汪雨晨，陶陽(yáng)，李丹丹，韓永斌*，姜小三，姜應(yīng)兵

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)2(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 泰州研究院，江蘇 泰州，225300) 3(南京曉莊學(xué)院 幼兒師范學(xué)院，江蘇 南京， 211171)

超聲波是一種頻率超過(guò)人類聽(tīng)覺(jué)上限(20 kHz)的聲波，常根據(jù)頻率不同分為低頻超聲波和高頻超聲波[1]。低頻超聲波的頻率為20～100 kHz，其中具有高能量的低頻超聲波因能產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切力和機(jī)械力，可破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)，加速傳質(zhì)和化學(xué)反應(yīng)而常用于食品加工領(lǐng)域[2]。

關(guān)于超聲波在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用，最早是利用高強(qiáng)度超聲波對(duì)微生物的致死作用，將其用于非熱殺菌領(lǐng)域，而將超聲波加載于微生物發(fā)酵過(guò)程中的研究開(kāi)展的較晚。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)低頻低強(qiáng)度超聲波可促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。DAI等[3]發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母的生長(zhǎng)遲滯期采用頻率為28 kHz，強(qiáng)度為140 W/L超聲作用1 h，可使釀酒酵母的生物量提升127%。AVHAD等[4]的研究表明，在頻率為25 kHz，強(qiáng)度為160 W，作用時(shí)間為10 min的超聲條件下，芽孢桿菌的纖維蛋白分解酶的產(chǎn)量比未超聲處理組高出1.48倍左右。而低頻低強(qiáng)度超聲波對(duì)微生物發(fā)酵的這一輔助作用，主要?dú)w因于其產(chǎn)生的物理化學(xué)效應(yīng)對(duì)細(xì)胞的損傷較小，可使微生物處于一種“亞致死”狀態(tài)，增強(qiáng)了細(xì)胞膜的通透性，改善了傳質(zhì)，從而提高了發(fā)酵效率[2,5]。

白果是銀杏科銀杏屬銀杏樹(shù)的種子，不僅含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有一些特異性生物活性物質(zhì)，包括銀杏酸、銀杏萜內(nèi)酯以及各種酚類化合物[6]。其中，銀杏萜內(nèi)酯具有很強(qiáng)的藥理活性，對(duì)心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有一定的防治作用[7]。而銀杏酸因具有潛在的免疫毒性、神經(jīng)毒性和細(xì)胞毒性[8]，為白果及其制品的食用安全性帶來(lái)了隱患。

本實(shí)驗(yàn)室前期選用了3種乳酸菌，分別為嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵白果汁，就乳酸菌在白果汁中的發(fā)酵特性展開(kāi)研究。研究表明，3株乳酸菌在白果汁中長(zhǎng)勢(shì)良好，可充分利用基質(zhì)中的糖類產(chǎn)生大量乳酸，并可通過(guò)降解白果汁中的銀杏酸以及富集銀杏內(nèi)酯和酚類物質(zhì)來(lái)提高白果汁的食用安全性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9]。若在乳酸菌發(fā)酵白果汁過(guò)程中輔以低頻低強(qiáng)度超聲處理，或可增強(qiáng)乳酸菌發(fā)酵對(duì)白果汁所產(chǎn)生的積極影響。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，選用了活力較強(qiáng)，代謝較旺盛的植物乳桿菌作為白果汁的發(fā)酵菌株，并以非超聲處理的植物乳桿菌發(fā)酵白果汁作為對(duì)照，研究了低頻低強(qiáng)度超聲波對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過(guò)程中菌體生長(zhǎng)及代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白果(品種：大佛指)，由江蘇省泰州市杏潤(rùn)食品有限公司提供；植物乳桿菌(LactobacillusplantarumBNCC194165)，購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，以凍干粉的形式貯存；MRS液體培養(yǎng)基,上海博微生物科技有限公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基,上海盛思生化科技有限公司；α-淀粉酶(4 000 U/g)、糖化酶(100 000 U/g)、銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品、銀杏萜內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品、酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，上海源葉生物科技有限公司；甲醇(色譜純),美國(guó)天地有限公司；冰乙酸(色譜純),上海麥克林生化科技有限公司；四氫呋喃(色譜純),上海阿拉丁生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

VCX130超聲波細(xì)胞破碎儀,美國(guó)nicolet公司；LDZF-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司；PYX-DHS.500BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；UV5100B，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀,日本日立高新技術(shù)公司；LC-2010A高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白果汁的制備

在ZHANG等[10]方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行一定的修改。去除白果的外殼和內(nèi)種皮，洗凈后與純凈水按照1∶5(g∶mL)打漿。為了提高出汁率和可溶性糖的含量，加入20 U/g α-淀粉酶和30 U/g糖化酶(均以白果的質(zhì)量計(jì))，于60 ℃進(jìn)行液化和糖化處理2 h。酶解完成后，通過(guò)4 000 r/min離心20 min去除不溶物，并采用90 ℃水浴殺菌20 min。待果汁冷卻后，于無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行分裝，每500 mL滅菌的錐形瓶中加入300 mL白果汁。

1.2.2 種子液的制備

將植物乳桿菌凍干粉置于MRS肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行活化復(fù)壯，并將其接種至試管斜面。制備種子液時(shí)，從試管斜面上取1環(huán)，接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)9.0 lg CFU/mL。

1.2.3 低頻低強(qiáng)度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁

將種子液以2%的接種量接種至滅菌白果汁中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。在發(fā)酵第0、4、8、12、24、36、48 h，在超凈臺(tái)內(nèi)將超聲波設(shè)備(20 kHz)的探頭(直徑為10 mm)伸入液面以下1 cm處，超聲處理接種后的白果汁。超聲強(qiáng)度分別為58.9、93.6和 120.8 W/L，超聲時(shí)間為1 min，處理模式為5 s開(kāi)5 s關(guān)。因超聲時(shí)間較短，超聲波熱效應(yīng)對(duì)發(fā)酵液的溫度不產(chǎn)生顯著影響，因此，超聲過(guò)程中未對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行控溫處理。每次超聲之前取樣進(jìn)行相應(yīng)的微生物及理化指標(biāo)的測(cè)定。除微生物指標(biāo)外，其余指標(biāo)均取離心后(10 000 r/min，15 min)的發(fā)酵上清液進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 活菌數(shù)的測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法[11]進(jìn)行測(cè)定。樣品經(jīng)過(guò)生理鹽水梯度稀釋后，根據(jù)其含有的活菌數(shù)，選擇2～3個(gè)連續(xù)的稀釋梯度，每個(gè)稀釋度取0.1 mL樣液置于滅菌培養(yǎng)皿中，倒入MRS瓊脂培養(yǎng)基后搖勻，待培養(yǎng)基冷卻凝固后于37 ℃培養(yǎng)36～48 h。選取菌落數(shù)在30～300 CFU的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果以lg CFU/mL表示。

1.2.5 pH的測(cè)定

利用精密pH計(jì)直接測(cè)定。

1.2.6 有機(jī)酸的測(cè)定

采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法對(duì)樣品中有機(jī)酸的組成和含量進(jìn)行分析。色譜條件參照LIMA等[12]的報(bào)道并稍加修改。色譜柱為Agilent TC-C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為0.08 mmol/L KH2PO4水溶液(pH用H3PO4調(diào)至2.9)；流速0.7 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣體積20 μL。離心上清液過(guò)0.22 μm水系濾膜后直接進(jìn)樣分析。通過(guò)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品獲得保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)發(fā)酵液中有機(jī)酸進(jìn)行定性和定量,結(jié)果以g/L表示。

1.2.7 單體糖的測(cè)定

參照VERVOORT等[13]的方法，通過(guò)高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD)法對(duì)樣品中單體糖的種類及含量進(jìn)行測(cè)定。采用安捷倫1200系列液相色譜儀，外部連接Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。色譜柱為Prevail carbohydrate ES column(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，連接一個(gè)Prevail C18柱(7.5 mm × 4.6 mm，5 μm)作為保護(hù)柱。柱溫30 ℃；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=75∶25；流速1 mL/min；漂移管溫度80 ℃；氮?dú)饬魉?.5 L/min。進(jìn)樣量10 μL。采用標(biāo)準(zhǔn)品獲得保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)發(fā)酵液中單體糖進(jìn)行定性和定量，結(jié)果表示為g/L。

1.2.8 游離氨基酸的測(cè)定

采用全自動(dòng)氨基酸分析儀分析了樣品中游離氨基酸的種類及含量。進(jìn)樣前，將發(fā)酵上清液與4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的磺基水楊酸溶液等比例混合，并在4 ℃靜置1 h，以沉淀樣品中的蛋白和多肽[14]。之后于15 000 r/min離心15 min，上清液過(guò)0.22 μm水系濾膜后進(jìn)樣分析，結(jié)果以mg/L表示。

1.2.9 銀杏酸的測(cè)定

1.2.9.1 銀杏酸的提取純化

在HE等[15]方法的基礎(chǔ)上，采用液液萃取法提取樣品中的銀杏酸。取50 mL樣品通過(guò)減壓真空濃縮法濃縮至5 mL。然后與等體積的甲醇混合，超聲提取(40 kHz，250 W)30 min后，離心收集上清液。上清液中的甲醇通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除后，加入正己烷萃取3次，每次10 mL。合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后采用HPLC進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9.2 銀杏酸的HPLC分析

HPLC條件在田曉清等[16]的基礎(chǔ)上稍作修改。采用Waters XTerra MS-C18柱(150 mm × 4.6 mm, 5 μm)，在310 nm下進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(體積分?jǐn)?shù)為3%冰乙酸)=92∶8；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL。精密稱取銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解于甲醇中，梯度稀釋成不同濃度的溶液并進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。比對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，根據(jù)出峰時(shí)間確定樣品中銀杏酸的種類，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中不同銀杏酸的含量，結(jié)果以mg/L表示。

1.2.10 銀杏萜內(nèi)酯的測(cè)定

1.2.10.1 銀杏萜內(nèi)酯的提取純化

參考DUBBER等[17]的方法，采用液液萃取法提取樣品中的銀杏萜內(nèi)酯。其中甲醇提取部分與銀杏酸甲醇提取步驟一致，待去除上清液中的甲醇后，加入乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL。合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后采用HPLC-ELSD進(jìn)行測(cè)定。

1.2.10.2 銀杏萜內(nèi)酯的HPLC-ELSD分析

色譜條件參照KAUR等[18]并稍作修改。采用Krosmail 100-C18柱 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相為V(水)∶V(甲醇)∶V(四氫呋喃)=65∶25∶10；流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃，蒸發(fā)光檢測(cè)器的漂移管溫度為90 ℃；N2壓力設(shè)置在350 kPa左右；進(jìn)樣體積20 μL。精密稱取銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品溶解于甲醇中，梯度稀釋成不同濃度的溶液并進(jìn)樣分析。以峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，銀杏內(nèi)酯濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。比對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，根據(jù)出峰時(shí)間確定樣品中銀杏內(nèi)酯的種類，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中不同銀杏內(nèi)酯的含量，結(jié)果以mg/L表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖、方差分析、顯著性分析以及聚類分析。均值間比較采用Duncan’s多重比較，顯著性檢驗(yàn)在0.05水平上進(jìn)行(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中pH和活菌數(shù)的變化

由圖1-a可知，3個(gè)超聲處理組的pH變化趨勢(shì)與對(duì)照組基本一致。在發(fā)酵的0～8 h，pH快速下降，且超聲處理組的pH下降速度快于對(duì)照組。之后各組別pH的變化幅度均趨于平穩(wěn)，超聲處理組與對(duì)照組之間pH差異不明顯。發(fā)酵過(guò)程中pH下降的主要因素是乳酸菌利用糖產(chǎn)生了大量的乳酸，在發(fā)酵初期，菌體代謝活力旺盛，超聲波可能會(huì)通過(guò)促進(jìn)植物乳桿菌對(duì)糖的代謝利用來(lái)提高其產(chǎn)酸能力。但當(dāng)pH下降到一定程度時(shí)，植物乳桿菌的產(chǎn)酸能力受到環(huán)境的限制，導(dǎo)致了超聲的作用效果不明顯。WU等[19]通過(guò)超聲波輔助混合菌種發(fā)酵酸奶證實(shí)了超聲對(duì)菌體產(chǎn)酸的促進(jìn)作用，但該作用也僅體現(xiàn)在一定的pH范圍內(nèi)。

由圖1-b可知，接種至白果汁中的植物乳桿菌在0～8 h快速增殖，發(fā)酵12 h后菌種的生長(zhǎng)速率變緩，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，超聲處理組和對(duì)照組之間活菌數(shù)差異不顯著，這可能是因?yàn)閷?duì)數(shù)期菌體生長(zhǎng)旺盛，超聲處理的影響較小[20]。但進(jìn)入穩(wěn)定期之后，超聲處理組的活菌數(shù)顯著高于對(duì)照組。尤其是在發(fā)酵后期，當(dāng)對(duì)照組活菌數(shù)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)時(shí)，超聲處理組的活菌數(shù)仍維持在一個(gè)較高的水平。這一現(xiàn)象可能與超聲波的空化效應(yīng)有關(guān)。由于低頻低強(qiáng)度超聲波可產(chǎn)生穩(wěn)定且較溫和的空化效應(yīng)，對(duì)菌體細(xì)胞造成可修復(fù)的損傷，增加了細(xì)胞膜的通透性，加速細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的傳輸，提高了新陳代謝速率[3]。此外，超聲波可以將微生物在培養(yǎng)過(guò)程中形成的細(xì)胞束松散開(kāi)來(lái)，提高了菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，從而促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)繁殖，提高了微生物的生物量[2]?？傮w上，本實(shí)驗(yàn)所選用的3個(gè)超聲強(qiáng)度對(duì)菌體的生長(zhǎng)均有一定的促進(jìn)作用，但3個(gè)強(qiáng)度之間的差異不顯著。

a-pH變化；b-活菌數(shù)變化圖1 低頻低強(qiáng)度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過(guò)程中pH和活菌數(shù)的變化Fig.1 Changes of pH value and viable cell counts during ginkgo kernel juice fermentation by L. plantarum assisted with low-frequency and low-intensity ultrasound

2.2 發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸和單體糖含量的變化

低頻低強(qiáng)度超聲波處理對(duì)植物乳桿菌代謝有機(jī)酸和單體糖的影響如表1所示。未發(fā)酵白果汁中共鑒定出8種有機(jī)酸，分別為草酸、丙酮酸、奎尼酸、蘋(píng)果酸、莽草酸、檸檬酸、富馬酸和琥珀酸，其中以檸檬酸的含量最高，乳酸在發(fā)酵后產(chǎn)生。單體糖有3種，分別為蔗糖、葡萄糖和果糖，以蔗糖的含量較高。在發(fā)酵過(guò)程中，3種單體糖含量均隨著發(fā)酵的進(jìn)行大幅度降低。其中葡萄糖作為乳酸菌優(yōu)先利用的碳源，在植物乳桿菌接入后便被迅速消耗利用，而超聲處理組中植物乳桿菌對(duì)葡萄糖的利用能力顯著高于對(duì)照組，這可能與超聲提高了植物乳桿菌對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，促進(jìn)了相關(guān)水解酶的產(chǎn)生有關(guān)[19]。由于乳酸菌對(duì)葡萄糖的利用主要涉及糖酵解途徑，作為葡萄糖的轉(zhuǎn)化物，丙酮酸在發(fā)酵前4 h含量逐漸升高，且超聲處理組的丙酮酸的積累量高于對(duì)照組。丙酮酸可通過(guò)糖酵解途徑進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乳酸。由表1可知，超聲處理組的乳酸產(chǎn)量在發(fā)酵的前12 h顯著高于對(duì)照組，特別是發(fā)酵第4 h，58.9、93.6和120.8 W/L超聲處理組的乳酸含量分別比對(duì)照組高21.8%、31.2%和36.2%。但之后幾個(gè)組別的差異不顯著，這與超聲處理對(duì)pH的影響情況基本一致。乳酸一方面可經(jīng)過(guò)糖酵解途徑產(chǎn)生，另一方面可直接由蘋(píng)果酸脫羧生成[21]。所以，蘋(píng)果酸含量在發(fā)酵開(kāi)始后顯著降低，且超聲處理組，特別是93.6和120.8 W/L 2個(gè)超聲組在發(fā)酵前12 h的蘋(píng)果酸消耗速度顯著高于對(duì)照組。除此之外，檸檬酸、琥珀酸和富馬酸等與三羧酸循環(huán)密切相關(guān)的有機(jī)酸，在超聲處理組和對(duì)照組的含量差異也主要體現(xiàn)在發(fā)酵初期，尤其是發(fā)酵的前4 h。這可能是由于發(fā)酵后期乳酸大量積累使得整個(gè)代謝途徑受到抑制，從而削弱了超聲波的刺激作用。

為了更好地比較不同強(qiáng)度的低頻超聲處理下，植物乳桿菌代謝白果汁中有機(jī)酸和糖類的差異特征，以9種有機(jī)酸和3種單體糖的差異信息為基礎(chǔ)，采用組間平均鏈鎖法，按照指標(biāo)間的平方Euclidean距離進(jìn)行聚類分析，聚類分析結(jié)果如圖2所示。樣品基本按照了發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了聚類，說(shuō)明不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)植物乳桿菌對(duì)有機(jī)酸和糖的代謝差異較大，且超聲處理沒(méi)有使植物乳桿菌的糖酸代謝速率發(fā)生較大幅度的提升。但依據(jù)每個(gè)類別內(nèi)對(duì)照組和超聲處理組的位置排布可以發(fā)現(xiàn)，超聲處理組基本位于對(duì)照組的上方，即更接近于下一個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)植物乳桿菌的糖酸代謝狀態(tài)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)選用的超聲條件可在一定程度上促進(jìn)植物乳桿菌對(duì)有機(jī)酸和糖的代謝。

2.3 發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量的變化

低頻低強(qiáng)度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過(guò)程中氨基酸的代謝情況如表2所示。白果汁中共鑒定出了17種氨基酸，大部分氨基酸經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后含量有所下降，且超聲處理組和對(duì)照組在氨基酸代謝方面存在一定的差異。精氨酸作為白果汁中含量最高的氨基酸，在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在其含量快速上升的前12 h，超聲處理組的上升速度顯著高于對(duì)照組，這可能是因?yàn)槌暡ù龠M(jìn)了植物乳桿菌對(duì)蛋白質(zhì)的降解。之后由于乳酸菌可通過(guò)精氨酸脫亞氨基酶途徑對(duì)精氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化從而導(dǎo)致其含量降低[22]，但這個(gè)過(guò)程中超聲的作用效果不顯著。由于植物乳桿菌可產(chǎn)生谷氨酸脫羧酶將谷氨酸轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸[23]，所以谷氨酸的含量在發(fā)酵24 h內(nèi)顯著降低。其中超聲處理組尤其是93.6、120.8 W/L 2個(gè)超聲處理組中谷氨酸的下降幅度分別是對(duì)照組的1.12、1.17倍。這說(shuō)明超聲可刺激植物乳桿菌產(chǎn)生更多的谷氨酸脫羧酶來(lái)加快反應(yīng)的進(jìn)行。超聲的這一作用機(jī)制也體現(xiàn)在天冬氨酸以及蘇氨酸的代謝上。由于天冬氨酸可在乳酸菌產(chǎn)生的氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為二乙酰、乙偶姻和1，3-丁二醇等風(fēng)味物質(zhì)[24]，而蘇氨酸則可在蘇氨酸醛縮酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙醛，然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇[25]，故兩者的含量均呈下降趨勢(shì)。3個(gè)超聲處理組中天冬氨酸和蘇氨酸的降幅均高于對(duì)照組，說(shuō)明超聲可促進(jìn)植物乳桿菌對(duì)天冬氨酸以及蘇氨酸的轉(zhuǎn)化。甘氨酸作為蘇氨酸轉(zhuǎn)化途徑的中間產(chǎn)物之一，其含量在發(fā)酵24 h后有所增加，且超聲處理組中甘氨酸的含量高于對(duì)照組，尤其是58.9 W/L超聲處理組中甘氨酸含量比對(duì)照組高11.36%，這也進(jìn)一步證實(shí)了超聲對(duì)蘇氨酸轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用。其他氨基酸，如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸以及半胱氨酸，都可以在乳酸菌產(chǎn)生的特異性氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的揮發(fā)性風(fēng)味成分[24]，而超聲處理對(duì)這些氨基酸的代謝具有一定的促進(jìn)作用，但在不同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，作用效果存在一定的差異。

表1 低頻低強(qiáng)度超聲波處理對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過(guò)程中有機(jī)酸及單體糖含量的影響 單位：g/L

圖2 低頻低強(qiáng)度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過(guò)程中有機(jī)酸和糖含量變化的聚類分析Fig.2 Clustering analysis of changes of organic acids and sugars content during ginkgo kernel juice fermentation by L. plantarum assisted with low-frequency and low- intensity ultrasound

通過(guò)聚類分析可以更好地呈現(xiàn)不同強(qiáng)度的低頻超聲處理對(duì)植物乳桿菌代謝氨基酸的影響，聚類分析結(jié)果如圖3所示。所有的樣品并未嚴(yán)格按照發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行聚類。在發(fā)酵第4 h，對(duì)照組與未發(fā)酵樣品聚為一類，而其他3個(gè)超聲組聚為一類，說(shuō)明在發(fā)酵初期，低頻低強(qiáng)度超聲處理可顯著加快植物乳桿菌對(duì)白果汁中氨基酸的代謝。由于發(fā)酵12 h之后氨基酸含量整體的變化趨勢(shì)放緩，不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)樣品之間的類間距離縮小，只在類間距離小于5時(shí)出現(xiàn)了聚類差異。在發(fā)酵第12 h和24 h，對(duì)照組和超聲組雖然聚為一類，但超聲組均比對(duì)照組更接近下一個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的氨基酸代謝狀態(tài)，即超聲仍可在一定程度上促進(jìn)植物乳桿菌對(duì)氨基酸的代謝。發(fā)酵第48 h，對(duì)照組和120.8 W/L的超聲組聚為一類，58.9 W/L的超聲組與發(fā)酵12 h的樣品聚為一類，而93.6 W/L的超聲組單獨(dú)聚為一類，說(shuō)明在發(fā)酵后期，超聲整體的作用規(guī)律不明顯。

表2 低頻低強(qiáng)度超聲波處理對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過(guò)程中氨基酸含量的影響 單位：mg/L

續(xù)表2

圖3 低頻低強(qiáng)度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過(guò)程中游離氨基酸含量變化的聚類分析Fig.3 Clustering analysis of changes of free amino acids content during ginkgo kernel juice fermentation by L. plantarum assisted with low-frequency and low-intensity ultrasound

2.4 發(fā)酵過(guò)程中銀杏酸含量的變化

由圖4可知，白果汁中鑒定出了4種銀杏酸，分別為銀杏酸C15∶1、C17∶2、C15∶0、C17∶1，以銀杏酸C15∶1的含量最高。白果汁中的4種銀杏酸含量在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中均顯著降低，其中，超聲處理組與對(duì)照組中銀杏酸含量在發(fā)酵初期差異不顯著。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，尤其是12 h之后，超聲處理組中的銀杏酸含量開(kāi)始低于對(duì)照組。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)照組中4種銀杏酸的總量由發(fā)酵前的(2.71±0.19) mg/L降低至發(fā)酵后(0.89±0.08)mg/L，降解率為67.13%左右，而58.9、93.6、120.8 W/L的超聲處理組在發(fā)酵結(jié)束后，4種銀杏酸總量分別為(0.81±0.05)、(0.82±0.04)、(0.76±0.06)mg/L，降解率分別為70.09%、69.79%、72.12%左右。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果分析，銀杏酸的降解可能與菌體分泌的某種酶有關(guān)[9]。而低頻低強(qiáng)度超聲波在提高微生物產(chǎn)酶率，增強(qiáng)酶活性等方面早有報(bào)道[5]。NGUYEN等[26]采用20 kHz，強(qiáng)度為100 W的超聲輔助雙歧桿菌發(fā)酵牛奶，發(fā)現(xiàn)超聲波可以刺激雙歧桿菌胞內(nèi)乳糖酶的分泌。所以，超聲處理組中銀杏酸的降解率高于對(duì)照組，可能與低頻低強(qiáng)度超聲刺激了植物乳桿菌產(chǎn)生銀杏酸降解酶的機(jī)制有關(guān)。

a-銀杏酸C15∶1；b-銀杏酸C17∶2；c-銀杏酸C15∶0；d-銀杏酸C17∶1圖4 低頻低強(qiáng)度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過(guò)程中4種銀杏酸含量的變化Fig.4 Changes of four ginkgolic acids content during ginkgo kernel juice fermentation by L. plantarum assisted with low-frequency and low-intensity ultrasound

2.5 發(fā)酵過(guò)程中銀杏萜內(nèi)酯含量的變化

由圖5可知，在未發(fā)酵的白果汁中共鑒定出3種銀杏萜內(nèi)酯，分別為銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C，以銀杏內(nèi)酯B的含量最高。白果汁中3種銀杏內(nèi)酯的含量均隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸升高，且對(duì)照組和超聲處理組的變化趨勢(shì)一致。在對(duì)銀杏內(nèi)酯A的富集方面，超聲處理組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。但在發(fā)酵后期，超聲處理組，尤其是93.6、120.8 W/L 2個(gè)超聲處理組顯示出了對(duì)銀杏內(nèi)酯B以及銀杏內(nèi)酯C的富集優(yōu)勢(shì)。到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，對(duì)照組中銀杏內(nèi)酯B的含量比發(fā)酵前提高了16.7%左右，而58.9、93.6、120.8 W/L 3個(gè)超聲處理組分別將銀杏內(nèi)酯B含量提高了20.03%、23.93%、22.89%左右。對(duì)于銀杏內(nèi)酯C，對(duì)照組將其含量提高了15.03%左右，而58.9、93.6、120.8 W/L 3個(gè)超聲處理組則將其含量分別提高了18.27%、25.98%、22.61%。雖然乳酸菌對(duì)銀杏內(nèi)酯的合成機(jī)理尚不明晰，但根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前的結(jié)果分析，銀杏萜內(nèi)酯的合成與丙酮酸，乙酰輔酶A等物質(zhì)有關(guān)[27]，而這些物質(zhì)作為植物乳桿菌糖酸代謝的中間產(chǎn)物，其含量在超聲波的作用下有所增加，可能在一定程度上促進(jìn)了銀杏萜內(nèi)酯的合成。

a-銀杏酸內(nèi)酯A；b-銀杏酸內(nèi)酯B；c-銀杏酸內(nèi)酯C圖5 低頻低強(qiáng)度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過(guò)程中3種銀杏內(nèi)酯含量的變化Fig.5 Changes of three ginkgolides content during ginkgo kernel juice fermentation by L. plantarum assisted with low-frequency and low-intensity ultrasound

3 結(jié)論

研究選取的3個(gè)低強(qiáng)度的低頻超聲波均可促進(jìn)植物乳桿菌在白果汁中生長(zhǎng)，顯著提高了生長(zhǎng)穩(wěn)定期活菌數(shù)，延緩其進(jìn)入衰亡期的時(shí)間。在發(fā)酵初期，低頻低強(qiáng)度超聲處理可加快乳酸菌的代謝，促進(jìn)植物乳桿菌對(duì)糖類的消耗，從而提高乳酸的產(chǎn)量。但當(dāng)乳酸達(dá)到一定濃度時(shí)，超聲作用被削弱。同時(shí)，低頻低強(qiáng)度超聲處理可在發(fā)酵前12 h顯著加快植物乳桿菌對(duì)氨基酸的代謝進(jìn)程。此外，低頻低強(qiáng)度超聲波有助于提升植物乳桿菌對(duì)銀杏酸的降解以及對(duì)銀杏內(nèi)酯的富集能力。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，58.9、98.6、120.8 W/L的超聲處理組中，銀杏酸的總含量分別比對(duì)照組低9.01%、8.10%、15.18%，銀杏內(nèi)酯的總含量分別比對(duì)照組高0.10%、4.01%、2.67%。

通過(guò)研究結(jié)果可以看出，低頻低強(qiáng)度超聲波對(duì)植物乳桿菌代謝白果汁中的營(yíng)養(yǎng)和生物活性成分具有一定的積極作用，為低頻低強(qiáng)度超聲波在提高微生物發(fā)酵效率方面的運(yùn)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。此外，本研究所選取的3個(gè)強(qiáng)度的超聲波對(duì)發(fā)酵均未產(chǎn)生負(fù)面影響，這說(shuō)明該強(qiáng)度均在菌體的可接受范圍內(nèi)。但3個(gè)超聲強(qiáng)度之間的作用效果差異不顯著，更適宜的超聲作用條件有待進(jìn)一步的探索。