謝鳳英 趙玉瑩 雷宇宸 韓 雪 任宇涵 盧仙玉 吳 瑕*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030 2 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島266100）

米糠是稻谷加工中的副產(chǎn)物，其年產(chǎn)量在1 200 萬t 左右，具有很高的開發(fā)價(jià)值。膳食纖維在米糠中的含量為27%，其可以減緩胃排空，與無機(jī)鹽結(jié)合于腸道內(nèi)形成不可吸收的復(fù)合物，進(jìn)而對(duì)Ⅱ型糖尿病、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病起到很好的預(yù)防作用[1-4]。

以傳統(tǒng)面制品為載體，以米糠膳食纖維為添加物，已成為面制品營(yíng)養(yǎng)保健功能提高的有效手段。當(dāng)膳食纖維添加于面制品中時(shí)，隨著添加量的增加，面團(tuán)流變學(xué)性質(zhì)和面制品品質(zhì)都會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。學(xué)者們認(rèn)為這種變化是膳食纖維的加入阻礙了面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，同時(shí)又與面粉中的淀粉、蛋白質(zhì)等成分競(jìng)爭(zhēng)水分子，進(jìn)而導(dǎo)致面團(tuán)中水分重新分布，面筋蛋白脫水，結(jié)構(gòu)塌陷這一結(jié)果[5-7]。為了保證面團(tuán)流變學(xué)特性和面制品品質(zhì)，谷物膳食纖維添加量通?？刂圃?%～10%[8-9]。超高壓均質(zhì)技術(shù)是一種可用于液-液、固-液處理的高新技術(shù)，通過高壓作用促使物料發(fā)生物理、化學(xué)、結(jié)構(gòu)性質(zhì)等一系列變化，最終達(dá)到納米級(jí)均質(zhì)的目的。近年來該技術(shù)在顆粒微細(xì)化方面也有應(yīng)用。例如，Liu C 等[10]利用超高壓均質(zhì)對(duì)豆渣中不溶性膳食纖維進(jìn)行改性，將其添加于大米淀粉糊時(shí)其糊化和流變學(xué)特性均有所改善。此外，面筋蛋白結(jié)構(gòu)分析的方法有核磁共振（NMR）、圓二色譜法（CD）、紫外光譜、X 射線衍射（X-ray）和紅外光譜（FTIR）等，其中FTIR 因不受蛋白質(zhì)狀態(tài)、官能團(tuán)、濃度、分子質(zhì)量、環(huán)境等條件的限制，樣品用量少，操作簡(jiǎn)便，直接、快速而成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的常用檢測(cè)技術(shù)[11-12]。

本試驗(yàn)中通過超高壓均質(zhì)處理來改善米糠膳食纖維口感粗糙、食用性差這一缺點(diǎn)，采用紅外光譜法分析米糠膳食纖維粉不同添加量的面筋蛋白結(jié)構(gòu)，以此明確米糠膳食纖維在面粉中的添加比例，為米糠的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠，黑龍江省五谷信合生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；中筋面粉，河北五得利面粉集團(tuán)有限公司；α-淀粉酶（50 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg），上海源葉生物科技有限公司；石油醚、氫氧化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 設(shè)備與儀器

搖擺式高速中藥粉碎機(jī)（DFY-500 型500 g），浙江溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9146A 型），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-1 型），余姚市東方電工儀器廠；低速離心機(jī)（SC-3614），安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；面筋洗滌儀（ST007B），濟(jì)南盛泰儀器有限公司；超高壓均質(zhì)機(jī)（FB-110T），上海勵(lì)途機(jī)械設(shè)備工程有限公司；雷磁pH 計(jì)（HS-3C），上海精密科學(xué)儀器有限公司；粒度儀（Mastersizer 2000），英國馬爾文儀器有限公司；掃描電子顯微鏡（S-570 型），日本日立公司；傅里葉變換紅外光譜儀 （Spectrum GX 型），美國PerkinElmer 公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠膳食纖維的制備 原料米糠經(jīng)洗滌、干燥、粉碎、篩分、石油醚脫脂后，按照料液比1∶6加入蒸餾水。調(diào)節(jié)pH 值為6.5，加入α-淀粉酶（2.0 g/100 mL），于60 ℃水浴加熱的條件下酶解2.0 h；調(diào)節(jié)pH 值為10.0，加入堿性蛋白酶（2.0 g/100 mL），于45 ℃水浴加熱的條件下酶解2.0 h，加熱滅酶（90 ℃，10.0 min），用蒸餾水反復(fù)洗滌3 次，離心（4 500 r/min，10.0 min）得沉淀物，低溫干燥得米糠膳食纖維。

1.3.2 米糠膳食纖維的超高壓均質(zhì)處理 取1.3.1節(jié)制備的米糠膳食纖維，按料液比1∶20 加入蒸餾水混勻，進(jìn)行均質(zhì)處理。其處理?xiàng)l件為：均質(zhì)壓力120 MPa，3 個(gè)處理循環(huán)，每個(gè)循環(huán)30 s。其后，60℃低溫干燥得米糠膳食纖維粉。

1.3.3 面團(tuán)的制作及其面筋蛋白的提取 參考王世新等[13]的方法。將米糠膳食纖維粉按0%，5.0%，10.0%，15.0%，20.0%的比例添加于面粉中至終質(zhì)量為100 g，加水?dāng)嚢?，和面，將和好的面團(tuán)置于2.0% NaCI 溶液中靜置20 min，用面筋洗滌儀洗至清洗液清澈透明。將濕面筋置于恒溫干燥箱中，于40 ℃溫度條件下烘干，粉碎、篩分，即面筋蛋白成品。

1.3.4 米糠膳食纖維粉粒徑的測(cè)定 采用Mastersizer 2000 粒度儀測(cè)定脫脂米糠和米糠膳食纖維粉的粒徑。

1.3.5 米糠膳食纖維粉微觀結(jié)構(gòu)的觀察 參考Zhang M 等[14]的方法，將脫脂米糠和米糠膳食纖維粉置于載物片上進(jìn)行噴金固定處理，在5 kV 加速電壓下對(duì)樣品的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行電子顯微鏡觀察。

1.3.6 面筋蛋白的FTIR 采集及譜圖處理 采用KBr 壓片法獲得面筋蛋白的紅外圖譜，其儀器操作條件參考杜鵑等[15]的方法。圖譜處理：采用Originpro9.1 軟件處理面筋蛋白的紅外光譜數(shù)據(jù)，選取酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）為蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析譜帶區(qū)域。采用PeakFi t v4.12 軟件對(duì)截取的波段進(jìn)行基線校正、Deconvolve Gaussian IRF 去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合，得到各子峰所占面積百分比。依據(jù)子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行加和，得到其二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠膳食纖維粉粒徑

粒徑是反映物料顆粒大小的重要指標(biāo)[16]。經(jīng)超高壓均質(zhì)處理后米糠膳食纖維粉粒徑測(cè)定結(jié)果見表1。米糠膳食纖維粉粒度為納米級(jí)，其體積平均粒徑為244.25～261.95 nm?？梢?，超高壓均質(zhì)處理后米糠膳食纖維粉粒徑分布范圍較窄，接近于高斯分布[17]，說明超高壓均質(zhì)處理可以很好地改善米糠膳食纖維粉體的均勻性。

表1 米糠膳食纖維粉的粒徑分布Table 1 Size distribution of rice bran dietary fiber powder

2.2 米糠膳食纖維粉微觀結(jié)構(gòu)

脫脂米糠和超高壓均質(zhì)處理的米糠膳食纖維粉的掃描電子顯微鏡圖見圖1?？梢钥闯?，脫脂米糠（圖a 和b）原料中除了片狀纖維結(jié)構(gòu)外，還含有粒狀顆粒和光滑球狀物，其主要為淀粉或蛋白質(zhì)分子。經(jīng)超高壓均質(zhì)處理的米糠膳食纖維粉（圖c 和d）的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變，未見淀粉和蛋白質(zhì)分子顆粒，膳食纖維由大片狀的緊密型轉(zhuǎn)變?yōu)橛尚☆w粒、不規(guī)則的片狀物組成的松散型結(jié)構(gòu)。由此可見，超高壓均質(zhì)處理產(chǎn)生的剪切力促使膳食纖維分子鏈發(fā)生斷裂，聚合度降低。

圖1 脫脂米糠和米糠膳食纖維粉的掃描電子顯微鏡圖Fig.1 Scanning electron microscopy of defatted rice bran and rice bran dietary fiber powder

2.3 面筋蛋白的FTIR 圖譜分析

米糠膳食纖維不同添加量的面筋蛋白結(jié)構(gòu)變化的紅外光譜見圖1，其吸收峰所對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)譜帶歸屬見表2。由圖1和表2可知，在3 650～3 200，1 700～1 620，1 330～1 200 cm-1和990～1 160 cm-1范圍均出現(xiàn)蛋白質(zhì)的特征吸收峰。與空白組（膳食纖維添加量為0%）相比，添加米糠膳食纖維的面筋蛋白FTIR 光譜的譜帶半峰寬、強(qiáng)度均發(fā)生不同程度的變化?？梢?，添加米糠膳食纖維粉使面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖2 米糠膳食纖維粉不同添加量的面筋蛋白FTIR 圖譜Fig.2 The gluten protein FTIR spectra of rice bran dietary fiber different additions

表2 FTIR 特征峰及其譜帶歸屬[18～20]Table 2 Infrared characteristic peaks and their band assignments[18～20]

2.4 面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

在蛋白質(zhì)的紅外光譜圖中，酰胺I 帶主要由蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的紅外吸收子峰疊加而成，為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)域。為此，選擇酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）譜圖，經(jīng)基線校正、高斯去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合處理分離出米糠膳食纖維粉添加量分別為0%，5.0%，10.0%，15.0%和20.0%時(shí)面筋蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的定性、定量信息。對(duì)酰胺I 帶中各子峰進(jìn)行如下歸屬：1 610～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1為β-折疊結(jié)構(gòu)；1 646～1 664 cm-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)；1 637～1 645 cm-1為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；1 664～1 681 cm-1為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[22]。米糠膳食纖維粉不同添加量的面筋蛋白酰胺I 帶擬合曲線如圖2所示。以其為依據(jù)，對(duì)不同米糠膳食纖維粉添加量面筋蛋白質(zhì)酰胺I 帶波數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)指認(rèn)如表3所示。其面筋蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的百分含量如表4所示。

圖3 米糠膳食纖維粉不同添加量的面筋蛋白去卷積酰胺I 帶二階導(dǎo)數(shù)擬合圖譜Fig.3 Second-derivative FTIR spectra of gluten protein added to rice bran dietary fiber in the amide I region and Gaussian curve fitting

由圖3和表4可知，面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊為主，相對(duì)含量分別為27.55%和40.49%，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲所占的比例較小，分別為17.68%和14.28%。米糠膳食纖維粉的添加對(duì)面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響為α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量減少，而β-折疊含量增加。與空白樣品相比，米糠膳食纖維粉添加量為5.0%，10.0%，15.0%，20.0%時(shí)，α-螺旋含量分別減少了2.01%，2.76%，2.87%，3.15%，6.46%?？梢?，當(dāng)米糠膳食纖維粉添加量大于15.0%時(shí)，α-螺旋含量顯著（P<0.05）降低。其原因可能是超高壓均質(zhì)處理所產(chǎn)生的高剪切力雖然破壞了膳食纖維分子結(jié)構(gòu)中的無定形區(qū)，但是對(duì)其結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)影響較小[23]，因而當(dāng)膳食纖維添加量過高時(shí)，因空間位阻效應(yīng)而阻礙了面筋蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成。其次，隨著膳食纖維粒度下降，比表面積增加，其吸水能力增強(qiáng)，進(jìn)而爭(zhēng)奪蛋白質(zhì)分子結(jié)合的水分子，使面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵發(fā)生斷裂，結(jié)構(gòu)松散，穩(wěn)定性驟降。β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲總含量減少量分別為3.93%，3.57%，3.72%，3.74%，3.88%，而β-折疊含量增加量分別為6.94%，6.33%，6.87%，6.89%，7.79%，亦都呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲總含量的減少量與β-折疊含量增加量的變化趨勢(shì)相同。三者之間發(fā)生了轉(zhuǎn)變，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變成β-折疊結(jié)構(gòu)，這與Agnieszka[24]和Bock 等[25]的研究結(jié)果是一致的。由此可見，添加了米糠膳食纖維粉的面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)由反轉(zhuǎn)向折疊轉(zhuǎn)化的變化趨勢(shì)。再結(jié)合α-螺旋含量的變化結(jié)果，當(dāng)米糠膳食纖維粉的添加量控制在15%以下時(shí)面筋蛋白的空間結(jié)構(gòu)都趨于穩(wěn)定。

表3 面筋蛋白質(zhì)酰胺I 帶波數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)指認(rèn)Table 3 Wave number secondary structure designation of the gluten-protein amide I band

表4 米糠膳食纖維粉不同添加量的面筋蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分含量Table 4 Percentage of gluten protein secondary structure of different rice bran dietary fiber additions

3 結(jié)論

本文首先對(duì)米糠膳食纖維進(jìn)行超高壓均質(zhì)處理，其后將其添加于面粉中。通過對(duì)面粉、面筋蛋白結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)米糠膳食纖維粉添加量控制在15.0%以內(nèi)時(shí)，隨著膳食纖維粉添加量的增加，一方面面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量下降，維持α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵遭到破壞，面筋蛋白結(jié)構(gòu)變?yōu)樗缮?；另一方面，?轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變成β-折疊，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)又趨于穩(wěn)定。高壓均質(zhì)處理可作為膳食纖維物理改性的有效手段應(yīng)用于米糠膳食纖維的微粒化處理。