曹菲薇 汝文文 和嫻嫻 高登鋒 陳藝煊 常 成 王東亮* 朱加進*

（1 浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院 杭州310058 2 國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心 東阿阿膠股份有限公司 山東聊城252201 3 浙江大學動物科學學院 杭州310058）

丙烯酰胺（Acrylamide，AA）是一種白色、無嗅的晶體物質(zhì)，其聚合物——聚丙烯酰胺在工業(yè)生產(chǎn)和生物研究中被廣泛應用[1]。研究表明，含淀粉類的食品經(jīng)高溫加工（≥120 ℃）會產(chǎn)生丙烯酰胺，尤其在各種油炸和烤制食品中普遍存在[2]。由于丙烯酰胺極易溶于水，且分子質(zhì)量較低，因此容易通過呼吸道、皮膚和消化途徑等進入動物和人體。Zhang 等[3]曾在乳汁和胎盤中發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺。丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性、遺傳毒性、生殖毒性及潛在的致癌性，被國際癌癥研究中心列為2A 類致癌物[4]。研究表明，丙烯酰胺引起的神經(jīng)毒性可能是因機體氧化與抗氧化之間的平衡受到破壞而引起的，而這種破壞往往是由活性氧（ROS）和脂質(zhì)過氧化過度造成的[5]。Chen 等[6]研究發(fā)現(xiàn)Caco-2 細胞在AA 作用下孵化時加速了24 h 內(nèi)產(chǎn)生的ROS 且降低了細胞活性。探索減少AA 導致氧化應激損傷的方法成為研究熱點。為實現(xiàn)這一目的，研究人員主要從兩方面入手，一方面，減少食品加工過程中AA 的產(chǎn)生。國內(nèi)外已有許多研究人員在加工工藝和抑制劑兩個方向上進行探究，例如Santina Romani 等[8]研究發(fā)現(xiàn)油炸溫度相同時，油炸時間越長AA 生成量越多；Jung 等[9]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)檸檬酸處理過的油炸、烘烤玉米片AA 含量分別下降了82.2%和72.8%。另一方面，抑制已產(chǎn)生的AA 對機體造成的危害。目前研究人員主要從植物提取物和營養(yǎng)素方向進行研究。例如，Jiang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)AA 能使IEC-6 細胞ROS 活性升高，抗氧化酶活性減弱，而靈芝多糖預處理能顯著抑制ROS 產(chǎn)生，提高抗氧化酶活性。Hamdy 等[11]用AA 處理雌性大鼠，結(jié)果SOD、CAT、GSH-Px 顯著降低，用橙皮素處理后，抗氧化酶活性顯著上升（P＜0.001）。Rasha 等[12]用AA 飼喂白化病大鼠，持續(xù)40 d，實驗結(jié)束后發(fā)現(xiàn)AA 組MDA 顯著上升，且舌骨骼肌有明顯的損傷。而用維生素E 與AA 共同飼喂的大鼠則能改善以上現(xiàn)象，且時間越長，改善效果越好。目前關于動物性食品對丙烯酰胺毒性抑制作用的研究還十分少見。

阿膠（Colla corii asini，CCA） 為馬科動物驢（Equus asinus L．） 的干燥皮或鮮皮制成的固體膠，與人參、鹿茸并稱為“滋補三寶”。阿膠的化學成分主要是皮膠原、多糖、揮發(fā)性物質(zhì)和無機物質(zhì)等[13]，具有補血、抗凝、鎮(zhèn)靜和提高免疫等功效。Wang 等[14]發(fā)現(xiàn)阿膠可以通過增強SOD、CAT 和GSH-Px 的活性以及抑制MDA 的生成來延緩老年小鼠的衰老過程。斑馬魚 （Danio rerio，Zebrafish） 是近年備受關注的模式生物，具有個體小，發(fā)育周期較短，產(chǎn)卵量大，胚胎透明，易于觀察等特點[15]，且與人類基因相似度超過80%等優(yōu)點[16]，也因此斑馬魚常被用于藥理學、毒理學和發(fā)育學等方向的研究。Zhang 等[17]以斑馬魚為動物模型，研究丙烯酰胺導致的氧化應激損傷，研究發(fā)現(xiàn)2 mmol/L AA 處理后斑馬魚胚胎顯示出ROS 含量顯著升高，GSH 含量、SOD 和GST 活力顯著降低等氧化應激現(xiàn)象。

本文從丙烯酰胺導致斑馬魚胚胎氧化應激損傷的現(xiàn)象入手，研究動物性食品阿膠的抗氧化性能及其機理，為阿膠的開發(fā)利用提供理論基礎，為防御丙烯酰胺危害提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斑馬魚胚胎培養(yǎng)液 （0.05%海鹽和0.002%亞甲藍），由純凈水、海鹽與亞甲基藍制備而成。

阿膠，由山東東阿阿膠股份有限公司提供。將阿膠粉碎，取1.25 g 阿膠粉末與500 mL 胚胎培養(yǎng)液混合，制備2.5 mg/mL 的母液，備用。試驗時將阿膠母液用培養(yǎng)液稀釋為0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mg/mL 和2.50 mg/mL 的工作液。

丙烯酰胺（純度≥99.9%），阿拉丁試劑公司；活性氧 （ROS） 測定試劑盒E004、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒A007-1-1、丙二醛（MDA）測定試劑盒A003-1、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒A001-3、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒A005、總蛋白定量測定試劑盒A045-2，南京建成生物工程研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II 試劑盒，大連TAKARA 生物技術(shù)公司；其余化學試劑均為分析純級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 斑馬魚的飼養(yǎng)與胚胎收集

所有動物實驗完全按照《浙江省實驗動物使用條例》執(zhí)行，且獲得了浙江大學醫(yī)學院動物倫理委員會的批準（倫理規(guī)范許可號：ZJU2018-3-24-009Y）。將斑馬魚養(yǎng)殖在獨立養(yǎng)魚系統(tǒng)中，水溫控制在（28±0.5）℃，光周期14 h（光）：10 h（暗），每天飼喂2 次豐年蟲幼蟲。

胚胎收集方法：提前一晚將成年斑馬魚按照雌、雄比2∶1 的比例裝入交配盒中，并用隔板將雌、雄魚分開，第2 天早上光照1 h 后移去隔板。1 h 后，挑選發(fā)育正常的胚胎，用胚胎培養(yǎng)液輕輕漂洗，備用。

1.3 斑馬魚胚胎暴露實驗

1.3.1 CCA 對斑馬魚胚胎存活率的影響 從7～9 hpf 開始，將560 顆胚胎隨機分成7 組，轉(zhuǎn)移到48孔板中，每個孔1 個胚胎且均加入1 mL 胚胎水，其中CCA 質(zhì)量濃度分別為0，0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mg/mL 和2.50 mg/mL，然后，分別在24，48，72，96 hpf 和120 hpf 時記錄胚胎的存活率，以確定CCA 的最佳培養(yǎng)濃度。

1.3.2 CCA 對丙烯酰胺誘導的斑馬魚氧化應激損傷的保護作用 將胚胎隨機分成5 組，其中一個為對照組（胚胎培養(yǎng)液），一個丙烯酰胺（AA）組，另外3 個為低、中、高濃度的阿膠處理組（0.05，0.10 mg/mL 和0.50 mg/mL），每組3 個平行，每個平行90 個胚胎。

具體暴露過程是：如圖1所示，對照組：用胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)至72 hpf；AA 組及CCA 組：取7～9 hpf 斑馬魚于含有不同CCA 質(zhì)量濃度（0，0.05，0.10 mg/mL 和0.50 mg/mL）的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。處理1 h 后，將胚胎分別加入同時含有3 mmol/L丙烯酰胺以及相應阿膠質(zhì)量濃度（0，0.05，0.10 mg/mL 和0.50 mg/mL）的胚胎培養(yǎng)液中，直到24 hpf。取出胚胎，用胚胎培養(yǎng)液輕輕漂洗，并用胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)至72 hpf。

在本次實驗中，PMs 和PWMs 2種方法共同表明了年平均流量呈單元尺度性，且平均尺度因子為1.158。

圖1 斑馬魚胚胎暴露流程圖Fig.1 Flow chart of the exposure of zebrafish embryos

1.4 胚胎活性氧（ROS）含量測定與熒光圖像分析

參照Gerber 等[19]的研究，采用活性氧熒光探針DCFH-DA 方法檢測斑馬魚胚胎總體活性氧水平。將72 hpf 胚胎用胚胎培養(yǎng)液清洗3 次，每組取24 個胚胎轉(zhuǎn)移至96 孔板中，加入含有10 μmol/L DCFH-DA 的胚胎培養(yǎng)液250 μL，28.5 ℃避光孵育30 min；隨后用不含DCFH-DA 的胚胎培養(yǎng)液漂洗胚胎3 次，轉(zhuǎn)移至96 孔黑色酶標板中，每組取10 個胚胎用多功能酶標儀檢測熒光強度，另取10 顆胚胎用配有彩色數(shù)碼相機的熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本）觀察拍攝斑馬魚圖像。

1.5 氧化應激相關生化指標檢測

斑馬魚胚胎培養(yǎng)72h 后，用PBS 漂洗胚胎，再根據(jù)試劑盒說明書，用0.86%的生理鹽水在冰上制備得到質(zhì)量分數(shù)為10%的斑馬魚組織勻漿液，離心，取上清，測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力、丙二醛（MDA）和總蛋白（TP）含量。

1.6 氧化應激相關基因表達水平測定

參照Shin 等[20]的研究，首先使用TRIzol 試劑將總RNA 提取出來，然后用微量核酸測定儀（NanoDrop 1000） 在波長260 nm 處估算總RNA濃度，且通過A260nm/A280nm比率評估RNA 的質(zhì)量。

樣品總RNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，目標基因引物由大連TAKARA 公司合成（表1）。qRT-PCR程序：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃45 s，55 ℃10 s。基因表達的差異倍數(shù)通過2-ΔΔCt方法計算，對每個濃度組設置3 個生物學重復。

1.7 統(tǒng)計分析

使用SPSS20.0，以單因素方差分析和Turkey’s 多因素t 檢驗進行比較，并進行one-way ANOVA 數(shù)據(jù)分析。P＜0.05 為統(tǒng)計顯著，所有結(jié)果表示方法均為平均值±標準差（SD）。

表1 實時定量PCR 反應引物序列Table 1 Sequences of primers for RT-qPCR amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 CCA 濃度對斑馬魚胚胎存活率的影響

參考Cai 等[21]的研究，探究適合的斑馬魚胚胎的CCA 濃度。用不同濃度CCA 處理斑馬魚胚胎并培養(yǎng)至120 hpf，每隔24 h 記錄存活率。由表2可知，當CCA 質(zhì)量濃度在0.01～0.5 mg/mL 之間時，斑馬魚胚胎的存活率沒有明顯差異，而當CCA質(zhì)量濃度大于1 mg/mL 時，存活率顯著下降（P＜0.001）。最終選擇0.05，0.10 mg/mL 和0.50 mg/mL的阿膠溶液做下一步實驗。

2.2 CCA 對斑馬魚胚胎氧化應激的保護作用

2.2.1 斑馬魚胚胎存活率 由圖2可知，將胚胎用AA 處理后，24，48 hpf 和72 hpf 的存活率較對照組降至（80±3.74）%，（78.33±2.87）%和（78±3.27）%（P＜0.01）。與CCA 共同處理后，胚胎存活率明顯提高，呈劑量依賴性，如0.50 mg/mL CCA處理的胚胎存活率顯著提高（P＜0.05）。

表2 不同濃度阿膠溶液處理后斑馬魚胚胎的存活率（%）Table 2 The survival rate （%） of zebrafish embryos in different concentrations of CCA

圖2 CCA 對AA 暴露誘導的斑馬魚胚胎氧化應激損傷的存活率的影響Fig.2 Effect of CCA on survival rates of AA-induced oxidative stress zebrafish embryos

2.2.2 斑馬魚胚胎活性氧含量 用熒光探針DCF檢測細胞內(nèi)ROS 生成水平，評價CCA 是否對AA產(chǎn)生的氧化應激損傷起到保護作用[22]。由圖3A 可知，AA 誘導的ROS 含量比對照組增加約1.11 倍（P＜0.01），與CCA 共同處理后ROS 含量顯著降低，且呈劑量依賴性。當CCA 質(zhì)量濃度達到0.5 mg/mL 時，與AA 組比，ROS 水平降低了9.31%（P＜0.01）。由圖3B 的熒光圖像可知，AA 組與對照組相比熒光強度顯著增強，而CCA 預處理的斑馬魚胚胎ROS 強度明顯降低。這說明CCA 可有效抑制ROS 的產(chǎn)生。

圖3 CCA 對AA 暴露誘導的斑馬魚胚胎氧化應激的活性氧自由基（ROS）的清除作用Fig.3 Effect of CCA on ROS levels in AA-induced oxidative stress in zebrafish embryos

2.2.3 斑馬魚胚胎抗氧化相關生化指標 為了進一步探討CCA 的保護作用機制，測定斑馬魚胚胎抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT 活性。如圖4a 和4b所示，與對照組相比，單獨暴露于濃度3 mmol/L的AA 組，斑馬魚胚胎的SOD 和GSH-Px 活性顯著降低 （分別降低了59%和25%，P＜0.01 和P＜0.05）。用0.5 mg/mL CCA 處理的斑馬魚胚胎，SOD 和GSH-Px 活性顯著升高，分別提高了94.52%和32.05%（P＜0.05）。如圖4c 所示，與對照組相比，AA 組顯著降低CAT 含量（P＜0.01）。斑馬魚胚胎經(jīng)0.10 mg/mL 和0.50 mg/mL CCA 處理后，CAT 含量比AA 組分別增加了96%和117%（P＜0.01 和P＜0.001）。如圖4d 所示，與對照組相比，AA 處理增加了244%的MDA 含量（P＜0.01），而當斑馬魚胚胎預先暴露于不同濃度的CCA 時，MDA 含量降低了41.33%（P＜0.05）。

圖4 CCA 對AA 暴露誘導的斑馬魚胚胎氧化應激的抗氧化指標的影響Fig.4 Effect of the CCA on AA-induced antioxidant indictors in AA-induced oxidative stress zebrafish embryos

2.3 氧化應激相關基因相對表達量

如圖5所示，與對照組相比，AA 顯著降低Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、GPX1 和keap1 的表達水平（P＜0.05），提高了Nrf2、HO-1、NQO1 的表達水平（P＜0.001）。CCA 處理后，Nrf2 及其調(diào)控的基 因HO-1、NQO1、GPX1、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和CAT 基因表達水平進一步上調(diào)，而keap1 顯著下降。與AA 組相比，高濃度CCA 組胚胎抗氧化基因Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、GPX1、Nrf2、HO-1、NQO1 的表達水平分別上調(diào)了21.06%，19.98%，38.27%，93.01%，46.23%，35.12%，137.19%（P＜0.05），keap1 的表達水平則下調(diào)了54.24%（P＜0.05）。試驗結(jié)果表明，3 mmol/L AA 可誘導斑馬魚胚胎發(fā)生氧化應激，Nrf2-keap1/ARE 通路被激活，機體內(nèi)Nrf2 基因和下游的NQO1、HO-1 基因表達量均顯著升高，keap1 基因顯著降低，從而提高抗氧化能力，以減輕氧化應激帶來的損傷。試驗結(jié)果顯示，AA 處理后，抗氧化酶對應的基因Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT 和GPX1 顯著下降，與抗氧化酶的變化趨勢一致，而與Nrf2 基因的變化趨勢相反。與AA 組相比，阿膠處理進一步增強了Nrf2及其下游抗氧化酶基因和II 相解毒酶基因的表達水平，從而有效增強了機體的抗氧化能力，實現(xiàn)對機體的保護作用。

圖5 CCA 對氧化應激斑馬魚胚胎的抗氧化相關基因表達水平的影響Fig.5 Effect of CCA on the mRNA expression of antioxidant related genes in AA-induced oxidative stress in zebrafish embryo shown in pictures

3 討論

眾所周知，AA 具有較強的神經(jīng)毒性、發(fā)育毒性和心臟損傷作用等，對人體健康造成危害。Alturfan 等[5]指出，AA 通過破壞機體氧化損傷和抗氧化損傷的防御平衡體系，產(chǎn)生過量自由基。此外，Gedik 等[23]和Ince 等[24]發(fā)現(xiàn)，隨著氧化應激水平的升高，MDA 的含量會有所增加。本研究中，AA 處理導致斑馬魚胚胎ROS 和MDA 含量均顯著升高，這一結(jié)果與Huang 等[25]的研究結(jié)果一致。Hassan 等[27]、Prasad 等[28]和Sour 等[29]研 究表 明，除了MDA 含量升高，AA 導致的氧化應激還表現(xiàn)在抑制抗氧化酶的活性，包括SOD、CAT 和GSHPx。Catalgol 等[30]指出，SOD 能清除機體超氧陰離子，CAT 可以直接催化H2O2還原為對機體無害的H2O 和O2。GSH-Px 在AA 誘導產(chǎn)生的ROS 解毒過程中起到重要作用[7]。本研究中，AA 組SOD、CAT 和GSH-Px 的活力均顯著下降，這表明AA可能通過抑制抗氧化酶活性，進一步加劇了脂質(zhì)過氧化的作用，使MDA 和ROS 含量的升高。為探究抗氧化酶與其對應基因的水平是否一致，用實時定量PCR 對抗氧化酶相關基因水平進行測定。AA 組處理后的斑馬魚胚胎Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT 和GPX1 基因的表達水平顯著降低，與SOD、CAT 和GSH-Px 活性下降一致。由此可知，AA 通過降低抗氧化酶相關基因的表達，抑制了抗氧化酶的活性。

Ma[31]和Tanaka 等[32]指出細胞抵御氧化應激的主要機制是激活kelch 樣ECH 關聯(lián)蛋白1-轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關因子/抗氧化應激原件[Kelchlike ECH-associated protein 1（Keap1）-Nrf2 （nuclear factor E2-related factor 2）/ARE （antioxidant response element）]信號通路，該信號通路控制了與ROS 產(chǎn)生有關蛋白的基因的表達。Ma[31]和Liu 等[33]發(fā)現(xiàn)在正常生理條件下，Nrf2 與Keap1 在細胞質(zhì)中相結(jié)合。Hybertson 等[34]指出當受到親電子物質(zhì)或其它氧化物質(zhì)刺激時，Nrf2 與Keap1 解偶聯(lián)并進入細胞核，與ARE 結(jié)合，啟動控制抗氧化酶如SOD 的基因表達。本研究中，與對照組相比，AA 可上調(diào)Nrf2、HO-1、NQO1 基因表達水平，并下調(diào)keap1 基因的表達水平，這一結(jié)果表明AA可激活Nrf2 及其下游HO-1、NQO1 基因的轉(zhuǎn)錄活性。

Ramos 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，ROS 的過量產(chǎn)生會導致細胞氧化還原紊亂，而抗氧化劑的補充通過減少ROS 來顯著調(diào)節(jié)細胞氧化應激水平。Chen 等[38]在研究黑莓消化產(chǎn)物對AA 誘導的氧化應激保護作用試驗中，發(fā)現(xiàn)黑莓消化物預處理后Caco-2 細胞產(chǎn)生的ROS 是AA 組的（56.6±2.9）%。Jiang 等[39]用IEC-6 細胞探究靈芝多糖對AA 誘導的氧化損傷的保護作用，研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖處理組與AA組相比，SOD 活性提高了103.56%，GSH-Px 活性也有顯著提高，而MDA 和ROS 含量則顯著降低。本研究中，與AA 組相比，CCA 和AA 共同處理的斑馬魚胚胎ROS 和MDA 含量分別降至10.05%和41.33%，SOD 活性提高了94.52%，CAT 和GSH-Px 的活性也都顯著提高。CCA 組胚胎中，與抗氧化酶對應的Mn-SOD、Cu/Zn-SOD 和CAT 基因表達水平均顯著升高，即與酶活性一致。Akino等[40]發(fā)現(xiàn)在人顆粒細胞中，激活Nrf2 可提高Cu/Zn-SOD、CAT、ogg1 等基因的表達水平，從而降低氧化應激水平。與AA 組相比，CCA 處理過的斑馬魚胚胎Nrf2 基因水平顯著升高。結(jié)合MDA 和ROS 的結(jié)果推測：AA 對Nrf2 的激活可能是AA在體內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS 后所激活引起的。試驗數(shù)據(jù)還顯示，與AA 組相比，阿膠的預處理能使Nrf2基因表達水平進一步提高，表明阿膠可改善Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，激活下游抗氧化酶和II 相解毒酶的轉(zhuǎn)錄，增加細胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)，從而對機體起到保護作用。

Cong 等[41]研究指出，SOD、CAT 和GSH-Px 也是Nrf2 調(diào)控的下游抗氧化酶，受到激活的Nrf2 能夠啟動調(diào)控Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、GPX1 基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而增強機體抗氧化酶含量。然而，本研究結(jié)果顯示，AA 處理后抗氧化酶及其基因表達水平均顯著下降，而非上升。這一結(jié)果與2019年Cui 等[42]對杜鵑素的氧化應激調(diào)節(jié)作用的研究結(jié)果類似。這可能與以下兩個方面有關：一是AA 能夠直接作用于調(diào)控抗氧化酶的基因，抑制其進行轉(zhuǎn)錄表達；二是AA 導致Nrf2 上調(diào)，Nrf2 也啟動了下游SOD、CAT 和GSH-Px 對應基因的表達，而該程度遠弱于AA 對抗氧化酶基因直接的抑制作用，因此，最終呈現(xiàn)出AA 作用后Nrf2 上調(diào)，SOD、CAT 和GSH-Px 對應的基因不增反降的結(jié)果。

綜上所述，阿膠能提高抗氧化能力，抑制丙烯酰胺誘導的斑馬魚胚胎脂質(zhì)過氧化物的生成，對丙烯酰胺誘導的斑馬魚胚胎氧化應激損傷具有保護作用。