劉巧，羅強(qiáng)，張明，生龍娜雍，關(guān)仁梅，羅璠*

1(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都，610041)2(青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西南民族大學(xué))，四川 成都，610041)

泡菜是以新鮮蔬菜為原料，經(jīng)過(guò)一定濃度鹽水腌漬，由優(yōu)勢(shì)菌群乳酸菌以厭氧主導(dǎo)發(fā)酵而成的蔬菜食品[1]。中國(guó)泡菜有著悠久的歷史，在3千多年前的商周時(shí)期家家戶(hù)戶(hù)就開(kāi)始制作和食用,數(shù)千年來(lái)流傳廣泛，延續(xù)至今，是珍貴的中國(guó)優(yōu)良傳統(tǒng)發(fā)酵食品。泡菜不僅質(zhì)地鮮嫩，香脆爽口，而且含有大量的膳食纖維、維生素、抗酸化活性因子以及益生菌等，能夠幫助機(jī)體排毒，促進(jìn)身體新陳代謝，延緩肌膚衰老，利于胃腸道消化。

研究傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中微生物多樣性的主要方法是可培養(yǎng)和免培養(yǎng)?？膳囵B(yǎng)方法即采用傳統(tǒng)分離純化鑒定的方法，例如黨喬等[2]通過(guò)MRS培養(yǎng)基分離和16S rDNA測(cè)序，從不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的泡菜中分離篩選出34株乳酸菌，并分析其種類(lèi)和數(shù)量。劉境等[3]采用分離純化方法在自然發(fā)酵錦州小菜中篩選得到24株疑似乳酸菌，通過(guò)16S rDNA序列分析對(duì)24株菌進(jìn)行鑒定。由于傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)只能獲得環(huán)境中微生物總量的極少部分，因此對(duì)于展現(xiàn)環(huán)境中微生物的多樣性存在很大的片面性[4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，通過(guò)直接提取環(huán)境微生物基因組DNA的方法，可以從分子水平上全面解釋系統(tǒng)中微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)。如陳希等[5]采用建立16S rDNA克隆文庫(kù)的方法，對(duì)不同腌制階段雪菜的細(xì)菌多樣性以及相關(guān)指標(biāo)的變化情況進(jìn)行了研究。曹碧璇等[6]利用構(gòu)建16S rRNA基因文庫(kù)的方法,研究了東北自然發(fā)酵酸菜中的細(xì)菌多樣性和群落的組成結(jié)構(gòu)。CHANG等[7]運(yùn)用變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrop-hores，PCR-DGGE)技術(shù)，對(duì)不同類(lèi)型泡菜發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌、古菌和酵母的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究。應(yīng)用這些方法可以更加清晰地了解泡菜中微生物的多樣性和菌群結(jié)構(gòu)，避免了傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法獲取微生物信息的局限性。因此，本研究基于發(fā)酵泡菜地區(qū)差異的因素，構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)對(duì)吉林、河南、遼寧、內(nèi)蒙古4個(gè)地區(qū)發(fā)酵泡菜的細(xì)菌多樣性和群落的組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，探討不同地區(qū)發(fā)酵泡菜中微生物多樣性的異同之處，以便確切了解不同地區(qū)泡菜中的微生物資源分布和泡菜發(fā)酵機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品分別取自吉林(JL)、河南(HN)、遼寧(LN)和內(nèi)蒙古(NMG)4個(gè)地區(qū)當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)的自然發(fā)酵農(nóng)家泡菜液,密封保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

2×Tap 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR) Master Mix、TE緩沖液(pH=8.0)，索萊寶科技有限公司；SuperRed/GelRed核酸染色劑、引物Eu27F、1490R，上海生工生物工程有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR純化試劑盒，江蘇科晶生物科技有限公司；DH5α-感受態(tài)細(xì)胞、TIANGEN、pGM-T克隆試劑盒，上?？道噬锟萍加邢薰?；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

ST16R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾有限公司；T100PCR儀，深圳瑞華希科技有限公司；R40-IIB2超凈工作臺(tái)，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；Tanon3500凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；GI54DW高壓蒸汽滅菌鍋，廈門(mén)致微儀器有限公司；DYCP-31DN水平電泳儀，南京庚辰科學(xué)儀器有限公司； GH6000電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特設(shè)備有限公司；NanoDrop2000微量核酸測(cè)定儀，上海學(xué)靜生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌基因組DNA提取

用細(xì)菌組DNA提取試劑盒提取泡菜液中的細(xì)菌DNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體操作。

1.4.2 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增引物：Eu27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1490R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′[8]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：模板DNA 1 μL(100 ng/μL)，上下游引物各2 μL(10 pmol/μL)，2×Tap PCR Master Mix 12.5 μL，無(wú)菌雙蒸水7.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸70 s，循環(huán)30次,72 ℃延伸20 min后反應(yīng)結(jié)束，4 ℃保溫備用[9]。

1.4.3 克隆文庫(kù)的構(gòu)建

經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物，通過(guò)pGM-T克隆試劑盒與pGM-T載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α-感受態(tài)細(xì)胞中，并在Amp-X-gal-IPTG抗性篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選具有氨芐青霉素抗性的白色菌落。再通過(guò)菌液PCR檢測(cè)篩選正確的陽(yáng)性克隆子，然后建立16S rDNA克隆文庫(kù)。每個(gè)地區(qū)泡菜樣品中隨機(jī)挑選50個(gè)陽(yáng)性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4.4 16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

將200個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序后，用軟件UCHIME對(duì)所測(cè)得的16S rDNA序列進(jìn)行嵌合體識(shí)別，檢查有無(wú)異常序列后再利用GeneBank的BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)選擇相似度最高的16S rDNA序列。使用CLASSIFIER(RDP II)對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行分類(lèi)[10]。用軟件BioEdit將所有序列以相似性≥97%劃分為1個(gè)操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit，OTU)[11]。使用MAGA 5.0軟件通過(guò)Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[12]，并用Bootstrap(1 000次) 檢驗(yàn)發(fā)育樹(shù)的置信度。

1.4.5 細(xì)菌群落多樣性分析

文庫(kù)的覆蓋率可以反映所建文庫(kù)對(duì)系統(tǒng)中細(xì)菌多樣性的表現(xiàn)程度。采用覆蓋率Coverage C評(píng)估泡菜細(xì)菌克隆文庫(kù)的庫(kù)容情況,如公式(1)所示：

Coverage C/%=[1-(n1×N-1)]×100

(1)

式中:n1代表文庫(kù)中只出現(xiàn)1次的克隆子數(shù)目，N代表文庫(kù)中克隆子總數(shù)[13]。

微生物多樣性和均勻度指數(shù)顯示群落中種類(lèi)多寡及菌株分布等情況，采用4個(gè)指標(biāo)即shannon指數(shù)，simpson優(yōu)勢(shì)度，pielou均勻度，sorensen similarity相似度指數(shù)評(píng)價(jià)泡菜樣品細(xì)菌群落的多樣性，以上均采用R語(yǔ)言中vegan及biodiversity r包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制稀釋曲線(xiàn)(rarefaction curve)。根據(jù)不同地區(qū)泡菜樣品的共同OTU數(shù)目和單獨(dú)OTU數(shù)目，繪制維恩圖，并結(jié)合菌群組成柱狀圖和熱圖分析菌群的群落結(jié)構(gòu)多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆文庫(kù)評(píng)價(jià)

本研究根據(jù)樣品的OTU數(shù)據(jù)結(jié)果，做出吉林、河南、遼寧、內(nèi)蒙古4個(gè)地區(qū)泡菜樣品的稀釋曲線(xiàn)，如圖1所示。隨著每個(gè)地區(qū)泡菜細(xì)菌的克隆子數(shù)目增加，OTU數(shù)目逐漸增加, rarefaction曲線(xiàn)逐漸上升趨于平坦，這說(shuō)明所測(cè)序的克隆數(shù)能夠反映克隆構(gòu)建文庫(kù)中的細(xì)菌多樣性，可以囊括泡菜樣品中大多數(shù)的菌落。并且4個(gè)地區(qū)的細(xì)菌克隆文庫(kù)的覆蓋率均較高，依次為92%、94%、86%、92%，這也表明克隆文庫(kù)的庫(kù)容已足夠，能夠較完整地反映細(xì)菌群落多樣性。

圖1 細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)稀釋曲線(xiàn)Fig.1 Rarefaction analysis of bacteria 16S rDNA clone library

2.2 細(xì)菌群落OTU分布

經(jīng)分析將200條合格序列按照97%序列相似性共劃分為9個(gè)OTU。采用R語(yǔ)言工具統(tǒng)計(jì)并繪制OTU分布維恩圖，可以直觀(guān)展現(xiàn)4個(gè)地區(qū)發(fā)酵泡菜菌群在OTU構(gòu)成上的相似性、特異性和交疊情況。結(jié)果如圖2所示，吉林、河南、遼寧、內(nèi)蒙古4個(gè)地區(qū)泡菜的OTU數(shù)目存在差異，分別為4、3、7、4個(gè)OTU，其中遼寧地區(qū)的OTU數(shù)目最多，河南地區(qū)的OTU數(shù)目最少。同時(shí)這4個(gè)地區(qū)的細(xì)菌群落組成有重疊，說(shuō)明它們之間均存在共同的群落，其中4個(gè)地區(qū)中共有的細(xì)菌OTU數(shù)目為2。兩兩地區(qū)間也存在共同的OTU，吉林和內(nèi)蒙古共有的細(xì)菌OTU數(shù)量為4；遼寧和河南共有的細(xì)菌OTU數(shù)目為3。另外在遼寧地區(qū)中特異性細(xì)菌OTU數(shù)目為4，而其他3個(gè)地區(qū)沒(méi)有特異性細(xì)菌OTU，這說(shuō)明遼寧地區(qū)泡菜的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣，細(xì)菌群落組成特異性在這4個(gè)地區(qū)中最大。

圖2 不同地區(qū)發(fā)酵泡菜OTU維恩圖譜Fig.2 OTU Venn diagram of fermented pickles in different regions

2.3 多樣性指數(shù)及相似度分析

不同地區(qū)泡菜的細(xì)菌多樣性見(jiàn)表1，遼寧地區(qū)和吉林地區(qū)的多樣性指數(shù)分別為1.555和1.015，說(shuō)明這兩個(gè)地區(qū)泡菜的細(xì)菌群落具有較高的多樣性，并且遼寧地區(qū)的細(xì)菌群落具有更為豐富的多樣性，而河南和內(nèi)蒙古地區(qū)的多樣性指數(shù)分別為0.43和0.5，泡菜的細(xì)菌群落多樣性相對(duì)較低。同時(shí)，除河南地區(qū)的其他3個(gè)地區(qū)泡菜的均勻度指數(shù)相差不大，為0.549～0.69，但河南地區(qū)泡菜的均勻度指數(shù)很低為0.384，說(shuō)明河南地區(qū)泡菜的細(xì)菌種群的分布很不均勻。另外，相似系數(shù)顯示了遼寧地區(qū)和其他3個(gè)地區(qū)的泡菜相似性較平均，均在0.5以上，而內(nèi)蒙古和河南地區(qū)的泡菜之間的細(xì)菌相似度最差，相似系數(shù)僅為0.12。

表1 不同地區(qū)泡菜細(xì)菌的多樣性指數(shù)和相似性Table 1 The diversity index and similarity index of pickles bacteria with different regions

2.4 不同地區(qū)泡菜的菌群分布及主要優(yōu)勢(shì)菌

本研究中200條克隆子序列經(jīng)CLASSIFIER進(jìn)行分類(lèi)后，顯示這些克隆子均為乳酸菌，屬于硬壁菌門(mén)，并且分布于乳桿菌屬(Lactobacillus)(83%)，腸球菌屬(Enterococcus)(15.5%)，明串珠菌屬(Leuconostoc)(1%)以及片球菌屬(Pediococcus)(0.5%)。將所有序列在NCBI上和GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果得到不同地區(qū)泡菜的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成,如圖3所示。

圖3 不同地區(qū)泡菜的細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)克隆子分布圖Fig.3 Distribution map of the clones in the bacteria 16S rDNA clone libraries of pickle with different regions

STACKBRANDT等[14]認(rèn)為16S rDNA基因序列同源性≥97%的菌株可以看作一個(gè)種。而對(duì)于基因序列高度相似的Enterococcus屬只鑒定至屬水平，因此在其余169個(gè)菌株中，129個(gè)(64.5%)經(jīng)鑒定為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis),17個(gè)(8.5%)為沙克酸乳桿菌(Lactobacillussakei),10個(gè)(5%)為棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)，5個(gè)(2.5%)為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，4個(gè)(2%)為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)，2個(gè)(1%)為腸系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，1個(gè)(0.5%)為Pediococcussiamensis，1個(gè)(0.5%)為彎曲乳酸桿菌(Lactobacilluscurvatus)。圖3表明所有菌種在4個(gè)地區(qū)泡菜中呈現(xiàn)不均衡分布，在內(nèi)蒙古和河南的泡菜中，L.brevis占了絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，是最優(yōu)勢(shì)菌群，分別占克隆文庫(kù)比例為90%和86%；同樣在吉林和遼寧，L.brevis所占的比例相對(duì)較大，為主要優(yōu)勢(shì)菌群，所占比例分別為46%、36%；而遼寧泡菜的主要優(yōu)勢(shì)菌群還有L.sakei和L.coryniformis，分別占克隆文庫(kù)比例為26%和20%。從整體上來(lái)看Lactobacillus在4個(gè)地區(qū)泡菜微生物中均占據(jù)了絕大部分，根據(jù)以往的研究表明，泡菜中的乳酸菌大多數(shù)來(lái)自于Lactobacillus屬，這與本研究結(jié)果相符。田偉等[15]通過(guò)構(gòu)建16S rRNA基因文庫(kù)，對(duì)四川發(fā)酵泡菜中的菌落組成進(jìn)行分析，所分析的克隆子主要分布于Lactobacillus屬和Pediococcus屬，且Lactobacillus屬占主導(dǎo)。武俊瑞等[16]運(yùn)用PCR-DGGE 技術(shù)從東北發(fā)酵酸菜中分離和鑒定出Lactobacillus屬的9個(gè)種。張先琴等[17]通過(guò)PCR和PCR-DGGE技術(shù),分析四川家庭制作泡菜中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其中的Lactobacillus屬是優(yōu)勢(shì)種群。而針對(duì)4個(gè)地區(qū)泡菜中均占據(jù)一定比例的Enterococcus屬，在以前的研究中也有報(bào)道過(guò)[18-19]。

2.5 不同地區(qū)泡菜的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異比較

Heatmap圖可以用顏色深淺度來(lái)反映樣本間或物種豐度相似性聚類(lèi)[20]，將聚類(lèi)結(jié)果展示在Heatmap圖上采用R語(yǔ)言vegan包進(jìn)行距離計(jì)算和聚類(lèi)分析；得到4個(gè)地區(qū)泡菜細(xì)菌群落及其分類(lèi)水平Heatmap圖，如圖4所示，圖中每一行代表不同的種，不同的顏色代表不同的豐度，圖中顏色越接近紅色，表示在對(duì)應(yīng)地區(qū)泡菜中的菌種豐度越大。反之，顏色越接近藍(lán)色則物種豐度越小。由圖4可知，不同細(xì)菌物種在各地區(qū)泡菜中所占豐度不同，其中L.pentosus在吉林和內(nèi)蒙古地區(qū)泡菜中豐度較高；L.brevis在河南和內(nèi)蒙古地區(qū)泡菜中豐度較高；Enterococcus屬和L.plantarum在吉林地區(qū)的泡菜中豐度較高，但遼寧泡菜的細(xì)菌菌種比較多，也是各地區(qū)菌種差異的主要來(lái)源，主要集中于L.coryniformis，Leu.mesenteroides，L.curvatus，Ped.siamensis。而在吉林，河南和內(nèi)蒙古地區(qū)的泡菜中細(xì)菌菌種較少，微生物種類(lèi)多樣性相對(duì)較低，這說(shuō)明不同地區(qū)泡菜的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

圖4 不同地區(qū)泡菜的微生物多樣性Heatmap圖Fig.4 Heatmap analysis of microbiological diversity in pickles with different regions

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

由于Lactobacillus屬在4個(gè)地區(qū)泡菜細(xì)菌中占據(jù)絕大部分，因此這里只針對(duì)Lactobacillus屬進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。選擇本研究中Lactobacillus屬的部分代表序列和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知菌株序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果如圖5所示，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中所有菌株被劃分在4個(gè)分支，CD18112100961和CD18112100941與L.coryniformis在同一分支，相似性分別為98%，99%。CD18112100902，CD18112100911，CD18112100963與L.curvatus和L.sakei在一個(gè)分支，其中CD18112100963與L.sakei的相似性為99%，其余2株與L.curvatus相似度分別是96%、98%。CD18071300657、CD18101301379、CD18101301341與L.plantarum和L.pentosus聚為1個(gè)分支，CD18071300657和L.plantarum有97%的相似性，CD18101301379、CD18101301341與L.pentosus的相似性分別為98%，99%。CD18071300538、CD18112 100951、CD18071300677、CD18071300625、CD180713 00620、CD18071300646、CD18112100925和CD180713 00621都與L.brevis在同一分支，其中除了CD181121 00951和CD18071300538與L.brevis的相似性為96%，其他菌株的相似度均在97%～99%。另外，從4個(gè)地區(qū)泡菜中共有的菌種L.brevis來(lái)看出現(xiàn)了很多分支，說(shuō)明來(lái)自不同地區(qū)的同一菌種在進(jìn)化關(guān)系上也出現(xiàn)了差異，這可能是不同地域環(huán)境因素造成的。而來(lái)自同一地區(qū)屬于同一物種的菌株之間在進(jìn)化上也有差別，這可能和同一地區(qū)中不同泡菜樣品的來(lái)源有關(guān)。

圖5 根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜為研究對(duì)象，采用構(gòu)建克隆文庫(kù)的方法，對(duì)克隆子的16S rDNA序列進(jìn)行測(cè)序，在此基礎(chǔ)上研究自然發(fā)酵泡菜液微生物群落組成及其多樣性。盡管利用該技術(shù)不能反映樣品中所有的細(xì)菌類(lèi)群，但該方法可以反映樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群[21]。通過(guò)構(gòu)建16S rDNA基因文庫(kù)，所分析的200個(gè)克隆子分布于Lactobacillus屬，Enterococcus屬，Leuconostoc屬以及Pediococcus屬。其中Lactobacillus屬在數(shù)量上占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，是4個(gè)地區(qū)泡菜共有的主要優(yōu)勢(shì)菌屬，這種現(xiàn)象與多數(shù)研究結(jié)果相似。一般情況下，在泡菜發(fā)酵初期，微厭氧、酸耐受性弱的乳酸菌如Leuconostoc屬的Leu.mesenteroides較多，隨著泡菜的不斷發(fā)酵，乳酸逐漸積累，O2逐漸匱乏，此時(shí)酸耐受性強(qiáng)、嚴(yán)格厭氧的乳酸菌如Lactobacillus屬的L.sakei、L.plantarum等逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)[22]。王秋霞等[23]發(fā)現(xiàn)在泡菜發(fā)酵初期以乳球菌為主，其中Leu.mesenteroides等是主要的微生物類(lèi)型，而在泡菜發(fā)酵中后期，以乳桿菌如L.plantarum、L.brevis和Lactobacilluscasei等為主。XIONG等[24]證實(shí)在泡菜發(fā)酵啟動(dòng)階段Leu.mesenteroidessubsp.先占主導(dǎo)，然后逐步由Lactococcuslactis、Enterococcusfaecalis替換，最后由L.casei和L.plantarum完成發(fā)酵。同時(shí)有研究表明成熟泡菜中優(yōu)良菌株的篩選結(jié)果大多數(shù)來(lái)自于Lactobacillus屬[25-27]，優(yōu)良的理化特性(如耐酸耐膽鹽)不僅使Lactobacillus屬在泡菜菌群中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，而且在泡菜發(fā)酵過(guò)程中起著一定作用，是衡量泡菜發(fā)酵過(guò)程的指標(biāo)。目前，根據(jù)我國(guó)不同傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的細(xì)菌多樣性研究現(xiàn)狀，雖然不同地域具有不同的代表性發(fā)酵蔬菜，但L.brevis、L.plantarum、Leu.mesenteroides等都是發(fā)酵蔬菜中常見(jiàn)的微生物[28-29]。本研究結(jié)果也表明，L.brevis是4個(gè)地區(qū)泡菜樣品中的優(yōu)勢(shì)菌種，同時(shí)在遼寧地區(qū)泡菜中的主要優(yōu)勢(shì)菌群還有L.sakei和L.coryniformis，這些和其他的報(bào)道有一定差別。烏日娜等[30]通過(guò)PCR和PCR-DGGE技術(shù)，對(duì)發(fā)酵進(jìn)程中酸菜的細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在酸菜發(fā)酵前期Leuconostocsp.為優(yōu)勢(shì)菌群, 在發(fā)酵中后期L.plantarum為優(yōu)勢(shì)菌群。張蓓蓓等[31]在180多份泡菜中分離出447株乳酸菌，經(jīng)鑒定分布于11個(gè)屬34個(gè)種，并確定了Leu.mesenteroides、L.brevis、L.plantarum等為主要優(yōu)勢(shì)菌群。并且，本研究中除了Ped.siamensis，其余菌種在以前的研究中都有報(bào)道過(guò)[32-34]。

量化的多樣性指數(shù)可以反映泡菜發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替變化規(guī)律，本研究中多樣性指數(shù)分析說(shuō)明，遼寧和吉林地區(qū)泡菜的細(xì)菌多樣性較豐富，但遼寧泡菜的細(xì)菌多樣性相對(duì)高些，其主要原因是遼寧泡菜所特有的菌群L.coryniformis、Leu.mesenteroides、L.curvatus、Ped.siamensis也占據(jù)了一定的比例，使得遼寧泡菜的細(xì)菌多樣性較高以及呈現(xiàn)出與其他3個(gè)地區(qū)泡菜的差異性。而內(nèi)蒙古和河南地區(qū)泡菜的細(xì)菌群落多樣性相對(duì)較低，原因在于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)單一。4個(gè)地區(qū)泡菜的細(xì)菌群落分布不同，微生物多樣性存在差異，究其原因，泡菜發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的發(fā)酵體系，微生物種類(lèi)繁多，不同的外部因素如氣候、地域、原輔料、發(fā)酵方法等均能夠影響發(fā)酵泡菜的微生物群落結(jié)構(gòu)[35]，從而也導(dǎo)致泡菜的口感、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)的差異。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)方法對(duì)吉林、河南、遼寧、內(nèi)蒙古4個(gè)地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜的細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行研究，從4個(gè)地區(qū)泡菜樣品中隨機(jī)挑取200個(gè)克隆子，經(jīng)16S rDNA基因序列鑒定所得克隆子可分為4個(gè)屬，其中Lactobacillus屬6個(gè)種占據(jù)了絕對(duì)比例，Enterococcus屬均占4個(gè)地區(qū)泡菜細(xì)菌的一定比例，另外在遼寧地區(qū)泡菜中還有Leu.mesenteroides和Ped.siamensis，因此遼寧地區(qū)泡菜的細(xì)菌種類(lèi)數(shù)最多，而河南地區(qū)泡菜的細(xì)菌群落較為單一，但在4個(gè)地區(qū)泡菜中優(yōu)勢(shì)菌種均為L(zhǎng).brevis。多樣性指數(shù)分析表明不同地區(qū)泡菜的菌株種類(lèi)、優(yōu)勢(shì)度、均勻度存在差異，遼寧地區(qū)泡菜的種類(lèi)較豐富，優(yōu)勢(shì)屬突出，且分布均勻，而河南地區(qū)泡菜的多樣性、優(yōu)勢(shì)度和均勻度較低，并且除遼寧地區(qū)泡菜外，其他3個(gè)地區(qū)之間的菌落相似度均較低。由于本研究只構(gòu)建了4個(gè)地區(qū)泡菜的細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)，沒(méi)有研究泡菜液中其他微生物類(lèi)群，因此需要進(jìn)一步探討。本研究通過(guò)比較分析不同地區(qū)泡菜的細(xì)菌多樣性，可為后續(xù)深入研究泡菜發(fā)酵原理、風(fēng)味物質(zhì)的合成機(jī)制提供一定的理論依據(jù)，對(duì)優(yōu)化泡菜發(fā)酵條件和開(kāi)發(fā)利用泡菜微生物資源具有重要的研究意義。