孫偉博 魏朝瓊 馬曉星 魏 輝 諸葛強

(南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院 南京 210037)

隨著基因工程研究的不斷發(fā)展，轉基因技術被越來越多地用于植物遺傳改良。相對于傳統育種，轉基因技術能夠將特定的外源基因整合到受體植物中，打破了物種間隔離，可以更快更準確地對植物性狀進行改良。從1983年首例轉基因煙草(Nicotianatabacum)獲得成功，1996年轉基因作物商業(yè)化獲得批準以來，全球轉基因植物及其產品的商業(yè)化應用呈逐年增長的趨勢(Halford，2018)，轉基因農作物及轉基因林木提高了相關的經濟效益同時也具有重要的科研價值，但在另一方面，關于轉基因安全性的問題一直爭議不斷。其問題主要來源于3個方面：1)轉化基因對于人或動物等的潛在危害，由于少數轉化基因編碼的蛋白具有過敏性或毒性，人或動物食用后可能造成傷害(Pengetal.，2019)，另外在轉基因過程中攜帶的抗性標記基因進入植物基因組可能會使人或動物產生抗藥性；2)基因逃逸引發(fā)的環(huán)境危害，包括轉基因植物與周邊環(huán)境中的近源物種會由于花粉雜交等原因出現基因漂移，導致抗除草劑等基因進入其他物種基因組從而形成超級雜草(Wangetal.，2018)，還有基因漂移可能導致外源基因進入土壤微生物基因組中，對土壤微生物的生存及群落結構造成影響(Luetal.，2018)；3)對于生態(tài)多樣性的不利影響，轉基因植株的各種性狀優(yōu)勢會使自身形成優(yōu)勢種群，抑制野生種群的發(fā)展從而對生態(tài)多樣性造成破壞(賈士榮等，2014)，外源基因編碼蛋白也可能通過轉基因植物殘體或根系代謝影響土壤微生物生長，從而破壞土壤微生物群落多樣性(Weietal.，2018)。

面對轉基因植物可能存在的風險，需要建立科學的安全評估體系。評估轉基因植物的安全性問題應該從物種、基因和環(huán)境3方面統籌衡量，作為安全評估框架的一部分，轉基因植物的大田試驗成為轉基因物種與現存物種比對的關鍵方法，也是目前國際上對于轉基因安全評測原則達成的共識(Andersonetal.，2018)。本研究采用了3類轉基因楊樹(Populus)進行大田試驗，分別是轉類甜蛋白編碼基因(PeTLP)的抗病系列、轉Bt毒蛋白編碼基因(Cry1Ac)的抗蟲系列、轉AtGols基因的耐旱和耐鹽堿系列。3種基因均通過根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)侵染南林895楊(Populusdeltoides×P.euramericana‘Nanlin 895’)葉盤進行轉化。其中，PeTLP基因來源于毛果楊(Populustrichocarpa)，編碼的類甜蛋白對于多種病原菌具有抑制作用(Wangetal.，2013)；Cry1Ac基因為優(yōu)化過的Bt毒蛋白編碼基因，來源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，其編碼產物對美國白蛾(Hyphantriacunea)具有良好的滅殺性(張雁等，2012)；AtGols基因來源于擬南芥(Arabidopsisthaliana)，編碼生成的蛋白激酶在植物抗旱、抗鹽堿等多種生理進程中發(fā)揮著重要作用(Laetal.，2017)。通過比較不同轉基因南林895楊對周圍環(huán)境影響的橫向差異以及各轉基因株系自身相關參數的縱向差異，揭示不同外源基因、不同轉基因株系和環(huán)境因素等對于轉基因安全評估的影響，為轉基因林木的安全評估及田間釋放提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為3類轉基因南林895楊，即轉類甜蛋白編碼基因(PeTLP)的TLP抗病系列(TLP1-2、TLP1-6、TLP1-7、TLP2-9、TLP2-11)，轉Bt毒蛋白編碼基因(Cry1Ac)的Bt抗蟲系列(A1-3、A3-4、A4-6、A5-0、A5-23)，轉AtGols基因的Gols抗逆系列(Gols2-1、Gols2-2、Gols2-3)。3類轉基因南林895楊均采用植物表達載體pGWB9，通過農桿菌(LBA4404)侵染葉盤法進行轉化獲得。篩選陽性植株，于溫室培養(yǎng)1年，剪取莖段在試驗田中進行扦插種植。對照均為未轉基因南林895楊。

1.2 試驗田間設計

試驗地位于江蘇省宿遷市泗洪陳圩林場，該試驗地為國家林業(yè)局已批準的轉基因楊樹田間試驗林地。試驗地地形平坦，周邊土質、氣溫、降水等環(huán)境條件穩(wěn)定一致。實際種植面積為97 m(南北)× 45 m(東西)，試驗地北邊為2 m寬排水溝和3 m寬道路，南邊為空置地，東邊為3 m寬排水溝，西邊為3 m寬道路。3類轉基因南林895楊及對照組均采用莖段進行扦插，定植方式依據苗木數量采用隨機區(qū)設計和裂區(qū)設計，具體定植如圖1所示，株行距為2 m × 2.15 m，不同轉基因品系之間種植非轉基因南林895楊進行隔離。試驗地邊緣種植南林895楊進行隔離，外圍栽植不飄絮楊樹品種進行隔離。試驗地于2017年3月進行造林，試驗期間不施用化肥及農藥。

圖1 試驗田定植示意Fig.1 Planting map of experimental fieldA1-3,A3-4,A4-6,A5-0,A5-23：轉Bt毒蛋白編碼基因(Cry1Ac)的Bt抗蟲系列；TLP1-2,TLP1-6,TLP1-7,TLP2-9,TLP2-11：轉類甜蛋白編碼基因(PeTLP)的TLP抗病系列；Gols2-1,Gols2-2,Gols2-3：轉AtGols基因的Gols抗逆系列；NL895：未轉基因南林895楊。A1-3,A3-4,A4-6,A5-0,A5-23:Bt insect-resistant lines of transgenic Bt toxin protein coding gene (Cry1Ac);TLP1-2,TLP1-6,TLP1-7,TLP2-9,TLP2-11:TLP pathogen-resistant lines of transgenic thaumatin-like protein coding gene (PeTLP);Gols2-1,Gols2-2,Gols2-3:Gols stress-resistant lines of transgenic AtGols gene;NL895:Non-transgenic Nanlin895 poplars.

1.3 研究方法

1.3.1 試驗地環(huán)境及轉基因植株生長情況測定 試驗地氣溫和降水量分別采用溫度記錄儀(Hoiki，日本)和降水量記錄儀(Hoiki，日本)進行記錄，于2017年3月至2018年11月，每2個月對儀器中的數據進行1次拷貝。植株高度采用米尺進行測量，每個季度測量2次，記錄相關數據。

1.3.2 外源基因穩(wěn)定性的分子檢測 對不同外源基因在南林895楊中的遺傳穩(wěn)定性進行評估，轉化基因的載體均采用35S啟動子，因此使用35S啟動子序列作為上游引物，目的基因的下游序列作為檢測的下游引物(表1)，采用PCR方法針對不同外源基因進行檢測。于2018年6月對每個轉基因系列分別隨機采摘生長良好的葉片作為重復樣本，使用植物總RNA提取試劑盒(天根，北京)進行總RNA提取，并利用反轉錄試劑盒(Takara，日本)合成cDNA作為PCR檢測的模板，反應條件如表1所示。

表1 轉基因楊樹檢測的PCR引物和退火溫度及擴增片段大小Tab.1 PCR primers,annealing temperature(Tm) and amplification fragment size for detection of transgenic poplar

1.3.3 外源基因向土壤微生物轉移風險評估 每個轉基因系列隨機選取3份土壤樣品進行土壤微生物總DNA提取，具體提取方法依據試劑盒說明書(FastDNA Spin kit for Soil，MP Biomedicals，美國)。以土壤微生物總DNA為模板，分別使用不同外源基因的特異引物(表2)進行PCR擴增檢測。

表2 土壤微生物檢測的PCR引物和退火溫度及擴增片段大小Tab.2 PCR primers,annealing temperature(Tm) and amplification fragment size for detection of soil microorganisms

1.3.4 土壤微生物數量檢測 以隨機區(qū)設計或裂區(qū)設計中相鄰4株同一株系的植株作為單個取樣區(qū)的4個頂點，選取每個取樣區(qū)西北頂點植株，在距其主干半徑20 cm的取樣區(qū)域內，隨機選取一點采集10～20 cm深處土壤50 g作為樣本。將采集的土壤樣本置于50 mL離心管中，所有樣品收集于冰盒內，4 ℃冰箱保存。

采用四環(huán)素-葡萄糖-酵母提取物培養(yǎng)基(OGYE)進行土壤樣品中真菌的培養(yǎng)，對土壤樣品中細菌及放線菌培養(yǎng)采用蛋白胨-胰蛋白胨-酵母提取物-葡萄糖培養(yǎng)基(PTYG)，具體培養(yǎng)基配制方法參照Yu等(2013)。

將同一株系楊樹下采集的土壤樣品混合均勻后，稱取60 g平均分為2份，1份倒入三角瓶中，加入15 mmol·L-1無菌磷酸緩沖液(pH7.0)270 mL，置于水平搖床上震蕩10 min。吸取0.1 mL土壤懸浮液，使用15 mmol·L-1無菌磷酸緩沖液稀釋1 000倍，分別取0.1 mL稀釋后土壤懸浮液均勻涂布于OGYE和PTYG培養(yǎng)基上，每個樣品設置3次重復，在室溫條件下進行暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后統計OGYE培養(yǎng)基上真菌菌落數目(colony forming unit，CFU)，培養(yǎng)7天后統計PTYG培養(yǎng)基上菌落數目。統計完成后使用70%乙醇將PTYG培養(yǎng)基表面輕輕擦拭，仍然存在的菌落為放線菌，分別記錄細菌和放線菌菌落數目。另外1份30 g土壤樣品置于烘箱內，80 ℃過夜烘干，稱量并記錄其干質量。樣品中微生物數量計算公式如下：微生物數量=菌落數目×土壤干質量×稀釋倍數，最終以每g土壤(干質量)形成菌落數目的對數值(lgCFU·g-1DW)進行比較分析。

1.3.5 轉基因楊樹的化感作用 于2017年開始，定期采集各轉基因系列及對照組南林895楊葉片，利用“三明治”方法模擬轉基因楊樹對于野生植物的化感作用(圖2)，以評估轉基因楊樹可能對于野生植物的負面效應。將采集的楊樹葉片于50 ℃條件下烘干24 h，取烘干的葉片樣本置于六孔板(康寧，美國)下排3孔中，每孔50 mg同一株系的葉片組織(對照組放置相同處理的未轉基因南林895楊葉片組織)；在每個孔內倒入5 mL低熔點瓊脂(0.5%，W/V)，凝固后再重復倒入5 mL低熔點瓊脂，待瓊脂全部凝固后，每孔加入5粒萵苣(Lactucasativa)種子。在六孔板的上排3孔中均倒入10 mL低熔點瓊脂，待瓊脂全部凝固后，每孔加入5粒萵苣種子，作為負對照。將六孔板放入培養(yǎng)箱于25 ℃條件下暗培養(yǎng)72 h。取出六孔板置于-20 ℃冰箱10 h，之后將萵苣種子取出，測量其胚根及下胚軸長度，每孔中的測量值去除最大值與最小值后，取剩余3粒種子的平均值進行記錄。

圖2 轉基因楊樹的化感作用Fig.2 Allelopathy of transgenic poplars CK-：未放置楊樹葉片的負對照；CK：未轉基因南林895楊葉片；T：轉基因楊樹葉片。CK-:Negative control without poplar leaves;CK:Non-transgenic Nanlin895 poplar leaves;T:Transgenic poplar leaves.

1.4 數據分析

利用Excel軟件記錄試驗數據并進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 試驗地氣象條件及轉基因植株生長情況

試驗地位于江蘇省中部，屬季風氣候。根據溫度和降水量記錄結果(圖3)可以發(fā)現，在2017年4月至2018年5月期間，試驗地降水量具有明顯的季節(jié)性變化，在5—11月期間降水量較大，最大降水量出現在2017年10月1日，為75.5 mm；在11月至次年4月之間降水量較小，較長時間內沒有降水。氣溫變化符合當地氣候特點，最高氣溫出現在2017年7月24日，達到39.7 ℃，最低氣溫出現在2018年1月12日，為-10.3 ℃。試驗地氣象條件較為穩(wěn)定，未出現影響楊樹生長的極端天氣，降水量和氣溫在不同的季節(jié)具有顯著差異性，能夠作為土壤微生物群落結構變化的影響因素進行分析。

圖3 試驗地降水量及氣溫記錄Fig.3 Precipitation and air temperature records in the experimental field

根據對照組和轉基因南林895楊樹高測量結果(圖4)，可以發(fā)現在正常生長環(huán)境條件下，轉基因南林895楊的生長趨勢與對照組的生長趨勢基本一致，在6—12月之間，生長速度較快，12月至次年3月期間植株生長緩慢。在3個采樣時間點上，Bt系列和TLP系列轉基因楊樹的樹高平均值均低于對照組，而Gols系列的轉基因楊樹樹高平均值均高于對照組，但方差分析結果表明轉基因南林895楊樹高與各自對照組之間的差異未達到顯著水平(P>0.05)。Bt系列的楊樹樹高高于TLP系列和Gols系列，推測與扦插時莖段的生長狀態(tài)差異相關。

圖4 轉基因楊樹樹高測量結果Fig.4 The height measurement of the transgenic poplars不同小寫字母表示數值在0.05水平上存在顯著性差異。The different lowercase letters mean significant differences among values at 0.05 level.

2.2 外源基因穩(wěn)定性及向土壤微生物轉移情況

采用PCR方法對不同外源基因在轉基因南林895楊中的遺傳穩(wěn)定性進行檢測，在3個系列的轉基因南林895楊葉片中，均擴增到轉化基因的特異性目的片段(Bt系列1 977 bp，TLP系列890 bp，Glos系列1 131 bp)，且與各基因保存質粒的陽性對照擴增片段大小一致，在對照組南林895楊中均未擴增到目的片段(圖5)，外源基因均穩(wěn)定存在于各轉基因系列南林895楊的基因組中。

對采集的土壤樣品，提取微生物總DNA后使用細菌16SrRNA基因的特異引物進行PCR擴增檢測(圖6a-c)，所有樣品均獲得相同目的片段，表明所取土壤微生物樣品均可用于基因轉移檢測。以質粒作為陽性對照，微生物總DNA作為檢測模板，根據不同的轉基因株系，利用特異性引物進行PCR檢測(圖6d-f)，結果表明僅在質粒當中擴增到目的片段，對照組及轉基因組土壤微生物樣品中均未檢測到目的片段，未發(fā)現轉基因南林895楊的外源基因向土壤微生物中產生轉移現象。

圖6 土壤微生物中16S rRNA基因及目的基因PCR檢測Fig.6 PCR detection of 16S rRNA gene and target gene in soil microorganismsM：DNA ladder；P：質粒；C：對照組；1-5:各轉基因株系的土壤樣品。a-c：16S rRNA基因PCR結果；d-f：目的基因PCR結果。M:DNA ladder;P:Plasmid;C:Control group;1-5:Soil samples of transgenic lines.a-c:PCR results of 16S rRNA gene;d-f:PCR results of target gene.

2.3 轉基因楊樹對土壤微生物的影響

采用平板培養(yǎng)的方式對土壤微生物進行檢測，以菌落形成數的對數作為衡量標準，分析轉基因南林895楊對于土壤微生物生長的影響(圖7)。在3個不同系列的轉基因南林895楊種植區(qū)域內，其土壤微生物種類及數量變化趨勢呈現一致性，真菌和放線菌菌落形成數的對數值(lgCFU·g-1DW)在1～4.5之間變動，總細菌菌落形成數的對數值(lgCFU·g-1DW)在3 ～7之間變動；不同月份間變化明顯，在2017年7月微生物數量較多，在2017年12月具有明顯的下降，經歷大幅波動后在2018年4月微生物數量又恢復到較多水平。根據測定數據進行方差分析，結果表明在轉基因楊樹對土壤微生物影響方面，不同株系間差異性不顯著，轉基因組與對照組之間同樣無顯著性差異，僅不同取樣時間的樣品間存在顯著性差異；結合氣溫及降水量結果(圖3)，可以發(fā)現土壤微生物數量與氣溫和降水量變化關系密切，受其變化影響顯著(P<0.05)，而轉基因南林895楊對土壤微生物的群落結構和生長未產生顯著影響。

圖7 轉基因楊樹對土壤微生物的影響Fig.7 Effects of transgenic poplars on soil microorganisms

2.4 轉基因楊樹的化感作用分析

轉基因植物的外源基因來源具有多樣性，編碼蛋白功能各異，因此分析轉基因植物的化感作用對于轉基因生物安全性分析必不可少。本研究采用“三明治”方法評估轉基因南林895楊對于萵苣種子萌發(fā)生長的影響(Kikuchietal.，2009)。

根據對不同培養(yǎng)條件下萵苣種子胚根和下胚軸生長的測量結果(表3)及統計分析(表4)，可以發(fā)現：轉基因南林895楊與正對照組(未轉基因南林895楊)數據間無顯著性差異，且不同轉基因株系間數據不存在顯著性差異，不同外源基因轉化的葉片處理對于萵苣種子胚根和下胚軸的生長并無顯著影響；有葉片組(轉基因南林895楊和正對照未轉基因南林895楊)與無葉片組(CK-)數據間存在顯著性差異(P<0.05)，且轉TLP系列南林895楊葉片對于胚根的萌發(fā)生長，不同月份樣品處理所得數據具有顯著性差異(P<0.05)，在另外2個轉基因系列中數據無顯著性差異，以上結果表明葉片的添加能夠對萵苣種子的胚根和下胚軸生長產生顯著影響，但外源基因對于萵苣種子胚根和下胚軸生長無顯著影響。

表3 轉基因楊樹對萵苣種子生長的影響Tab.3 Effect of transgenic poplars on growth of lettuce seed

表 4 轉基因楊樹對萵苣種子生長影響的統計分析Tab.4 Statistical analysis of the effect of transgenic poplars on lettuce seed growth

3 討論

自Fillatti等(1987)首次報道轉基因楊樹以來，轉基因樹木的環(huán)境釋放在世界范圍內引起廣泛的爭議，爭議的焦點在于轉基因樹木的安全性，其中包括：外源基因在轉基因植物體內的穩(wěn)定性；基因漂移可使近源物種攜帶優(yōu)勢基因從而影響遺傳多樣性；外源基因的預期和非預期效應，其功能表達對于轉基因樹木自身生長的影響及對非目標生物的潛在威脅；對周圍環(huán)境植物或微生物可能造成不利影響從而破壞環(huán)境生態(tài)；轉基因樹木花粉、花絮及可食部分等對于動物及人生命安全的危害(Gongetal.，2012；Kljujevetal.，2018)。

對轉基因樹木的安全性進行評估，需要分析外源基因在受體植物中的穩(wěn)定性以及基因插入引起的表型變異。本研究采用載體35S啟動子序列作為上游引物，以基因序列作為下游引物，對進入大田階段1年時間的轉基因南林895楊進行檢測，結果表明3種目的基因仍穩(wěn)定存在于轉基因楊樹基因組內。而外源基因的隨機插入，在改變轉基因樹木預期性狀的同時會產生非預期效應。轉CpTI基因的三倍體毛白楊(Populustomentosa)回交雜種的3個轉化株系中，有2個株系的樹高及地徑與未轉基因植株無顯著差異，另外1個株系的樹高和地徑顯著優(yōu)于未轉基因植株(Zhangetal.，2002)；在雜交楊(Populusalba×P.berolinensis)中過表達乙烯效應因子的編碼基因ERF，在無脅迫條件下，13個轉基因株系的樹高均顯著高于未轉基因楊樹(Lietal.，2009)；在三倍體毛白楊中轉入多拷貝rolB基因，1年后對其生長參數進行測定，結果表明轉基因楊樹樹高均低于未轉基因楊樹且各株系間差異顯著，rolB基因轉入位置的不同，導致基因表達量不同，從而造成轉基因植株之間的樹高差異(張曉軍等，2011)。本研究當中Bt系列和TLP系列轉基因楊樹的樹高平均值均低于對照組，Gols系列的轉基因楊樹樹高平均值均高于對照組，盡管存在生長差異，但方差分析表明轉基因楊樹樹高與對照組之間并無顯著性差異，3個外源基因的插入并未對南林895楊的樹高產生顯著影響。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統穩(wěn)定的重要支撐力，在土壤物質循環(huán)過程中發(fā)揮關鍵作用，是土壤生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定的重要表征。轉基因樹木種植大田后，其根系外泌物及外源基因可能會影響周圍土壤環(huán)境中的微生物群落結構，同時在微生物降解和吸收有機物的過程中進入其體內(Figueredoetal.，2018)。例如轉基因抗病植物可能會對非目標微生物多樣性及動態(tài)性產生影響，同時抗性基因也可在水平轉移上為細菌和真菌等土壤微生物提供選擇性優(yōu)勢。本研究以外源基因序列作為引物對土壤微生物進行檢測，結果表明外源基因未向環(huán)境微生物中產生轉移現象。盡管不同月份間土壤中真菌、細菌及放線菌數量變化明顯，但方差分析表明轉基因組與對照組之間無顯著性差異，群落結構變化受氣溫和降水影響顯著，轉基因楊樹未對土壤微生物群落產生顯著影響。相似的結果在轉基因陸地棉(Gossypiumhirsutum)和玉米(Zeamays)對土壤微生物影響的研究中有所報道。轉基因棉SGK321與非轉基因親本棉或常規(guī)棉根際土壤微生物種群在某些生育期和某些年份存在微小差異,主成分分析表明轉基因棉SGK321與非轉基因親本棉根際土壤中細菌、真菌和放線菌的數量沒有顯著差異(Zhangetal.，2014)。轉cry1Ab和epsps基因的玉米C0030.3.5根際土古細菌數量隨生長期的推進呈現先升高后降低的變化趨勢，但轉基因玉米與對照組間古菌豐度及群落結構均無顯著差異，古菌數量變化主要受生長時期影響(王晶等，2017)。

本研究所采用的試驗材料為南林895楊，均為雌株，不產生花粉，因此不存在花粉飄散形成的基因安全問題。但轉基因楊樹由于外源功能基因的插入，可能會通過根系分泌物、葉片及其殘體等影響環(huán)境中其他植物的生長(Aslametal.，2017)。本研究采用“三明治”法模擬轉基因楊樹的化感作用，評估轉基因南林895楊對于萵苣種子生長的影響，該方法能夠更直觀地反映外源基因在受體植物中表達所產生的影響(Kikuchietal.，2009)，結果表明有葉片組與無葉片組(CK-)數據間差異顯著(P<0.05)，葉片的存在能夠顯著影響萵苣種子的萌發(fā)生長，但不同外源基因的葉片間對于萵苣種子胚根和下胚軸的生長并無顯著影響，同時轉基因楊樹與對照組之間無顯著差異。盡管轉TLP系列南林895楊不同月份葉片樣品對萵苣種子生長影響的數據間具有顯著差異性(P<0.05)，但轉化基因并未顯著影響萵苣種子生長，推測與采集葉片的生長狀態(tài)有關。因此，3種外源基因對于萵苣種子胚根和下胚軸生長無顯著影響。

4 結論

本研究以進入田間試驗的3類(Bt、TLP和Gols)轉基因南林895楊為研究對象，對其外源基因的穩(wěn)定性、轉基因楊樹的生長、外源基因轉移及對環(huán)境微生物和植物等影響進行了初步評估分析，表明3種外源基因仍然穩(wěn)定存在于轉基因南林895楊中，外源基因對轉基因楊樹生長未產生顯著影響，3種外源基因沒有發(fā)生基因轉移現象，且未進入周圍土壤微生物基因組中，外源基因的表達對于土壤微生物群落結構無顯著影響，轉基因南林895楊葉片無顯著化感作用。綜上所述，本研究中Bt系列、TLP系列和Gols系列3類轉基因南林895楊在田間試驗中無明顯的環(huán)境危害。