呂欣榮， 楊一帆， 林創(chuàng)堅(jiān)

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬汕頭市中醫(yī)醫(yī)院，廣東汕頭 515000；2. 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌研究中心，福建廈門 361000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種最常見的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，其病變特征是關(guān)節(jié)軟骨損傷后，經(jīng)過長(zhǎng)期的暴露磨損，導(dǎo)致骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)變形、疼痛，嚴(yán)重者可致殘[1-4]。軟骨損傷是OA的發(fā)病本質(zhì)，軟骨細(xì)胞潛在的炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和對(duì)炎癥細(xì)胞因子的反應(yīng)在OA的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用[5]。因此，體外研究軟骨細(xì)胞的炎癥病理狀態(tài)及藥物干預(yù)作用在OA的基礎(chǔ)研究中有重要的意義。已有研究表明，白細(xì)胞介素1β（IL-1β）是OA 的關(guān)鍵炎癥細(xì)胞因子[6]。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路是經(jīng)典的促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的信號(hào)通路，同時(shí)參與了炎癥反應(yīng)過程，是炎癥反應(yīng)過程中的關(guān)鍵信號(hào)通路之一[7-9]。

OA 屬于中醫(yī) “骨痹” 范疇。獨(dú)活寄生湯出自孫思邈的《備急千金要方》，作為補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕的代表方，在臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種關(guān)節(jié)炎疾病并取得較好的治療效果。既往有研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活寄生湯能促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制軟骨細(xì)胞凋亡[10-12]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討?yīng)毣罴纳鷾珜?duì)炎癥狀態(tài)下軟骨細(xì)胞的增殖情況、炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）的分泌及PI3K、AKT蛋白與mRNA表達(dá)的影響，為研究OA的發(fā)生機(jī)制及治療提供新的思路，以期為該方更好地應(yīng)用于臨床治療OA提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1. 1藥物來源及制備獨(dú)活寄生湯（由獨(dú)活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風(fēng)、川芎、人參、甘草、當(dāng)歸、芍藥、干地黃各6 g 組成），各藥材均來源于廣東康美藥業(yè)有限公司。制備：加10 倍量水，加熱回流提取，提取2次，每次1.5 h，提取液過濾合并后，濃縮至1 g·mL-1，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2試劑與儀器鹿瓜多肽注射液（哈爾濱譽(yù)衡藥業(yè)有限公司）；白細(xì)胞介素1β（IL-1β）（美國Sigma 公司）；胰酶、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、DMEM 無糖培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；青霉素-鏈霉素溶液（中國Biosharp 公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）（日本同仁化學(xué)研究所）；抗磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抗體、抗蛋白激酶B（AKT）抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（中國Affinity Biosciences 公司）；抗β-actin 抗體（美國Sigma 公司）。SW-CJ 超凈臺(tái)（蘇州凈化儀器廠）、AE2000倒置相差顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）、CCL-170T-8三氣培養(yǎng)箱（新加坡Esco公司）、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；ABI 7300 熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）；ELx800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國Bio Tek公司）；OneC微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀（美國賽默飛公司）。

1. 3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)2 月齡雄性SD 大鼠36 只，SPF級(jí)4周齡雄性SD大鼠4只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0030。

1. 4軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的分離全部在超凈臺(tái)中無菌條件下進(jìn)行操作。將4 周齡SD 大鼠置于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中5 min，取下膝關(guān)節(jié)，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，用手術(shù)刀片削取軟骨組織，用PBS洗滌3次，用酶消化法獲取正常軟骨細(xì)胞。接種軟骨細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS 完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液傳代。

1. 5含藥血清的制備將36 只SD 大鼠分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，中藥低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組，每組6 只。按照人和動(dòng)物體質(zhì)量比，將藥物等效劑量換算后，中藥低、中、高劑量組分別給予0.85、1.70、3.40 g·kg-1·d-1獨(dú)活寄生湯灌胃處理，陽性對(duì)照組給予8 ng·kg-1·d-1鹿瓜多肽注射液腹腔注射，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。各組均連續(xù)給藥7 d。末次給藥2 h，腹主動(dòng)脈取血，離心取上層血清，-80 ℃保存。

1. 6分組及給藥將軟骨細(xì)胞分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，中藥低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組。模型對(duì)照組，中藥低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組軟骨細(xì)胞用含IL-1β 10 ng·mL-1的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)24 h 后，分別加入對(duì)應(yīng)含藥血清1 mL、基礎(chǔ)培養(yǎng)基9 mL，培養(yǎng)12 h。空白對(duì)照組不經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)，加入空白血清。

1. 7觀察指標(biāo)與方法

1. 7. 1 CCK-8法測(cè)定軟骨細(xì)胞活力的變化 選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的軟骨細(xì)胞，胰酶消化后，以2 ×105個(gè)/ mL細(xì)胞密度接種于96孔板中，按 “1.6” 項(xiàng)處理后，每孔加入110 μL CCK-8 培養(yǎng)基替代原培養(yǎng)基，37 ℃孵育1.5 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1. 7. 2 ELISA 法檢測(cè)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α含量 選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的軟骨細(xì)胞，胰酶消化后，以2 × 105個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于6 孔板中，按 “1.6” 項(xiàng)處理后，按照TNF-α ELISA 試劑盒說明書的操作步驟測(cè)定。應(yīng)用酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1. 7. 3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)軟骨細(xì)胞PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平 將 “1.6” 項(xiàng)處理完成后的細(xì)胞，置于冰上， PBS洗2遍，加入適量含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP 管中。冰上裂解30 min 后，于4 ℃12 000 r/min 離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的EP 管中。提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度，按照最低濃度調(diào)整各組蛋白濃度，加入上樣緩沖液，95 ℃水浴鍋內(nèi)變性10 min，冷卻后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用體積分?jǐn)?shù)5% BSA溶液封閉2 h 后，加入PI3K、AKT抗體（按1∶1 000 濃度稀釋），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗免IgG（按1∶3 000濃度稀釋）室溫孵育1 h。用TBST 洗滌3 次后，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）方法顯影，將顯影結(jié)果用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度掃描及圖像分析。

1. 7. 4 熒光實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)軟骨細(xì)胞PI3K、AKT mRAN 表達(dá)水平 參照TRIzol 法說明書提取按 “1.6” 項(xiàng)處理完成后的軟骨細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀檢測(cè)RNA 的純度和濃度。將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。PI3K 上游引物5’-TGTCCGGAGGATTCTGAT T-3’，下游引物5’-AGCCTTAAGTGGAGCCTCTA-3’。AKT 上游引物5’-CTACGGTGCGGAGATTGTG T-3’，下游引物5’-TCCTTGATATCCCTCCTTGC A-3’。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，總共進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算PI3K、AKT 的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1. 8統(tǒng)計(jì)方法每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3 次。采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1各組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞活力的變化比較圖1、2 結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-1β 誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.01），說明造模成功。與模型對(duì)照組比較，中藥低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞的活力明顯升高（P＜0.01），其中，中藥組中的中劑量提高IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞的活力效果最佳，但各治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2. 2各組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α含量比較圖3結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-1β 誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞TNF-α 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，中藥低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組軟骨細(xì)胞的TNF-α 含量顯著降低（P＜0.01），其中，中藥組中的中劑量降低TNF-α 含量的效果最佳，但各治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞形態(tài)變化比較Figure 1 Comparison of the morphological features of IL-1β-induced chondrocytes in various groups

圖2 各組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞活力的變化比較（x ± s，n = 3）Figure 2 Comparison of the change of viability of IL-1βinduced chondrocytes in various groups（x ± s，n = 3）

2. 3各組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平比較圖4、5 結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-1β 誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞PI3K、AKT 蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，中藥中劑量組和陽性對(duì)照組的PI3K、AKT 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），且2 個(gè)治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明獨(dú)活寄生湯對(duì)于軟骨細(xì)胞損傷有治療作用，其作用可能與升高PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

圖3 各組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α含量比較（x ± s，n = 3）Figure 3 Comparison of the content of TNF-α of IL-1βinduced chondrocytes medium in various groups（x ± s，n = 3）

圖4 各組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞PI3K、AKT蛋白Western Blot電泳條帶Figure 4 Comparison of Western blotting strips of PI3K and AKT in IL-1β-induced chondrocytes of various groups

2. 4各組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平比較圖6 結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較， 模型對(duì)照組IL- 1β 誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞PI3K、AKT mRAN 表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較， 中藥中劑量組和陽性對(duì)照組的PI3K、 AKT mRNA 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），且2 個(gè)治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明獨(dú)活寄生湯對(duì)于軟骨細(xì)胞損傷有治療作用，其作用可能與升高PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平有關(guān)。

圖5 各組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞PI3K（A）、AKT（B）蛋白表達(dá)水平比較（x ± s，n = 3）Figure 5 Comparison of the PI3K（A）and AKT（B）protein expression levels in IL-1β-induced chondrocytes of various groups（x ± s，n = 3）

圖6 各組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞PI3K（A）、AKT（B）mRNA表達(dá)水平比較（x ± s，n = 3）Figure 6 Comparison of the PI3K（A）and AKT（B）mRNA expression levels in IL-1β-induced chondrocytes of various groups（x ± s，n = 3）

3 討論

研究[13]發(fā)現(xiàn)，IL-1β 是一種促炎因子，可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞代謝合成紊亂。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞活力明顯下降（P ＜0.01），表明IL-1β 可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷，提示軟骨細(xì)胞損傷模型造模成功。

TNF-α 在骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[14-15]。TNF-α又稱惡質(zhì)素，是一種特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的因子，但過量的TNF-α 會(huì)刺激軟骨細(xì)胞，引起炎癥[16-17]。炎癥細(xì)胞能通過炎癥因子TNF-α 激活胰蛋白酶原，促進(jìn)細(xì)胞壞死，進(jìn)而加重局部及全身炎癥反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞TNF-α 含量顯著升高（P ＜0.01），表明IL-1β 可促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌TNF-α，加重軟骨細(xì)胞損傷。

我們對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行大量調(diào)研發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)活化是細(xì)胞內(nèi)外多條信號(hào)通路作用的，PI3K/AKT 通路是經(jīng)典的促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的信號(hào)通路，參與炎癥反應(yīng)過程。多種因素激活PI3K/AKT/細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，啟動(dòng)和調(diào)控下游細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)如TNF-α 的基因轉(zhuǎn)錄[19]，引起或加重炎癥。細(xì)胞受到損傷時(shí)，PI3K激活，活化的PI3K 使AKT 磷酸化而活化，進(jìn)而調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax 的比例，抗細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮多種生物效應(yīng)[20-22]。本研究結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞PI3K、AKT蛋白和mRAN 表達(dá)水平明顯下降（P ＜0.01）。表明IL-1β可通過激活PI3K、AKT蛋白和mRAN表達(dá)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞活力降低。

OA 屬于中醫(yī) “骨痹” 范疇。正虛邪湊是該病發(fā)生的主要因素。其中，正虛主要表現(xiàn)為營衛(wèi)不和、氣血虧虛和肝腎虧損；邪湊主要表現(xiàn)為痰瘀痹阻經(jīng)絡(luò)、風(fēng)寒濕外邪痹阻和外傷勞損[23-24]。獨(dú)活寄生湯出自唐·孫思邈的《備急千金要方》，具有祛風(fēng)濕、止痹痛、益氣血、補(bǔ)肝腎等功效，常用于治療痹證日久，肝腎虧虛，氣血不足證。方由獨(dú)活、桑寄生、防風(fēng)、秦艽、杜仲、牛膝、細(xì)辛、桂心、人參、茯苓、當(dāng)歸、川芎、芍藥、干地黃、甘草等組成[25]。藥理研究表明，獨(dú)活寄生湯具有抑制炎癥因子、減輕關(guān)節(jié)軟骨退行性病變、促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨再生等作用[13]。本研究結(jié)果顯示：獨(dú)活寄生湯中藥中劑量組IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞的活力較模型對(duì)照組明顯升高，軟骨細(xì)胞分泌TNF-α含量降低，PI3K、AKT 蛋白和mRAN 的表達(dá)水平明顯升高（P ＜0.01），與鹿瓜多肽注射液作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。表明獨(dú)活寄生湯可促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，有效降低炎癥狀態(tài)下軟骨細(xì)胞TNF-α的分泌，調(diào)節(jié)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中PI3K、AKT 蛋白及mRAN 的表達(dá)，對(duì)損傷的軟骨細(xì)胞有治療作用。

綜上所述，獨(dú)活寄生湯對(duì)于軟骨細(xì)胞損傷有治療作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控炎癥因子TNF-α的分泌及PI3K/AKT 信號(hào)通路PI3K、AKT 的表達(dá)有關(guān)。