萬宇平 何方洋 賈芳芳 崔娜 崔海峰

摘 要：本文通過制備滴滴涕半抗原，研制出一種能夠檢測蔬菜、水果、飼料、牛奶中滴滴涕的膠體金免疫層析試紙條，檢測限為5μg/kg，檢測時間為15min，假陽性率和假陰性率均為零，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求。同時，該試紙條可用于基層實驗室的大批量樣本檢測，具有實際意義，且未見免疫方法相關(guān)文獻報道，具有創(chuàng)新性。

關(guān)鍵詞：滴滴涕? 膠體金免疫層析試紙條? 快速檢測

引言

滴滴涕（dichlorodiphenyltrichloroethane，簡稱“DDT”）是一種高毒有機磷殺蟲劑，其應(yīng)用廣泛，因?qū)οx有觸殺、胃毒等作用而被用于防治蚊蠅和臭蟲[1-3]。由于該藥物化學性質(zhì)較為穩(wěn)定，容易富集污染環(huán)境，并可通過食物鏈進入人體而危害健康。因此，早在2009年，我國就已全面禁止了滴滴涕的生產(chǎn)、使用和進出口。但時至今日，仍有部分養(yǎng)殖戶使用滴滴涕作為殺蟲劑，故對該農(nóng)藥殘留進行檢測具有必要性[4-6]。

目前，檢測滴滴涕的方法大多為儀器方法[7-14]，但此類方法成本較高、檢測時間長、操作復(fù)雜，不符合基層實驗室高效、便捷的檢測要求。因此，本研究制備出一種滴滴涕的單克隆抗體，將其應(yīng)用于膠體金免疫快速檢測試紙條，可實現(xiàn)高效、便捷的檢測。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

滴滴涕、五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等標準品（純度≥95%），購自北京標準物質(zhì)研究中心;檸檬酸三鈉、碳酸鉀，購自北京百欣試劑公司;樣本提取劑、樣本復(fù)溶液、膠體金分析儀，由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供;渦旋儀、均質(zhì)器，購自湖南湘立科學儀器有限公司[15-16]。

1.2 方法

1.2.1 滴滴涕半抗原的制備

取1.7g鄰氯苯乙酸，加5mL氯苯，再加入1.8g水合氯醛，加熱至完全溶解后，加入三氯化鋁5.38g，室溫攪拌5h，停止反應(yīng)，加水80mL和乙酸乙酯120mL，萃取分離，分去水相，有機相無水硫酸鈉干燥蒸干，得到黃色油狀物，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯（v/v，1/1）洗脫分離，得到乙酸滴滴涕半抗原產(chǎn)物1.8g，收率43.9%。

1.2.2 免疫原的制備——滴滴涕半抗原與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)物合成

取乙酸滴滴涕半抗原產(chǎn)物15mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC13.7mg和NHS10.9mg，充分混勻后，反應(yīng)4h，得到半抗原活化液A液;取牛血清白蛋白（BSA）50mg，加0.05M PB溶解，得到B液。將A液滴加到B液中，4℃反應(yīng)24h后0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到滴滴涕-BSA偶聯(lián)物，即免疫原，分裝后于-20℃保存。

1.2.3 免疫原的制備——滴滴涕半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)物合成

取乙酸滴滴涕半抗原產(chǎn)物9mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC7.6mg和NHS6.8mg，充分混勻后反應(yīng)4h，得到半抗原活化液A液;取卵清白蛋白（OVA）50mg，加0.05M PB溶解，得到B液。將A液滴加到B液中，4℃反應(yīng)24h后0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到滴滴涕-OVA偶聯(lián)物，即免疫原，分裝后于-20℃保存。

1.2.4 將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物凍干到微孔試劑上

將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物加入到微孔板中，冷凍干燥，得到滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物凍干的微孔試劑[15-16]。

1.2.5 檢測方法

向微孔中加入100μL待檢樣本溶液，混勻，室溫下培育3min。吸取70μL溶液滴至試紙條上，反應(yīng)10min，根據(jù)示意圖判定結(jié)果或通過膠體金分析儀讀取檢測結(jié)果[15-16]。

1.2.6 樣本檢測限

在空白蔬菜、水果、飼料、牛奶樣本中分別添加滴滴涕標準品至質(zhì)量濃度為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L，按照“1.2.5”所述方法用3批試紙條進行檢測，每個濃度重復(fù)5次，根據(jù)實驗結(jié)果確定樣本檢測限[15-16]。

1.2.7 試紙條的特異性

分別配制500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物，用膠體金免疫快速檢測試紙條進行檢測，重復(fù)測定3次，判斷試紙條的特異性[15-16]。

1.2.8 準確性

農(nóng)業(yè)部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準確性[15-16]。取經(jīng)過儀器確證的50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質(zhì)量濃度小于5μg/kg）與50份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質(zhì)量濃度大于5μg/kg），用膠體金免疫快速檢測試紙條檢測滴滴涕的殘留量，計算假陽性率和假陰性率[15-16]?！掇r(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定：試紙條假陽性率應(yīng)小于5%，假陰性率應(yīng)為零[15-16]。

1.2.9 試紙條的穩(wěn)定性

將試紙條保存于2～8℃環(huán)境中，每隔1個月檢測試紙條的準確性，連續(xù)測定15個月[15-16]。具體方法為：分別檢測經(jīng)過儀器確證的20份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質(zhì)量濃度小于5μg/kg）與20份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質(zhì)量濃度大于5μg/kg），重復(fù)測定2次，根據(jù)實驗結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1樣本檢測限

配置滴滴涕濃度分別為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L的蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，按照“1.2.5”步驟進行檢測，確定檢測限[15-16]。結(jié)果顯示，該試紙條的檢測限為5μg/kg，見表1。

2.2 特異性

用試紙條檢測500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物，結(jié)果均呈陰性（見表2），表明該試紙條特異性較好[15-16]。

2.3 準確性

用試紙條檢測50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，檢測結(jié)果均為陰性，說明假陽性率低于5%;用試紙條檢測50份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，檢測結(jié)果均為陽性（見表3），說明該試紙條假陰性率為零，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求[15-16]。

2.4 穩(wěn)定性

試紙條保存12個月內(nèi)，其假陽性率和假陰性率的檢測結(jié)果均符合要求;之后試紙條會出現(xiàn)少量失效、假陰性等現(xiàn)象[15-16]（見表4）。

3 討論

目前，有關(guān)檢測滴滴涕的文獻較為有限，本研究通過制備滴滴涕半抗原，讓其與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原，最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求，對試紙條進行了特異性、準確性、穩(wěn)定性等性能測試，均符合要求。此外，該試紙條的檢測時間僅為15min，比現(xiàn)有文獻中儀器方法用時更短，操作更簡便。

參考文獻：

[1] 付善良，陸靜，陳練，成婧，朱紹華，羅芳，符瓊，易錫，梁香.磁固相萃取-熱脫附-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測水中六氯苯、六六六和滴滴涕[J].環(huán)境化學，2020，39（02）：566-568.

[2] 關(guān)晨晨，潘碧樞，陳淅.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定灘涂生物樣本中的六六六和滴滴涕[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2020，30（05）：537-539+550.

[3] 孫曉杰，丁海燕，李兆新，盧立娜，邢麗紅，譚志軍，翟毓秀.氣相色譜–電子捕獲檢測法測定食品中有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2019，10（21）：7283-7289.

[4] Huang Xiaodong，Liu Yanan，Liu Huifang，Liu Guangyang，Xu Xiaomin，Li Lingyun，Lv Jun，Liu Zhongxiao，Zhou Wenfeng，Xu Donghui. Magnetic Solid-Phase Extraction of Dichlorodiphenyltrichloroethane and Its Metabolites from Environmental Water Samples Using Ionic Liquid Modified Magnetic Multiwalled Carbon Nanotube/Zeolitic Imidazolate Framework-8 as Sorbent.[J]. Molecules （Basel， Switzerland），2019，24（15）.

[5] 劉寶貴，劉哲.食品中六六六和滴滴涕殘留量檢測方法的改進[J].呂梁教育學院學報，2018，35（03）：31-35.

[6] 劉維英.食品中六六六、滴滴涕殘留量的測定[J].現(xiàn)代食品，2018（14）：91-94.

[7] 趙微.毛細管柱氣相色譜法測定六六六、滴滴涕[J].科技風，2018（08）：81-82.

[8] 谷勇，唐文麗，羅成，侯杰榮.GC-ECD檢測馬齒莧中六六六和滴滴涕的農(nóng)藥殘留[J].中國民族民間醫(yī)藥，2018，27（04）：25-27.

[9] 任興權(quán)，任璐.食品中六六六和滴滴涕檢測方法的優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（01）：136-140.

[10] 王潔櫻.邯鄲市表層土壤與蔬菜中六六六（HCHs）和滴滴涕（DDTs）殘留量的檢測研究[J].當代化工研究，2017（05）：146-147.

[11] 劉丹丹，何飛飛，張艷，郝淑美.云南小?？Х戎辛?、滴滴涕殘留量測定適宜方法研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016（20）：94-95.

[12] 翁飛智.茶葉中六六六、滴滴涕農(nóng)藥殘留檢測[J].江西農(nóng)業(yè)，2016（13）：9-10.

[13] 劉海萍，魯炳聞，房麗萍，楊剛，田衎，封躍鵬.含13種有機氯農(nóng)藥土壤標準樣品的研制[J].化工環(huán)保，2016，36（01）：110-114.

[14] 王乙震，羅陽，齊向華，張俊，林超.固相萃取-氣相色譜三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法測定海河流域地下水中六六六和滴滴涕[J].海河水利，2015（06）：17-20.

[15] 吳小勝，賈芳芳，崔海峰，等.一種苯醚氰菊酯膠體金免疫快速檢測試紙條的研制[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2020，59（7）：196-198，203.

[16] 朱亮亮，王琳琛，王兆芹，崔海峰，張坤，馮才偉，萬宇平.檢測4種有機磷農(nóng)藥膠體金免疫層析試紙條的研制[J].山東畜牧獸醫(yī)，2019，40（08）：10-12.