王維法,季圓清,洪 翔,范曉光,

(1.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司 博士后科研工作站,河南 項(xiàng)城 466200;2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津 300457)

丙谷二肽是由L-丙氨酸(Ala)和L-谷氨酰胺(Gln)縮合形成的二肽,屬于氨基酸類的化學(xué)藥劑,由德國費(fèi)森尤斯(Fresenius AG)于1995年研發(fā)成功,首先在德國批準(zhǔn)上市,1999年作為進(jìn)口藥物進(jìn)入中國市場。2005年,日本科學(xué)家Tabata[3]試圖尋找一種能夠連接L-氨基酸形成二肽的酶?；诩?xì)菌中D-丙氨酰-D-丙氨酸連接酶的氨基酸序列和結(jié)構(gòu),通過計(jì)算機(jī)模擬最終從枯草芽孢桿菌BacillussubtilisATCC 15245中發(fā)現(xiàn)了一種L-氨基酸連接酶YwfE。它是一種ATP依賴酶,能夠以無保護(hù)的氨基酸為底物合成二肽。L-氨基酸連接酶具有廣譜性,能以不同氨基酸為底物,合成的二肽類型多達(dá)44種。在前期的研究中[4],筆者利用大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE 3)克隆并表達(dá)來源于枯草芽孢桿菌B.subtilisATCC 15245的YwfE,采用Ni-NAT親和層析法分離純化后,以等濃度(30 mmol/L)的L-丙氨酸、L-谷氨酰胺和腺苷三磷酸(ATP)為底物催化合成22.4 mmol/L的丙谷二肽。

ATP是生命系統(tǒng)中一種必需的分子,是許多過程中必不可少的供能物質(zhì)[5-6]。自然界中很多酶都屬于ATP依賴型酶,需要ATP作為輔助因子才能起到催化作用。生物體通過自身代謝形成ATP再生系統(tǒng),支持著這些酶的持續(xù)作用。當(dāng)這些酶被用于體外酶催化時,ATP的供應(yīng)便成為了一個重要的問題。直接使用ATP不但價格非常昂貴,而且過程中形成的腺苷二磷酸(ADP)或腺苷一磷酸(AMP)會對ATP的形成產(chǎn)生抑制作用。構(gòu)造一個高效的ATP再生系統(tǒng)即成為這一類酶反應(yīng)的重點(diǎn)研究方向[7-8]。目前,體外用于ATP再生的酶主要為磷酸轉(zhuǎn)移酶[9-10],通常這類酶的作用是將ATP或其他核苷酸上的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體分子。該過程的逆反應(yīng)常被用于將ADP復(fù)磷酸化為ATP。磷酸轉(zhuǎn)移酶是否適用于ATP再生系統(tǒng)的主要取決于成本和穩(wěn)定性。乙酸激酶(Acetate kinase,Ack)屬于一種磷酸轉(zhuǎn)移酶,能夠利用乙酰磷酸(ACP)將ADP磷酸化合成ATP,且該反應(yīng)為可逆反應(yīng)[11]。在糖酵解反應(yīng)中,乙酸激酶和乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶共同作用可以催化乙酸合成乙酰輔酶A,而乙酰輔酶A作為生物體內(nèi)糖、脂肪和蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)的物質(zhì)代謝和能量代謝的樞紐,可以通過氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)這兩條代謝途徑互相轉(zhuǎn)化[12-13]。此外,丙酮酸的代謝循環(huán),厭氧菌的醋酸代謝,磷酸化反應(yīng)及相關(guān)生化反應(yīng)的調(diào)控等都需要乙酸激酶的參與,因此乙酸激酶在生物體涉及眾多反應(yīng)發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[14-16]。由于ACP價格低廉,Ack在ATP再生反應(yīng)中有著巨大的潛力。研究中,筆者在YwfE催化的丙谷二肽合成反應(yīng)中引入不同微生物來源的Ack,用于減少反應(yīng)中ATP的消耗,并對偶聯(lián)催化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliDH5α、大腸桿菌E.coliBL21(DE 3)以及質(zhì)粒pET-his(Ampr)均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7～7.2,121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶和ExTaq DNA聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;PCR產(chǎn)物回收及質(zhì)粒提取試劑盒購于北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司;L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、丙谷二肽標(biāo)品和ATP均購于美國Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 YwfE的異源表達(dá)和純化

YwfE的異源表達(dá)和純化方法見文獻(xiàn)[4]。

1.3 不同微生物來源Ack的異源表達(dá)和純化

根據(jù)Genbank上E.coliMG1655，LactobacillusbulgaricusATCC11842和ClostridiumacetobutylicumATCC824的乙酸激酶編碼基因,將其分別命名為ack1,ack2,ack3。采用Primer Premier 5.0軟件分析并設(shè)計(jì)引物,各引物序列如表1所示。

表1 ack基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers in the experiment of ack amplification

采用細(xì)菌基因組試劑盒提取細(xì)菌基因組,利用引物以及ExTaq PCR試劑盒擴(kuò)增乙酸激酶編碼基因。目的產(chǎn)物回收后經(jīng)HindⅢ和BamH Ⅰ酶切、電泳和切膠回收后連接至經(jīng)相同酶切的表達(dá)載體pET-his并化學(xué)轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài),于LB培養(yǎng)基活化后涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基,過夜培養(yǎng)后,挑取單菌落利用引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,陽性菌株接入含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基,經(jīng)37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒化學(xué)轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)于SOC中活化后涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上,于37 ℃倒置培養(yǎng)12 h。挑取單菌落活化后提取其質(zhì)粒并分別利用引物進(jìn)行酶切驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的重組菌株以0.1%(質(zhì)量比)接種量接種至100 mL含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基,于37 ℃,200 r/min培養(yǎng)12 h,再按1%(質(zhì)量比)接種量轉(zhuǎn)接400 mL含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基,于37 ℃,200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.7時添加終濃度為0.1 mmol/L IPTG,28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h。培養(yǎng)結(jié)束后,7 000 r/min離心10 min去上清,生理鹽水洗滌菌體2次,于-80 ℃凍存。

將2 g濕菌體加入50 mL裂解緩沖液重懸均勻后,使用高壓勻漿細(xì)胞破碎儀(上海永聯(lián)生物)破碎細(xì)胞,6 ℃,80 MPa,破碎5 min,細(xì)胞破碎液經(jīng)13 000 r/min離心20 min后取上清液,于4 ℃保存。將Ni+-NTA樹脂加入至層析柱中,再使用20 mL Lysis Buffer平衡沖洗樹脂。將25 mL細(xì)胞破碎液上清與樹脂混合均勻,使用磁力攪拌器4 ℃攪拌吸附30 min。將攪拌吸附后的樹脂混合物重新泵入層析柱中,流速控制在0.5 mL/min,之后用20 mL Wash Buffer進(jìn)行洗脫,洗去雜蛋白,再使用15 mL Elution Buffer進(jìn)行洗脫,洗脫出目的蛋白。將洗脫的目的蛋白進(jìn)行收集,使用GE的脫鹽柱進(jìn)行脫鹽處理,將脫鹽后的目的蛋白按20%的比例加入甘油,并進(jìn)行分裝,于-20 ℃保存。將細(xì)胞破碎液及純化收集流分采用SDS-PAGE分析目的蛋白。

1.4 酶催化反應(yīng)體系

10 mL最優(yōu)的催化反應(yīng)體系如下:Ala 30 mmol/L,Gln 30 mmol/L,MgSO450 mmol/L,ATP 5 mmol/L,ACP-Li 60 mmol/L,Tris-HCl 50 mmol/L(pH 9),純化的YwfE蛋白200 mg/L,純化的Ack蛋白80 mg/L。

1.5 丙谷二肽的檢測

采用氨基酸分析儀檢測反應(yīng)液中丙谷二肽的含量,其保留時間為24.2 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同來源乙酸激酶的異源表達(dá)與純化

分別以E.coliMG1655,BulgaricusATCC11842和ClostridiumacetobutylicumATCC824基因組為模板,使用表1中的引物ack1-S/ack1-A,ack2-S/ack2-A和ack3-S/ack3-A分別擴(kuò)增乙酸激酶編碼基因ack1(1 203 bp),ack2(1 188 bp)和ack3(1 206 bp)。將載體pET-His和ack1片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ/HindⅢ雙酶切,將載體pET-His和ack2,ack3片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ雙酶切,然后將具有相同黏性末端的載體與目的基因分別連接轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài),涂布于氨芐青霉素抗性平板,37 ℃培養(yǎng)12～14 h。后將平板上長出的單菌落分別進(jìn)行菌落PCR,將初步驗(yàn)證為陽性的單菌落轉(zhuǎn)接搖管,放大培養(yǎng)后提取其質(zhì)粒,質(zhì)粒PCR和酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。

M—Marker;1,5,8—目的基因;2,9—pET-His單酶切;3,6,10—重組質(zhì)粒單酶切;4,7,11—重組質(zhì)粒雙酶切。圖1 重組質(zhì)粒pET-His-ack1,pET-His-ack2 和pET-His-ack3的酶切驗(yàn)證圖譜Fig.1 Identification of recombinant plasmids pET-His-ack1, pET-His-ack2 and pET-His-ack3 digested by restricted endonuclease

由圖1可知:重組質(zhì)粒pET-His-ack1,pET-His-ack2和pET-His-ack3經(jīng)BamH Ⅰ單酶切后均在4 100 bp處出現(xiàn)預(yù)期大小條帶;經(jīng)BamH Ⅰ/HindⅢ或BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ雙酶切,分別獲得與空質(zhì)粒pET-His大小相符(2 900 bp)大片段和與目的基因大小相符(1 200 bp)的小片段;而以質(zhì)粒pET-His為模板的陰性對照未擴(kuò)增出任何目的基因條帶。結(jié)果表明:經(jīng)PCR所獲得的目的基因已成功連接至pET-His中,將上述重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)中,獲得重組菌分別命名為E.colipET-His-ack1,E.colipET-His-ack2和E.colipET-His-ack3。

對重組菌和空白對照進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),當(dāng)菌體濃度達(dá)到OD600為0.6～0.8時,添加終濃度0.01 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG,于28 ℃,200 r/min誘導(dǎo)6 h后,收集產(chǎn)酶細(xì)胞,按照1.3節(jié)中的方法對酶進(jìn)行分離純化,結(jié)果如圖2所示。

M—蛋白Marker;1—空白對照E.coli pET-His細(xì)胞破碎后上清液;2—重組菌E.coli pET-His-ack1細(xì)胞破碎后上清液;3—重組菌E.coli pET-His-ack2細(xì)胞破碎后上清液;4—重組菌E.coli pET-His-ack3細(xì)胞破碎后上清液;5—純化的Ack1蛋白;6—純化的Ack2蛋白;7—純化的Ack3蛋白。圖2 SDS-PAGE分析Ack1,Ack2和Ack3蛋白Fig.2 SDS-PAGE analysis of Ack1, Ack2 and Ack3 proteins

根據(jù)乙酸激酶Ack1,Ack2和AcK3的氨基酸序列計(jì)算,其編碼多肽鏈分子量均為45.2 kDa,泳道2，3和4相應(yīng)位置均有預(yù)期大小的條帶,說明乙酸激酶Ack1,Ack2和Ack3已成功誘導(dǎo)表達(dá)。泳道5,6和7在對應(yīng)位置出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶,表明經(jīng)Ni+-NTA樹脂親和純化后成功獲得乙酸激酶Ack1,Ack2和Ack3。

2.2 不同ATP再生系統(tǒng)的偶聯(lián)反應(yīng)效果比對

根據(jù)文獻(xiàn)的研究結(jié)果[4],氨基酸連接酶YwfE在37 ℃,pH 9的條件下酶活力最高,為了驗(yàn)證雙酶偶聯(lián)催化的效果,配置如下催化反應(yīng)體系:Ala 30 mmol/L,Gln 30 mmol/L,MgSO430 mmol/L,ATP 5 mmol/L,ACP-Li 50 mmol/L,Tris-HCl 50 mmol/L(pH 8或pH 9),純化的YwfE蛋白200 mg/L,純化的Ack蛋白50 mg/L。對反應(yīng)生成的丙谷二肽進(jìn)行監(jiān)測,結(jié)果如表2所示。

表2 不同偶聯(lián)反應(yīng)體系下丙谷二肽的濃度

由表2可知:在溫度為37 ℃時,乙酸激酶和氨基酸連接酶的偶聯(lián)效果最好,這與二者的最適反應(yīng)溫度相近有關(guān)。溫度37 ℃,pH 9.0條件下的丙谷二肽生成量高于溫度37 ℃,pH 8.0條件下的生成量,說明偶聯(lián)反應(yīng)時,氨基酸連接酶活力的保持更有助于丙谷二肽的合成。當(dāng)溫度由37 ℃升高到47 ℃,丙谷二肽的生成量顯著降低,說明氨基酸連接酶活力受溫度影響較大。總體來說,雙酶偶聯(lián)反應(yīng)制備丙谷二肽的最適反應(yīng)條件為37 ℃,pH 9,此時以乙酸激酶Ack1,Ack2和Ack3為ATP再生用酶的丙谷二肽的最大摩爾轉(zhuǎn)化率分別為64.3%,68.3%和71%。

2.3 以乙酸激酶Ack3為ATP再生用酶的偶聯(lián)反應(yīng)條件優(yōu)化

與直接使用ATP相比,ATP再生系統(tǒng)引入了新的底物。因此對乙酸激酶Ack3為ATP再生用酶的偶聯(lián)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,著重考察MgSO4,ACP-Li和Ack3的添加量對丙谷二肽合成的影響。MgSO4和ACP-Li對偶聯(lián)催化合成丙谷二肽的影響見圖3。

圖3 MgSO4和ACP-Li對偶聯(lián)催化合成丙谷二肽的影響Fig.3 Effect of MgSO4 and ACP-Li concentration on the synthesis of Ala-Gln by coupled enzymatic reaction

由圖3(a)可知:Mg2+濃度對偶聯(lián)反應(yīng)中酶的活力都有促進(jìn)作用,當(dāng)Mg2+濃度從30 mmol/L升高到50 mmol/L時,丙谷二肽的摩爾轉(zhuǎn)化率從71%提升到77.7%,繼續(xù)提升Mg2+濃度時,丙谷二肽的摩爾轉(zhuǎn)化率沒有太大變化。由圖3(b)可知:當(dāng)ACP-Li的濃度從30 mmol/L提高到60 mmol/L,丙谷二肽的摩爾轉(zhuǎn)化率從68.3%提升到73.6%,繼續(xù)提升ACP-Li時,丙谷二肽的摩爾轉(zhuǎn)化率沒有太大變化。因此,偶聯(lián)反應(yīng)中底物的最佳配比為Ala 30 mmol/L,Gln 30 mmol/L,MgSO450 mmol/L,ATP 5 mmol/L,ACP-Li 60 mmol/L。

考察乙酸激酶Ack3添加量對偶聯(lián)催化合成丙谷二肽的影響見圖4。當(dāng)Ack3的添加量從50 mg/L提高到80 mg/L時,丙谷二肽的合成量從21.3 mmol/L提升至24.3 mmol/L,摩爾轉(zhuǎn)化率從71%提升至81%,表明通過提高偶聯(lián)反應(yīng)體系中乙酸激酶的濃度,可以有效提升ATP的再生效率,為丙谷二肽合成提供充足的能量供給。繼續(xù)提升乙酸激酶的添加量,丙谷二肽的合成量沒有太大變化,說明此時ATP的供給已不是丙谷二肽合成的限制因素。

圖4 乙酸激酶Ack3添加量對偶聯(lián)催化合成丙谷二肽的影響Fig.4 Effect of Ack3 concentration on the synthesis of Ala-Gln by coupled enzymatic reaction

在優(yōu)化的反應(yīng)體系下,即Ala 30 mmol/L,Gln 30 mmol/L,MgSO450 mmol/L,ATP 5 mmol/L,ACP-Li 60 mmol/L,對YwfE和Ack3偶聯(lián)催化反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測,結(jié)果如圖5所示。

圖5 YwfE和Ack3催化的酶反應(yīng)進(jìn)程曲線Fig.5 Enzymatic reaction process curve catalyzed by YwfE and Ack3 protein

隨著反應(yīng)的進(jìn)行,丙谷二肽的生成量逐漸增高,并于16 h達(dá)到最大值24.3 mmol/L,副產(chǎn)物丙丙二肽的濃度在14 h達(dá)到最大值2.3 mmol/L并逐漸趨于恒定。底物Ala在14 h幾乎消耗完全,而Gln則在18 h消耗完全,表明在反應(yīng)過程中,一部分的底物Ala會額外消耗用于副產(chǎn)物丙丙二肽的合成。

與我們之前的研究結(jié)果相比[4],使用Ack3蛋白作為ATP再生體系的催化反應(yīng)效果比直接使用ATP的催化反應(yīng)效果更好,這可能是由于直接使用ATP時會伴隨著AMP和ADP生成,這些化合物會競爭性的與YwfE結(jié)合,從而抑制了YwfE的酶活力。ATP再生體系的引入大幅度減少了反應(yīng)體系中ATP的使用以及AMP和ADP的積累量,從而維持了反應(yīng)過程中YwfE的酶活力,提高了底物的利用率。但是ATP再生體系的應(yīng)用會延長催化反應(yīng)時間,導(dǎo)致生產(chǎn)效率的下降。

3 結(jié) 論

本研究考察了不同ATP再生系統(tǒng)與L-氨基酸連接酶催化丙谷二肽合成反應(yīng)的適配性。研究表明,C.acetobutylicumATCC824來源的Ack3與YwfE的偶聯(lián)效果最好。對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,在37 ℃,pH 9條件下,使用200 mg/L純化的YwfE蛋白,80 mg/L純化的Ack3蛋白,催化30 mmol/L的Ala,30 mmol/L的Gln,50 mmol/L的MgSO4,5 mmol/L的ATP,60 mmol/L的ACP-Li反應(yīng)16 h生成24.3 mmol/L的丙谷二肽,摩爾轉(zhuǎn)化率為81%,同時產(chǎn)生2.3 mmol/L的副產(chǎn)物丙丙二肽。ATP再生體系的引入可以減少丙谷二肽合成過程中ATP的使用,減少AMP和ADP對于L-氨基酸連接酶的競爭性抑制,提高底物的利用率和摩爾轉(zhuǎn)化率,其研究結(jié)果對于大規(guī)模的丙谷二肽催化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。