駱志均， 何明豐

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山市中醫(yī)院，廣東佛山 528000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）簡(jiǎn)稱慢阻肺，是一種以氣流受限為主要特征的慢性肺部炎癥性疾病，氣流受限不可逆、呈進(jìn)行性進(jìn)展[1]。慢阻肺可以導(dǎo)致患者的呼吸功能下降、呼吸衰竭、慢性肺源性心臟病等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生命健康，已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[2-3]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)目前慢阻肺患者9 990 萬(wàn)[4]。而且隨著空氣污染加重、吸煙人數(shù)增多及老齡人口劇增，我國(guó)慢阻肺發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。研究顯示，免疫功能低下、氣道炎癥和氣道重塑是慢阻肺發(fā)生和進(jìn)展的重要因素[5]。慢阻肺屬于中醫(yī)學(xué)“咳嗽”“喘證”“肺脹” 等范疇，穩(wěn)定期核心病機(jī)為肺脾氣虛。本課題組臨床上應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯加味治療慢阻肺療效顯著，但是關(guān)于其作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究復(fù)制了大鼠慢阻肺模型，采用補(bǔ)中益氣湯加味干預(yù)，探討其對(duì)慢阻肺大鼠肺功能、免疫功能、炎性因子和氣道重塑因子的影響，從而為補(bǔ)中益氣湯加味臨床防治慢阻肺提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1. 1動(dòng)物健康SD雄性大鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量180 ～220 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于佛山市中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0125。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫18 ～22 ℃，濕度50% ～70%，光照12 h/d。

1. 2藥物補(bǔ)中益氣湯加味組成：黃芪15 g，黨參15 g，白術(shù)10 g，炙甘草6 g，當(dāng)歸10 g，陳皮6 g，升麻6 g，柴胡12 g，茯苓10 g，法半夏10 g，桔梗10 g，麥冬10 g。上述中藥飲片購(gòu)自佛山市中醫(yī)院中藥房。煎煮、濃縮中藥液，相當(dāng)于原藥1.20 g/mL，置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆?。地塞米松片，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20192145。

1. 3試劑與儀器轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素8（IL-8）酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司）；金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP-12）ELISA 試劑盒（上海恒渡生物科技有限公司）； 免疫球蛋白A（IgA）、 免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）ELISA 試劑盒（上海延幕實(shí)業(yè)有限公司）；脂多糖（北京凱瑞基生物科技有限公司，批號(hào)：L16970）。AniRes 2005 動(dòng)物肺功能分析儀（北京貝蘭博科技有限公司）；FRONTIER?5000 小型多功能臺(tái)式離心機(jī)[奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]；HBS-1096C酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1. 4動(dòng)物分組、造模和干預(yù)所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組和中藥組，每組各15只。參照煙熏結(jié)合氣管內(nèi)滴注脂多糖方法[6]制備大鼠慢阻肺模型：將模型組、西藥組和中藥組大鼠置于有機(jī)玻璃染毒箱（120 cm × 100 cm× 50 cm）內(nèi)，香煙點(diǎn)燃后置于調(diào)料盒放入2 000 mL集氣瓶中，將煙霧壓入染毒箱內(nèi)使大鼠被動(dòng)吸煙染毒。每天10 只香煙，分上下午各煙熏1 次，每次60 min，連續(xù)煙熏共80 d。實(shí)驗(yàn)第1天和第31天給予大鼠異氟烷吸入麻醉后氣道內(nèi)滴注200 μL 的脂多糖。滴注脂多糖當(dāng)天不吸煙。同期，正常組大鼠呼吸新鮮空氣，實(shí)驗(yàn)第1 天和第31 天給予大鼠異氟烷吸入麻醉后氣道內(nèi)滴注200 μL 的生理鹽水。最后常規(guī)喂養(yǎng)20 d以達(dá)到穩(wěn)定期。若第0.3秒最大呼氣量（FEV0.3）/用力肺活量（FVC）小于70%，即可判斷慢阻肺大鼠模型建立成功[2]。然后按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積等效量換算比例[7]計(jì)算大鼠的給藥劑量，中藥組給予補(bǔ)中益氣湯加味煎液12.6 g·kg-1·d-1灌胃，西藥組給予地塞米松生理鹽水混懸液0.9 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃4 周。4周后檢測(cè)指標(biāo)。

1. 5肺功能檢測(cè)測(cè)試前1 d禁食不禁飲，以30 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥位固定。用肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)大鼠第0.3秒用力呼氣量（FEV0.3）、用力肺活量（FVC）、FEV0.3 占FVC 預(yù)計(jì)值百分比（FEV0.3/FVC）、每分鐘最大通氣量（MVV）。

1. 6實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)測(cè)試前1 d 禁食不禁飲，麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，以3 000 r/min離心20 min后取上清液，-70 ℃保存。采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清IgA、IgM、IgG、TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量。剪取右下肺組織400 mg，加生理鹽水1 mL 研磨均漿后離心，取上清液，-70 ℃保存。采用ELISA法檢測(cè)大鼠肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TIMP-1、MMP-9、MMP-12含量。具體操作方法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，應(yīng)用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)620 nm處檢測(cè)。

1. 7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1一般形態(tài)觀察正常組大鼠活潑好動(dòng)，毛發(fā)光澤，飲食飲水正常，體質(zhì)量逐漸增加。造模過(guò)程中模型組死亡2 只，西藥組和中藥組各死亡1 只。模型組大鼠毛發(fā)枯萎，行動(dòng)遲緩，喘促，體質(zhì)量逐漸下降。西藥組和中藥組大鼠一般情況改善明顯，可見(jiàn)行動(dòng)和飲食飲水增加，無(wú)明顯喘促，體質(zhì)量逐漸恢復(fù)正常。

2. 2各組大鼠肺功能的比較表1 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、MVV 水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠FVC、 FEV0.3、 FEV0.3/FVC、 MVV 水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），除MVV 外，2 個(gè)治療組FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC 比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2. 3各組大鼠血清IgA、IgM、IgG水平的比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清IgA、IgM、IgG 水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠血清IgA、IgM、IgG水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且2 個(gè)治療組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肺功能的比較Table 1 Comparison of pulmonary functions in various groups （x ± s）

表2 各組大鼠血清IgA、IgM、IgG水平的比較Table 2 Comparison of serum IgA，IgM，IgG levels in various groups （x ± s）

2. 4各組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平的比較表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），除TGF-β1 外，2 個(gè)治療組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

表3 各組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平的比較Table 3 Comparison of the serum levels of TGF-β1，TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8 in various groups （x ± s）

2. 5各組大鼠肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平的比較表4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），除TGF-β1 外，2 個(gè)治療組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

2. 6各組大鼠肺組織TIMP-1、MMP-9、MMP-12水平的比較表5結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺組織MMP-9、MMP-12 水平顯著升高，TIMP-1 水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠肺組織MMP-9、MMP-12水平顯著降低， TIMP-1水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且2 個(gè)治療組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平的比較Table 4 Comparison of the levels of TGF-β1，TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8 in lung tissue of various groups （x ± s）

表5 各組大鼠肺組織TIMP-1、MMP-9、MMP-12水平的比較Table 5 Comparison of the levels of TIMP-1，MMP-9，MMP-12 in lung tissue of various groups[x ± s，ρ/（pg·mL-1）]

3 討論

慢性阻塞性肺疾病（簡(jiǎn)稱慢阻肺）屬于中醫(yī)學(xué)“咳嗽”“肺脹”“喘證” 等范疇，主要表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、喘促等癥狀。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病為本虛標(biāo)實(shí)之病，以脾肺兩虛為本，以痰濁、郁熱為標(biāo)。肺臟病首先病在肺臟，肺主氣司呼吸，肺氣虛則不能主氣，宣發(fā)肅降不利，升降失常則為咳嗽、喘促，肺病及脾，子病及母，脾氣虧虛，不能運(yùn)化水濕，聚為痰飲，留滯肺竅，則為咳痰[8]。急則治其標(biāo)，緩則治其本。慢阻肺穩(wěn)定期以肺脾氣虛為核心病機(jī)，以健脾補(bǔ)肺，化痰止咳為治療法則[9]。補(bǔ)中益氣湯為經(jīng)典方劑，具有補(bǔ)中益氣功效，本研究所用的方藥是在補(bǔ)中益氣湯基礎(chǔ)上加味而成。方中：黃芪甘溫，補(bǔ)中益氣，補(bǔ)肺實(shí)衛(wèi)，益氣固表；黨參、白術(shù)、炙甘草甘溫益氣，補(bǔ)益脾胃，助黃芪健脾補(bǔ)肺；陳皮健脾燥濕，調(diào)理氣機(jī)；升麻、柴胡升陽(yáng)，助清氣上升以補(bǔ)肺；當(dāng)歸補(bǔ)血和營(yíng)，且久病必瘀，當(dāng)歸兼活血化瘀，一藥兩用。加茯苓健脾滲濕，合黃芪益氣健脾；加半夏燥濕化痰；加桔梗止咳化痰，升提肺氣；加麥冬養(yǎng)陰生津以補(bǔ)肺。諸藥合用，全方共奏健脾補(bǔ)肺、止咳化痰之功。

FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、MVV 是肺功能的重要指標(biāo)。研究[10]表明，慢阻肺患者肺功能顯著低于正常健康人群。本研究采用煙熏和氣管內(nèi)滴注脂多糖法建立大鼠慢阻肺模型，結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺功能FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、MVV，血清IgA、IgM、IgG，肺組織TIMP-1 水平顯著降低，血清和肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及肺組織MMP-9、MMP-12 含量顯著升高（P ＜0.05）。提示慢阻肺大鼠模型造模成功，且慢阻肺大鼠存在免疫功能低下、炎癥反應(yīng)和氣道重塑等病理表現(xiàn)。

經(jīng)補(bǔ)中益氣湯加味治療后，慢阻肺大鼠肺功能得到明顯改善。在慢阻肺的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，體液免疫和細(xì)胞免疫發(fā)揮重要的作用。 IgA、IgM、IgG 是體液免疫的重要組成部分[11]，IgA 是氣道局部黏膜免疫的重要因子，IgM是一種早期抵抗病原微生物的抗體，IgG是最主要的免疫蛋白，可以促進(jìn)單核細(xì)胞的吞噬作用。研究表明，慢阻肺患者血清中IgA、IgM、IgG水平顯著低于正常健康人群[12]，提示慢阻肺存在免疫功能低下。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)中益氣湯可以提高慢阻肺大鼠血清IgA、IgM、IgG水平，提示補(bǔ)中益氣湯可以通過(guò)提高免疫功能改善慢阻肺大鼠肺功能。

氣道炎癥和氣道重塑是慢阻肺的重要特征和關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，氣道炎癥是氣道重塑的主要病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎性因子參與了慢阻肺的發(fā)生發(fā)展。當(dāng)受到煙霧和脂多糖刺激時(shí)，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞聚集于氣道，刺激TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎性因子釋放，引起氣道慢性炎癥。TNF-α刺激氣道黏液分泌，加重肺水腫，損傷支氣管和肺組織，促進(jìn)支氣管平滑肌增生，導(dǎo)致氣道重塑，并且促進(jìn)IL-1β、IL-6、IL-8合成，導(dǎo)致炎癥瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13]。IL-1β、IL-6 參與支氣管內(nèi)自分泌環(huán)路，損傷支氣管和肺組織，引起肺功能下降[14]。IL-8可以趨化炎癥細(xì)胞和炎性因子聚集在氣道，加重局部炎癥反應(yīng)[15]。煙霧和脂多糖同時(shí)刺激TGF-β1大量表達(dá)，導(dǎo)致呼吸道上皮損傷，基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)成分改變、血管新生，導(dǎo)致氣道重塑[16]。MMP-9、MMP-12可促進(jìn)慢阻肺大鼠肺組織細(xì)胞外基質(zhì)的降解[17-18]。 TIMP- 1 是MMP- 9、MMP- 12 的特異性抑制因子， 通過(guò)與MMP- 9、MMP-12發(fā)生不可逆性結(jié)合，阻滯蛋白酶的分解作用而保護(hù)肺組織的完整性[18]。當(dāng)MMP-9、MMP-12降解過(guò)度或TIMP-1抑制降解不足，肺組織蛋白降解，肺組織遭到破壞，氣道重塑，導(dǎo)致慢阻肺發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)中益氣湯加味可以降低慢阻肺大鼠血清和肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及肺組織MMP-9、MMP-12 水平，升高肺組織、TIMP-1 水平。提示補(bǔ)中益氣湯可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和抑制氣道重塑改善慢阻肺大鼠的肺功能。

綜上所述，補(bǔ)中益氣湯加味可以抑制慢阻肺大鼠的炎癥反應(yīng)和氣道重塑，提高免疫功能，改善肺功能，從而發(fā)揮防治慢阻肺的作用。