王曉元 趙軼峰 楊永江 黃 迪 蘇卓彬 李 坤 李晶晶 李曙光#

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科1(075000) 病理科2

背景：微小RNA (miRNA)是一種新的癌癥治療相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，研究表明miR-760在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用。目的：探討miR-760對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、周期、遷移和侵襲的調(diào)控作用及其機(jī)制。方法：采用qRT-PCR法檢測結(jié)腸癌組織以及結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、SW480和SW620中miR-760表達(dá)。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-760與STIM1的靶向關(guān)系。以蛋白質(zhì)印跡法、免疫組化染色分別檢測結(jié)腸癌細(xì)胞和組織中STIM1蛋白表達(dá)，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移、侵襲。構(gòu)建結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型并觀察miR-760對腫瘤生長的影響。結(jié)果：MiR-760在結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)均明顯降低，而STIM1在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)。MiR-760通過與STIM1的3’-UTR互補(bǔ)結(jié)合抑制其表達(dá)。過表達(dá)miR-760能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，阻滯S期，抑制細(xì)胞遷移和侵襲，但上調(diào)STIM1能逆轉(zhuǎn)這種抑制效果。在結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型中，過表達(dá)miR-760能下調(diào)STIM1表達(dá)并抑制腫瘤生長。結(jié)論：MiR-760通過靶向STIM1參與對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控，在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌的作用。

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是世界上第三大最常見的癌癥以及第二大癌癥相關(guān)死亡原因，據(jù)報(bào)道，2018年CRC新增病例約180萬例，死亡86萬例[1]。但目前CRC的發(fā)病機(jī)制及其生物學(xué)標(biāo)志物仍未完全明確。

基質(zhì)交互分子1 (stromal interaction molecule 1, STIM1)是一種新發(fā)現(xiàn)的Ⅰ跨膜蛋白，主要表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。作為鈣離子的感受器，STIM1可迅速捕獲細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+水平變化，并將這種信息傳遞至細(xì)胞膜上的SOCs，與Orai1結(jié)合，從而啟動鈣離子依賴性信號通道。STIM1通過調(diào)控依賴性鈣離子通道參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移等過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，STIM1在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種癌癥組織中異常表達(dá)[2]。

微小RNA(miRNA)是一類由20個(gè)左右核苷酸組成的特殊小分子非編碼RNA，能與靶基因的mRNA 3’-UTR區(qū)域結(jié)合，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程[3]，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。已有多項(xiàng)研究證實(shí)多種miRNA在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用，但miR-760在結(jié)腸癌中的作用尚不明確。本研究通過觀察miR-760和STIM1對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、S期阻滯、細(xì)胞遷移、侵襲等的調(diào)控作用，旨在探討miR-760在結(jié)腸癌中的作用及其機(jī)制，從而為結(jié)腸癌的診斷和治療提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

一、標(biāo)本來源、細(xì)胞株和主要試劑

收集2017年5月—2018年12月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院96例結(jié)腸癌患者手術(shù)腫瘤標(biāo)本及其癌旁正常組織，診斷由病理學(xué)檢查明確。其中男性56例，女性40例，年齡35～78歲，平均58.6歲。所有患者術(shù)前均未接受過化療，標(biāo)本取材后冷凍保存。抽取外周靜脈血5 mL，抗凝，-80 ℃保存待用。本研究方案通過河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，患者或患者家屬均知情同意。

人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、SW480和SW620購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；miR-760模擬物(mimics)、陰性對照(miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Green熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；STIM1、GAPDH抗體、免疫組化試劑、Ki-67抗體購自Abcam公司；CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)公司；Transwell小室購自美國Corning公司；24只BALB/c裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，鼠齡4～5周，體質(zhì)量15～17 g，自由飲水、進(jìn)食。

二、研究方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：體外培養(yǎng)人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、SW480和SW620，置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞鋪于6孔板，稀釋濃度約為5×105個(gè)/孔，待細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

2. 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：利用TargetScan (http://www.targetscan.org)預(yù)測STIM1的3’-UTR可能存在與miR-760互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)。將STIM1基因的3’-UTR序列及其突變體插入螢光素酶報(bào)告基因，從而構(gòu)建野生型基因質(zhì)粒pMIR-STIM1-WT和突變型基因質(zhì)粒pMIR-STIM1-Mut，然后分別與miR-NC或miR-760 mimics共轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，檢測螢光素酶活性。

3. qRT-PCR法：使用Trizol從細(xì)胞株或組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按試劑盒說明書行PCR反應(yīng)。MiR-760引物上游：5’-TGC TTA AGA ATA CGC GTA G-3’，下游：5’-AAC TCC AGC AGG ACC ATG TGA T-3’；內(nèi)參U6引物上游：5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’；STIM1引物上游：5’-AGT CAC AGT GAG AAG GCG AC-3’，下游：5’-CAA TTC GGC AAA ACT CTG CTG-3’；內(nèi)參GAPDH引物上游：5’-AAT GGG CAG CCG TTA GGA AA-3’，下游：5’-GCG CCC AAT ACG ACC AAA TC’-3’。引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

4. 蛋白質(zhì)印跡法：提取各組總蛋白，BCA法定量蛋白濃度。取50 μg蛋白行12% SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入STIM1一抗(1∶500)和內(nèi)參GAPDH抗體(1∶1 000)。4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌。ECL顯影并保存圖像。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析。

5. 免疫組化染色：組織切片常規(guī)石蠟包埋，梯度乙醇脫蠟、水化，加入3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，修復(fù)抗原，封片，室溫孵育15 min。滴加STIM1抗體(稀釋濃度1∶100)或Ki-67抗體(稀釋濃度1∶100)，4 ℃孵育過夜。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋濃度1∶200)。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片，采用正置顯微鏡觀察切片。細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，計(jì)算目的蛋白表達(dá)情況。

6. CCK-8實(shí)驗(yàn)：將SW620細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育 1～2 h后，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度值(A值)。

7. 流式細(xì)胞術(shù)：取對數(shù)生長期SW620細(xì)胞，應(yīng)用預(yù)冷的PBS溶液重懸細(xì)胞，離心，洗滌，加入RNA酶5 μL(10 mg/mL)，加入50 μL PI(1 mg/mL)4 ℃下避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期情況。

8. Transwell細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)：將SW620細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，接種于Transwell小室的上室(100 μL/孔)。下室(即24孔板底部)加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基；放入 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS洗滌3次，固定，行0.5%的結(jié)晶紫染色，PBS漂洗。應(yīng)用棉簽輕輕拭去小室濾膜上層細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移數(shù)。

4 ℃下將Matrigel凝膠過夜融化，并以無血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。取50 μL Matrigel稀釋液滴加到上室，包被濾膜，晾干，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。其余實(shí)驗(yàn)步驟和方法與上述細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同。

9. 構(gòu)建結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型：將24只裸鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為miR-NC組(n=12)和miR-760 mimics組(n=12)。將轉(zhuǎn)染后的SW620細(xì)胞稀釋成約1×1010/mL單細(xì)胞懸液，在裸鼠左前上肢腋下處皮下接種0.2 mL的細(xì)胞懸液，隨后每3 d應(yīng)用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最大徑(a)和最小徑(b)，并計(jì)算腫瘤體積(V)，V(mm3)=1/2×a×b2。3周后采用頸椎脫臼法處死裸鼠，分離腫瘤并稱重。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、MiR-760表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

不同年齡、組織分化程度的結(jié)腸癌患者miR-760表達(dá)率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同TNM分期的結(jié)腸癌患者miR-760表達(dá)率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；表1)。

表1 miR-760表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析n(%)

二、MiR-760在結(jié)腸癌中的作用

qRT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中miR-760表達(dá)顯著低于癌旁正常組織(圖1A)，結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、SW480和SW620中miR-760表達(dá)顯著低于人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC(圖1B)。因SW620細(xì)胞中miR-760表達(dá)相對較低，故選取該細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-760 mimics后接種于裸鼠皮下，結(jié)果顯示miR-760 mimics組腫瘤組織中miR-760表達(dá)明顯升高(圖1C)，而腫瘤體積和重量均明顯降低(圖1D-1E)。免疫組化染色結(jié)果顯示，miR-760 mimics組Ki-67表達(dá)顯著降低(圖1F)。上述結(jié)果表明miR-760在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌的作用。

三、MiR-760對STIM1的靶向調(diào)控

TargetScan預(yù)測結(jié)果顯示，STIM1的3’-UTR可能存在與miR-760形成互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)(圖2A)。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與pMIR-STIM1-WT+miR-NC組相比，pMIR-STIM1-WT+miR-760組螢光素酶活性明顯降低；而共轉(zhuǎn)染miR-760 mimics+pMIR-STIM1-Mut的螢光素酶活性與共轉(zhuǎn)染pMIR-STIM1-Mut+miR-NC相比無明顯變化(圖2B)。qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，miR-760 mimics組STIM1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于miR-NC組(圖2C-2D)。由此可見，miR-760可通過與STIM1的3’-UTR互補(bǔ)結(jié)合抑制STIM1表達(dá)。

四、STIM1在結(jié)腸癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中STIM1 mRNA表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(圖 3A)。與FHC細(xì)胞相比，結(jié)腸癌HCT116、HT29、SW480和SW620細(xì)胞中STIM1 mRNA表達(dá)均明顯升高(圖3B)。因SW620細(xì)胞中STIM1 mRNA表達(dá)相對較高，故選取該細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。免疫組化染色和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中STIM1蛋白表達(dá)明顯升高(圖3C-3D)。

五、MiR-760和STIM1對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、周期、遷移和侵襲的影響

CCK-8法結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-760 mimics細(xì)胞的增殖能力明顯低于miR-NC組，但共轉(zhuǎn)染miR-760 mimics和STIM1后，細(xì)胞增殖能力較單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-760明顯增強(qiáng)(圖4A)。流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-760 mimics后，S期細(xì)胞比例顯著低于miR-NC組，但過表達(dá)STIM1能逆轉(zhuǎn)miR-760 mimics的調(diào)控效果(圖4B)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-760 mimics能抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，而STIM1能逆轉(zhuǎn)這種抑制效果(圖4C)。提示miR-760可能通過抑制STIM1調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

*P<0.05，**P<0.01A：qRT-PCR法檢測miR-760在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)；B：qRT-PCR法檢測miR-760在結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、SW480和SW620以及人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC中的表達(dá)；C：qRT-PCR法檢測裸鼠腫瘤組織中miR-760表達(dá)；D：腫瘤體積；E：腫瘤重量；F：免疫組化染色檢測Ki-67表達(dá)(×400)圖1 miR-760在結(jié)腸癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)以及在結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型中的作用

*P<0.05，**P<0.01A：TargetScan檢測顯示STIM1的3’-UTR可能存在與miR-760形成互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)；B：雙螢光素酶活性變化；C：STIM1 mRNA表達(dá)(qRT-PCR法)；D：STIM1蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)圖2 miR-760對STIM1的靶向調(diào)控

*P<0.05，**P<0.01A：qRT-PCR法檢測結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中STIM1 mRNA表達(dá)；B：qRT-PCR法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞中STIM1 mRNA表達(dá)；C：免疫組化染色檢測STIM1蛋白表達(dá)(×400)；D：蛋白質(zhì)印跡法檢測STIM1蛋白表達(dá)圖3 STIM1在結(jié)腸癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)

六、結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型中miR-760對STIM1的調(diào)控

裸鼠移植瘤模型中，miR-760 mimics組STIM1表達(dá)明顯低于miR-NC組(圖5)。表明miR-760在結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型中可負(fù)性調(diào)控STIM1表達(dá)，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

討 論

MiRNA通過結(jié)合靶基因的mRNA 3’-UTR區(qū)域，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。越來越多的研究表明，miRNA異常表達(dá)可引起腫瘤相關(guān)基因的激活或失活，通過調(diào)控細(xì)胞分化、凋亡、增殖促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移[3,5-8]。近年多項(xiàng)研究表明，miR-654、miR-376[9]、miR-21[10]和miR-766[11]表達(dá)異常與結(jié)腸癌密切相關(guān)，可通過增強(qiáng)或抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)或抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、生長和轉(zhuǎn)移。有研究[12]表明，miR-760表達(dá)下調(diào)與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后和惡性臨床病理特征有關(guān)，miR-760可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

本研究中，miR-760在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組，且結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、SW480和SW620中的表達(dá)亦明顯低于人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC。提示miR-760表達(dá)異常可能與結(jié)腸癌的發(fā)生相關(guān)。MiR-760表達(dá)率隨淋巴結(jié)受累數(shù)目、TNM分期的增高而降低，提示miR-760表達(dá)與結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。

*P<0.05A：細(xì)胞增殖能力(CCK-8法)；B：S期細(xì)胞比例(流式細(xì)胞術(shù))；C：細(xì)胞遷移和侵襲能力(Transwell法)圖4 miR-760和STIM1對SW620細(xì)胞增殖、周期、遷移和侵襲的影響

**P<0.01A：免疫組化染色(×400)；B：蛋白質(zhì)印跡法圖5 結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型中miR-760對STIM1表達(dá)的調(diào)控

螢光素和螢光素酶可極其靈敏、高效地檢測基因表達(dá)，是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種方法。本研究通過TargetScan預(yù)測miR-760在STIM1的3’-UTR具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)，然后進(jìn)一步驗(yàn)證miR-760能通過結(jié)合STIM1的3’-UTR抑制其mRNA和蛋白表達(dá)，表明STIM1是miR-760的靶基因。

STIM1通過調(diào)控依賴性鈣離子通道參與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，抑制STIM1表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[13]。本研究中，免疫組化染色和qRT-PCR法檢測結(jié)果均顯示，結(jié)腸癌組織中STIM1表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且多種結(jié)腸癌細(xì)胞中STIM1表達(dá)較FHC細(xì)胞明顯升高。提示STIM1可能與結(jié)腸癌的發(fā)展密切相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-760 mimics能明顯抑制SW620細(xì)胞增殖，阻滯S期，抑制細(xì)胞遷移和侵襲，但過表達(dá)STIM1能逆轉(zhuǎn)這種抑制效應(yīng)。說明miR-760可能通過負(fù)性調(diào)控其靶基因STIM1來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的多種生物學(xué)行為。為進(jìn)一步研究miR-760在結(jié)腸癌中的作用，本研究構(gòu)建了結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型。結(jié)果顯示過表達(dá)miR-760能明顯下調(diào)裸鼠腫瘤組織中STIM1表達(dá)，并抑制結(jié)腸癌腫瘤生長。表明miR-760具有抑制結(jié)腸癌的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-760異常表達(dá)，miR-760可通過靶向調(diào)控STIM1來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，阻滯S期，抑制細(xì)胞遷移和侵襲，表明miR-760在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑制腫瘤的作用。