等癥[1，2]。研究表明，山茱萸中的化學(xué)成分類型主要有環(huán)烯醚萜及其苷類、三萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類等[4-6]。多篇文獻(xiàn)報道山茱萸具有降糖、抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等功效[7-9]。

日本學(xué)者Arihi 早在1985年就報道山茱萸乙醇提取物具有抗氧化活性[10]。另有多篇文獻(xiàn)報道了山茱萸醇提物、山茱萸總苷及山茱萸多糖等都具有抗氧化活性[11-13]，并將其作為可食用天然抗氧化劑的一個潛在來源進(jìn)行研究。截至目前，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)山茱萸果中的高含量成分熊果酸、沒食子酸和鞣花酸有抗氧化活性[14-15]。然而，山茱萸中的抗氧化活性成分究竟是什么尚無定論。為研究山茱萸中的抗氧化活性成分，采用大孔吸附樹脂柱色譜將山茱萸乙醇提取物分離為不同洗脫部位，其中20%乙醇洗脫部位具有抗氧化活性。本文對20%乙醇洗脫部位中富含環(huán)烯醚萜的活性組分進(jìn)行系統(tǒng)分離純化，從中分離并鑒定4 個環(huán)烯醚萜類化合物，它們均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，其中2 個化合物為新的天然產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茱萸干燥果實，購于河南省西峽縣，由宣武醫(yī)院王文教授鑒定其為山茱萸（Cornus officinalis）的果實，標(biāo)本保存在北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室標(biāo)本室。

薄層色譜硅膠（GF254）和柱色譜硅膠（160～200 目），青島海洋化工廠；Sephadex LH-20 凝膠，Pharmacia 公司。FRAP 抗氧化活性測試試劑盒，南京建成生物科技有限公司。氯仿、甲醇、乙醇及硫酸等試劑，均為分析純級，北京化學(xué)試劑廠；色譜級甲醇，美國Thermo Fisher 公司；實驗用超純水，由Millipore 純水儀生產(chǎn)。

Waters2545 高效液相色譜儀，配備Waters2998 紫外燈，色譜柱為Sunfire C18 制備柱（19 mm×250 mm×5μm），美國Waters 公司；Inova 500 核磁共振儀，美國Varian 公司；Combiflash Companion 快速分離儀，美國ISCO 公司；紫外燈（CREST C-650），美國CREST 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 山茱萸的提取及粗分 山茱萸干燥果實共25 kg，以10 倍量的50%乙醇溶液超聲提取，每次1 h，共3 次。合并3 次提取液，減壓濃縮得到提取物浸膏（4.3 kg）。提取物浸膏經(jīng)HP-20 大孔吸附樹脂柱色譜分離，最終得到4 個部位，即：水、20%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脫部位。

1.2.2 環(huán)烯醚萜的分離純化 將大孔吸附樹脂20%乙醇洗脫部位（1.25 kg）用甲醇超聲溶解，用正相硅膠拌樣，之后上正相硅膠色譜柱，以氯仿-甲醇混合溶液為流動相梯度洗脫，洗脫梯度為V（氯仿）∶V（甲醇）=91∶9，89∶11 和0∶100，根據(jù)薄層色譜，合并相同洗脫流分，得到3 個組分 （A1～A3）。選擇A1 組分，用純水溶解，上低壓反相硅膠柱色譜，采用V（乙醇）∶V（水）=5 ∶95～100 ∶0 梯度洗脫，收集洗脫液后，根據(jù)薄層色譜進(jìn)行合并，得到組分A1-1～A1-14。組分A1-4 采用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，流動相為V（氯仿）∶V（甲醇）=67∶33，收集洗脫液濃縮后采用薄層色譜檢測，將具有相同紫色斑點的部分合并，合并后有白色固體析出，過濾，用甲醇反復(fù)淋洗，最終得到化合物1（178 mg）。組分A1-6 用正相硅膠拌樣后，以V（氯仿）∶V（甲醇）=95∶5～0∶100 為流動相進(jìn)行正相硅膠柱色譜分離，合并洗脫液后得到5 個亞組分A1-6-1～A1-6-5。組分A1-6-2 首先經(jīng)過Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，V（氯仿）∶V（甲醇）=67∶33 為流動相，收集相同流分后采用HPLC柱色譜純化，流動相為V（甲醇）∶V（水）=45∶55，得到化合物2（56 mg）。組分A1-1 采用正相硅膠拌樣后，通過正相硅膠柱色譜，以V（氯仿）∶V（甲醇）=97∶3～50∶50 分離，得到6 個亞組分A1-1-1～A1-1-6，亞組分A1-1-4 經(jīng)過Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以V（石油醚）∶V（氯仿）∶V（甲醇）=45 ∶45：10 分離，收集相同流分后采用制備HPLC 柱色譜進(jìn)行純化，流動相為V（甲醇）∶V（水）=60∶40，得到化合物3 （11 mg）。亞組分A1-1-5 采用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，以V（石油醚）∶V（氯仿）∶V（甲醇）=45∶45∶10 分離，之后采用制備HPLC 柱色譜純化，流動相為V（甲醇）∶V（水）=58∶42，得到化合物4（27mg）。

1.2.3 FRAP 抗氧化活性測定 FRAP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)試劑盒方法，準(zhǔn)確稱取FeSO4·7H2O粉末27.8 mg，溶解并定容1 mL。取適量100 mmol/L FeSO4溶液分別稀釋至0.15，0.3，0.6，0.9，1.2 mmol/L 和1.5 mmol/L，測定各濃度的OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總抗氧化能力測定：在96 孔板中加入180 μL FARP 工作液，隨后加入濃度為0.1 mmol/L 的單體化合物溶液，輕輕混勻，于37 ℃孵育3～5 min，在波長593 nm 處測定OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的總抗氧化能力[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

2.1.1 馬錢子苷（loganin） 馬錢子苷，白色無定型粉末，ESI 質(zhì)譜顯示m/z 435.14984[M+HCOOHH]-。1H NMR 譜顯示：δH7.40 （1H，s）處有一個連氧烯氫信號，δH5.28 （1H，d，J=4.5 Hz）處有一個半縮醛氫信號，δH3.71 （3H，s）處有一個甲氧基氫信號，δH1.11 （3H，d，J=7.0 Hz）處為甲基信號。此外，在δH3.12～4.66 處為一組葡萄糖氫信號，其端基氫信號在δH4.66 （1H，d，J=7.9 Hz）處，耦合常數(shù)J=7.9 Hz，表明葡萄糖構(gòu)型為β 構(gòu)型。根據(jù)以上氫譜數(shù)據(jù)推測其可能為環(huán)烯醚萜苷類成分。對13C NMR 譜分析表明其有17 個碳信號，其中在δC169.5 為羰基碳信號，δC152.1 和 114.0為一組雙鍵碳信號，δC97.7 為半縮醛碳信號，δC75.1 為連氧次甲基碳信號，δC51.6 處為甲氧基碳信號。此外，葡萄糖碳信號分別為δC62.7，71.6，75.0，78.0，78.4，100.1，其中δC100.1 為葡萄糖端基碳信號。將以上NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]數(shù)據(jù)對比，鑒定該化合物為馬錢子苷。

圖1 馬錢子苷的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of loganin

圖2 馬錢子苷的質(zhì)譜圖Fig.2 ESI-MS of loganin

圖3 馬錢子苷的1H-NMR 圖Fig.3 1H-NMR of loganin

圖4 馬錢子苷的13C-NMR 圖Fig.4 13C-NMR of loganin

2.1.2 馬錢素-7-酮 （ketologanin） 馬錢素-7-酮，白色無定型粉末，ESI 質(zhì)譜顯示m/z 433.13431[M+HCOOH-H]-。1H NMR 譜顯示：δH7.46（1H，s）為烯氫信號，δH5.61 （1H，d，J=3.1 Hz）為半縮醛氫信號，甲氧基信號在δH3.67 （3H，s）處，一個甲基雙峰信號在δH1.12 （3H，d，J=7.2 Hz），δH3.14～4.32 處有6 個葡萄糖氫信號，其端基氫信號在δH4.66（1H，d，J=7.9 Hz）。葡萄糖構(gòu)型通過耦合常數(shù)確定為β 型構(gòu)型。13C NMR 譜顯示有17 個碳信號，δC13.6 處為甲基碳信號，δC51.7 處為甲氧基碳信號，δC95.2 處為半縮醛碳信號，δC111.0和153.3 處為一組雙鍵碳信號，δC220.7 和168.8分別為酮羰基信號和酯羰基信號，δC62.7～100.1處為6 個葡萄糖碳信號，端基碳信號為δC100.1。綜上所述，推測該化合物為環(huán)戊烷環(huán)烯醚萜苷類化合物，再與文獻(xiàn)[18]數(shù)據(jù)對比，鑒定化合物為馬錢素-7-酮（ketologanin）。

圖5 馬錢素-7-酮的結(jié)構(gòu)Fig.5 Chemical structure of ketologanin

圖6 馬錢素-7-酮質(zhì)譜圖Fig.6 ESI-MS of ketologanin

圖7 馬錢素-7-酮的1H-NMR 圖Fig.7 1H-NMR of ketologanin

圖8 馬錢素-7-酮的13C-NMR 圖Fig.8 13C-NMR of ketologanin

2.1.3 1-β-甲氧基馬錢子苷元 （1-β-O-methyl loganin aglucone） 1-β-甲氧基馬錢子苷元，無色油狀物，ESI 質(zhì)譜顯示m/z 243.12209[M+H]+。1HNMR 譜顯示δH7.35 （1H，s）處為一個烯氫信號，4.93 （1H，d，J=3.3 Hz）處為半縮醛氫信號，3.40（3H，s）和3.65 （3H，s）為兩個甲氧基信號，1.05（3H，d，J=7.2 Hz） 處有甲基信號，1H-NMR 譜數(shù)據(jù)表明其可能為環(huán)烯醚萜類成分。13C-NMR 譜顯示有12 個碳信號，δC51.6 和57.1 處為兩個甲氧基碳信號，δC169.5 處為一個酯羰基信號，其余9個碳信號為環(huán)烯醚萜結(jié)構(gòu)信號，因此推測其為環(huán)烯醚萜類成分。將以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]數(shù)據(jù)對比，鑒定該化合物為1-β-甲氧基馬錢子苷元（1-β-Omethyl loganin aglucone）。

圖9 1-β-甲氧基馬錢子苷元的結(jié)構(gòu)Fig.9 Chemical structure of 1-β-O-methyl loganin aglucon

圖10 1-β-甲氧基馬錢子苷元的質(zhì)譜圖Fig.10 ESI-MS of 1-β-O-methyl loganin aglucon

圖11 1-β-甲氧基馬錢子苷元的1H-NMR 圖Fig.11 1H-NMR of1-β-O-methyl loganin aglucon

圖12 1-β-甲氧基馬錢子苷元的13C-NMR 圖Fig.12 13C-NMR of 1-β-O-methyl loganin aglucon

2.1.4 1-去羥基馬錢子苷元（1-deoxyloganin aglycone） 1-去羥基馬錢子苷元，無色油狀物，ESI 質(zhì)譜顯示m/z 213.11269[M+H]+。1H-NMR 譜顯示一個烯氫信號δH7.55 （1H，s），一個甲基氫信號δH1.05 （3H，d，J=7.1 Hz）和一個甲氧基氫信號δH3.66 （3H，s）。13C-NMR 譜顯示有11 個碳信號，其中δC112.9，156.8 和170.0 3 個信號為α，β 不飽和酮信號，兩個連氧碳信號位于δC75.2 和67.9。根據(jù)NMR 數(shù)據(jù)推測該化合物為環(huán)烯醚萜類成分，未發(fā)現(xiàn)半縮醛信號，推測該化合物為C-1 位去羥基的環(huán)烯醚萜類成分。將以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]數(shù)據(jù)對比，鑒定該化合物為1-去羥基馬錢子苷元（1-deoxyloganin aglycone）。

圖13 1-去羥基馬錢子苷元的結(jié)構(gòu)Fig.13 Chemical structure of 1-deoxyloganin aglycone

圖14 1-去羥基馬錢子苷元的質(zhì)譜圖Fig.14 ESI-MS of 1-deoxyloganin aglycone

圖15 1-去羥基馬錢子苷元的1H-NMR 圖Fig.15 1H-NMR of 1-deoxyloganin aglycone

2.2 化合物的波譜數(shù)據(jù)

2.2.1 馬錢子苷的波譜數(shù)據(jù) 馬錢子苷為白色粉末，ESI-MS m/z 435.14984[M+HCOOH-H]-。1HNMR （CD3OD，500MHz）δ：5.28 （1H，d，J=4.5 Hz，H-1），7.40 （1H，s，H-3），3.13 （1H，m，H-5），1.63 （1H，m，H-6α），2.24 （1H，m，H-6β），4.05 （1H，m，H-7），1.89 （1H，m，H-8），2.04（1H，m，H-9），1.11 （3H，d，J=7.0 Hz，H-10），3.70 （3H，s，11-OMe），4.66 （1H，d，J=7.9 Hz，H-1′），3.20 （1H，m，H-2′），3.35 （1H，o，H-3′），3.29 （1H，o，H-4′），3.38 （1H，m，H-5′），3.66 （1H，dd，J=5.7，11.9 Hz，H-6α′），3.91（1H，dd，J=2.1，11.9 Hz，H-6β′）；13C-NMR（CD3OD，125MHz）δ：13.4 （C-10），31.6 （C-5），42.1 （C-8），42.7（C-6），46.5 （C-9），51.6 （11-OCH3），62.7 （C-6′），71.6 （C-4′），74.7 （C-7），75.0 （C-2′），78.0 （C-5′），78.4 （C-3′），97.7 （C-1），100.1 （C-1′），114.0 （C-4），152.1 （C-3），169.5（C-11）。

圖16 1-去羥基馬錢子苷元的13C-NMR 圖Fig.16 13C-NMR of 1-deoxyloganin aglycone

2.2.2 馬錢素-7-酮的波譜數(shù)據(jù) 馬錢素-7-酮為白色粉末，ESI-MS m/z[M+HCOOH-H]-。1H-NMR（CD3OD，500MHz） δ：5.61 （1H，d，J=3.1 Hz，H-1），7.46 （1H，s，H-3），3.23 （1H，m，H-5），2.31 （1H，m，H-6α），2.58 （1H，dd，J=8.3，11.0 Hz，H-6β），2.06 （1H，m，H-8），2.51 （1H，m，H-9），1.12 （3H，d，J=7.2 Hz，H-10），3.67（3H，s，11-OMe），4.64 （1H，d，J=7.9 Hz，H-1′），3.16 （1H，dd，J=8.0，9.2 Hz，H-2′），3.35（1H，m，H-3′），3.21 （1H，m，H-4′），3.36 （1H，m，H-5′），3.62 （1H，dd，J=6.2，11.9 Hz，H-6α′），3.87 （1H，dd，J=2.2，11.9 Hz，H-6β?）；13C-NMR （CD3OD，125MHz）δ：13.6 （C-10），28.3（C-5），43.4（C-6），44.6 （C-8），46.5 （C-9），51.7（-OCH3），62.7 （C-6′），71.5 （C-4′），74.6 （C-2′），77.9 （C-5′），78.4 （C-3′），95.2 （C-1），100.1（C-1′），111.0 （C-4），153.3 （C-3），168.8 （C-11），220.7（C-7）。

2.2.3 1-β-甲氧基馬錢子苷元 1-β-甲氧基馬錢子苷元為無色油狀物，ESI-MS m/z 243.12209[M+H]+。1H-NMR （CD3OD，500MHz）δ：7.53 （1H，s，H-3），4.93 （1H，d，J=3.3 Hz，H-1），4.04 （1H，m，H-7），3.01 （1H，m，H-5），2.17 （1H，m，H-9），2.09 （1H，m，H-6α），1.65 （1H，m，H-6β），2.05 （1H，m，H-8），1.05 （3H，d，J=7.2 Hz，H-10），3.40 （3H，s，11-OMe），3.65 （3H，s，7-OMe）。13C-NMR （CD3OD，125MHz） δ：15.0 （C-10），33.5 （C-5），39.8 （C-6），40.2 （C-8），47.3（C-9），51.6 （11-OMe），57.1 （7-OMe），75.3 （C-7），103.3 （C-1），113.4 （C-4），152.6 （C-3），169.5（C-11）.

2.2.4 1-去羥基馬錢子苷元 1-去羥基馬錢子苷元為無色油狀物，ESI-MS m/z 213.11269 [M+H]+。1H-NMR （CD3OD，500MHz）δ：7.55 （1H，s，H-3），4.00 （1H，o，H-1α），3.67 （1H，o，H-1β），7.55 （1H，s，H-3），3.00 （1H，m，H-5），1.46（1H，m，H-6α），2.22 （1H，m，H-6β），4.01（1H，o，H-7），1.71 （1H，m，H-8），2.21 （1H，m，H-9），1.05 （3H，d，J=7.1 Hz，H-10），3.66（3H，s，-OCH3）。13C-NMR （CD3OD，125MHz）δ：13.3 （C-10），32.9 （C-5），41.5 （C-6），42.6（C-8），42.9 （C-9），51.6 （-OCH3），67.9 （C-1），75.2 （C-7），112.9 （C-4），156.8 （C-3），170.0（C-11）。

2.3 抗氧化活性

總抗氧化活性采用FRAP 總抗氧化能力檢測試劑盒測定，結(jié)果顯示：化合物1～4 均具有一定的抗氧化活性（表1），其中化合物1 和化合物2 的抗氧化活性強于化合物3 和4，推測環(huán)烯醚萜類成分連接單糖形成環(huán)烯醚萜苷后活性可能有所提升。

圖17 FeSO4 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.17 The standard curve of FeSO4

表1 環(huán)烯醚萜抗氧化活性Table 1 Antioxidant activities of iridoids from Cornus officinalis

3 結(jié)論

采用多種柱色譜相結(jié)合的方式（正相硅膠柱色譜、閃式低壓正反相柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜和反相高效液相色譜） 對山茱萸乙醇提取物中具有抗氧化活性的20%乙醇洗脫部位進(jìn)行化學(xué)成分分離和純化，共分離并鑒定了4 個環(huán)烯醚萜類化合物，分別為馬錢子苷（1）、馬錢素-7-酮（2）、1-β-甲氧基馬錢子苷元（3）和1-去羥基馬錢子苷元（4），其中化合物3 和4 為首次從山茱萸屬中分離得到的新天然產(chǎn)物。

對分離得到的4 個環(huán)烯醚萜苷類化合物，采用鐵離子還原力（FRAP）試驗測定其總抗氧化能力，結(jié)果化合物1～4 均顯示一定的抗氧化活性，其中馬錢子苷和馬錢素-7-酮的抗氧化能力最強。山茱萸中的其它環(huán)烯醚萜類成分也具有很好的抗氧化活性，說明山茱萸的抗氧化活性不是由單一成分引起，而是多成分共同作用的結(jié)果。