吳志成 陳衛(wèi)布 宋美嘉 王小英 游 璠 吳志紅

1(北京大學深圳醫(yī)院 深圳 518036)

2(深圳市人民醫(yī)院 深圳 518020)

3(深圳市龍崗區(qū)慢性病防治院 深圳 518172)

4(中國科學院深圳先進技術研究院 深圳 518055)

5(深圳中科芯海智能科技有限公司 深圳 518116)

1 引 言

白細胞通常被稱為免疫細胞，具有細胞核，主要作用是吞噬病原微生物、防御疾病。臨床上，白細胞的檢測具有非常重要的意義。白細胞升高通常表明患者因細菌感染而導致身體組織和器官的急性或慢性炎癥反應或組織損傷，一般需要給予特定的抗生素治療以控制病情的發(fā)展和惡化[1-2]。對于基層醫(yī)生接診最多的上呼吸道感染病例來說，白細胞增高往往意味著細菌感染，需要給予抗生素治療，而白細胞正?；蚱蜁r，無需使用抗生素干預[3-4]，因此白細胞計數(shù)指標對抗生素用藥具有指導作用。在我國基層醫(yī)療衛(wèi)生單位(包括村衛(wèi)生室、社區(qū)衛(wèi)生站等)，由于缺乏白細胞測定的檢驗設備，醫(yī)生無從判斷患者是細菌還是病毒感染，因此均給予抗生素和抗病毒雙重治療，導致抗生素濫用[5-7]。基層醫(yī)療單位血細胞測定設備短缺的原因主要是現(xiàn)有常規(guī)血細胞檢驗設備體積龐大、價格昂貴、操作復雜、試劑消耗大，不適合在基層應用。因此，開發(fā)一種成本低廉、操作簡便的白細胞檢驗設備將能很好地適用于基層醫(yī)療單位，有效改善抗生素濫用的現(xiàn)狀。 隨著微流控技術的出現(xiàn)和發(fā)展，開發(fā)基于微流控技術的即時檢驗設備(Point-of-Care Testing，POCT)受到廣大研究者的青睞[8-9]?；谠摷夹g的即時檢驗設備正好適合基層醫(yī)療單位的使用場景。Wang 等[10]研發(fā)了基于微流控紙芯片平臺的快速檢測血糖血脂的 POCT 裝置，該技術有望應用于基層和家庭的個人血糖血脂檢測。該研究與本研究的市場目標類似，都致力于解決基層臨床檢驗設備短缺的難題，但檢測項目和原理均不相同。王小英等[11]研發(fā)了一款基于微流控流式細胞術的熒光微粒計數(shù)儀，該儀器對標準熒光微粒測試準確，并對添加了熒光染色劑的白細胞樣本也能準確計數(shù)。該研究與本研究所使用的技術手段都是微流控技術，但檢測原理不同、成本差異大。Zhou 等[12]加工了一種基于阻抗法對液體中顆粒計數(shù)的微流控芯片，將庫爾特計數(shù)小孔設計在通道側面，顆粒不需要上下穿過小孔就能實現(xiàn)計數(shù)，計數(shù)靈敏度高，可計數(shù) 1 μm 直徑的粒子。Lee 等[13]開發(fā)了一款基于微流控技術的細胞計數(shù)平臺，可在芯片上處理腦脊液樣本并分別計數(shù)其中的白細胞數(shù)和紅細胞。盡管上述的研究都充分利用了微流控技術體積小、功能集中等特點，但目前仍僅局限于實驗室研究，均未形成商品化產(chǎn)品。

作為一種新的技術手段，微流控技術的產(chǎn)業(yè)化應用鮮見報道。針對基層檢驗設備短缺的現(xiàn)狀，本文研發(fā)了一款適合在基層醫(yī)療單位推廣應用的微流控血細胞分析儀。本研究設備創(chuàng)造性地利用多層復合結構的微流控芯片代替?zhèn)鹘y(tǒng)血液檢測設備的液路系統(tǒng)，將液體完全封存于芯片內，使其與主機徹底隔離。同時，本研究設備利用微流控技術實現(xiàn)對微量液體的精準控制，結合經(jīng)典的庫爾特原理，實現(xiàn)微?；蚣毎脑谄鳌⒃谄瑱z測。這一創(chuàng)新性的研究成果已獲得了我國食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的醫(yī)療器械注冊證，是目前全球首款獲批微流控白細胞檢測儀的產(chǎn)品。本文通過將所研發(fā)設備對商業(yè)化的標準粒子檢測情況，及臨床樣本雙盲實驗的實際檢測，來評價其性能和實際的應用效果。

2 實驗材料與方法

2.1 儀器與試劑

微流控細胞分析儀 C S 1 7 0 0(序列號：1710001-0001、1710001-0002，深圳中科芯海智能科技有限公司)；白細胞分析用溶血劑(深圳中科芯海智能科技有限公司)；微流控芯片(深圳中科芯海智能科技有限公司)；標準粒子(貨號 4K-03、4K-05、4K-10，美國賽默飛世爾科技公司)；血細胞分析儀 XN20(希森美康)，希森美康 XN20 使用配套的溯源性校準品、質控品和原裝試劑。

2.2 實驗方法

2.2.1 微流控芯片設計及庫爾特阻抗法原理

采用 Coreldraw 和 autoCAD 等制圖軟件設計微流控芯片流道和構型。通過 GAMBIT 及 Fluent 軟件對流道及構型進行了建模及仿真，對其可能產(chǎn)生的“液體死角”現(xiàn)象進行了分析并對流道構型進行了改進。對于影響流體形態(tài)及寬度的外界因素(微通道結構、微泵抽吸壓力及抽吸時間等)進行了仿真分析，并用 SPSS 回歸分析進行了分析，確定了影響流道寬度的主要因素。試驗對比了實際流體形態(tài)與仿真結果，二者具有較好的一致性。

芯片主要材質為高分子聚合物。通過沖壓成型、印刷、對準封裝等步驟完成芯片的制作。該微流控芯片結構分為 5 層，通過虹吸和負壓驅動液體在上下各層間穿梭流動。其中，庫爾特檢測小孔位于芯片的中間層，液體由下往上通過檢測小孔實現(xiàn)庫爾特阻抗計數(shù)，具體如圖 1 所示。

2.2.2 標準粒子測試

將濃度為 5.00×1010/L、直徑為 2.995 μm，濃度為 1.00×1010/L、直徑為 4.993 μm，濃度為 1.00×109/L、直徑為 10.120 μm 的標準粒子溶液，分別在 CS1700 上重復測定 10 次，然后計算變異系數(shù) CV(Coefficient of Variation)。

圖 1 微流控芯片結構示意圖Fig. 1 Structure diagram of microfluidic chip

2.2.3 臨床樣本測試

在北京大學深圳醫(yī)院和深圳市人民醫(yī)院各選取臨床血液樣本 120 例。樣本均為醫(yī)院患者臨床檢測所剩的離體 EDTA-2K 抗凝血樣本。試驗以希森美康 XN20 上的白細胞測試值為對照值，以 CS1700 上的白細胞測試值為試驗值，采用統(tǒng)計學方法分析兩者的相關性和一致性等[14]。

3 結 果

3.1 設備及芯片外觀

本文中所用微流控芯片為深圳中科芯海智能科技有限公司設計和生產(chǎn)的多層復合結構的微流控芯片，其外觀如圖 2(a)所示，芯片長、寬、高分別為：76 mm、20 mm 和 1.2 mm。CS1700 外觀如圖 2(b) 所示，外觀長、寬、高分別為：25 cm、12 cm 和 26 cm。

3.2 標準粒子測試結果

3.2.1 標準粒子脈沖信號

庫爾特電阻抗計數(shù)法的原理是懸浮在電解液中的顆粒隨電解液通過小孔管時，取代相同體積的電解液，在恒電流設計的電路中導致小孔管內外兩電極間電阻發(fā)生瞬時變化，產(chǎn)生電位脈沖。脈沖信號的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比[15-16]。圖 3(a)、(b)和(c)分別是本文在測試標準粒子(3 μm、5 μm 和 10 μm)時的脈沖信號，圖 3(d)是在顯微鏡下捕捉的 3 μm 粒子通過計數(shù)小孔(直徑 40 μm)時的瞬時照片。

圖 2 微流控芯片和 CS1700 Fig. 2 Microfluidic chip and CS1700

圖 3 檢測脈沖信號和粒子過孔瞬間照片F(xiàn)ig. 3 Pulse signals of particles test and instant image of particle passing through orifice

表 1 標準粒子計數(shù)結果Table 1 Count results of standard particle

3.2.2 標準粒子計數(shù)結果

將直徑和濃度不同的 3 種標準粒子分別在 CS1700 上各重復測定 10 次，統(tǒng)計測試結果均值和變異系數(shù)，結果如表 1 所示。從表 1 可看出，設備對不同濃度、不同直徑的標準粒子的計數(shù)結果重復性良好。

3.3 臨床樣本測試結果

3.3.1 臨床樣本入選情況匯總

根據(jù)醫(yī)院檢驗科血細胞分析儀希森美康 XN20 上的白細胞測試結果，共選取了 240 個樣本，具體分布如表 2 所示。隨后以希森美康 XN20 上的白細胞測試值為對照值，以 CS1700 上的白細胞測試值為試驗值進行統(tǒng)計學分析。

3.3.2 相關性及回歸分析

設測試值為 Y，相對應的對照值為 X 作散點圖，結果如圖 4 所示。從圖 4 可看出，線性回歸系數(shù) R2＝0.999 7＞0.95，表明兩設備(XN20 和 CS1700)相關性良好。

表 2 入組樣本分布情況Table 2 Distribution of enrolled samples

圖 4 散點圖Fig. 4 Scatter diagram

3.3.3 Bland-Altman 一致性分析

根據(jù)測試值和對照值計算出一致性界限(均值±1.96 標準差)及一致性界限上下限的 95% 可信區(qū)間。如果 95% 的點都在一致性區(qū)間內，那么認為兩種方法的定量測定結果一致性好[17]。試驗設備與對照設備測量值的 Bland-Altman 圖如圖 5：全部樣本共 240 例，位于一致區(qū)間內的點有 228 例(95%)。這表明，試驗設備與對照設備具有良好的一致性。

圖 5 樣本 Bland-Altman 圖Fig. 5 Bland-Altman figure

3.3.4 醫(yī)學決定水平預期偏倚

根據(jù)前面已建立的回歸方程，以醫(yī)學決定水平作為自變量(Xc)，計算因變量(Yc)，再依據(jù) Xc和 Yc算出預期偏倚(Bc)、系統(tǒng)誤差(System Error，SE)和相對偏倚[18]。以美國臨床實驗室改進修正法案(CLIA88)中規(guī)定的總容許誤差(Total Allowable Error，TAe)的 1/5 作為判斷標準：當系統(tǒng)誤差 SE 小于或等于 1/5 TAe 時，則認為偏倚可接受；當系統(tǒng)誤差 SE大于 1/5 TAe 時，則認為偏倚不可接受。將醫(yī)學決定水平 Xc＝3.00×109/L、11.00×109/L和 30.00×109/L，代入回歸方程，計算系統(tǒng)誤差 SE。獲得 SE 分別為 2.12%、0.54% 和 0.17%，參考臨床可接受性能的判斷標準[SE＝3%＜1/5 TAe]可知，3 個水平均可接受[19]。具體計算結果如表 3 所示。

4 討論與分析

試驗結果顯示，微流控白細胞分析儀 CS1700 及其配套的微流控芯片，對標準粒子的重復測定實驗，變異系數(shù)均不大于 5%，精密度良好。在兩家具有臨床試驗資格的醫(yī)療機構進行臨床試驗，共完成血液樣本 240 例，其中正常值樣本 70%，異常值樣本 30%(異常高值及異常低值比例為 1∶1)。CS1700 和 XN20 測定結果相關性強(R2＝0.999 7)，回歸方程 Y＝0.999 5X＋0.065 2；試驗設備與對照設備測量值的 Bland-Altman 作圖可知，95% 的點在一致性區(qū)間內，表明試驗設備與對照設備具有良好的一致性；北京大學深圳醫(yī)院和深圳市人民醫(yī)院的臨床試驗中心合計醫(yī)學決定水平處的預期偏倚及可信區(qū)間分析顯示，白細胞計數(shù)在 3 個醫(yī)學決定水平處(3.00×109/L、11.00×109/L 和 30.00×109/L)的可接受誤差均小于 1/5 TAe，表明兩個試驗設備檢測結果的偏倚在各醫(yī)學決定水平處均可以接受。上述兩實驗中心均沒有出現(xiàn)影響整機安全性的情況，試驗設備與對照設備的質控記錄均在各自的質控靶值范圍，穩(wěn)定性良好。試驗期間，試驗組和對照組均未出現(xiàn)任何不良事件和嚴重不良事件。

表 3 醫(yī)學決定水平處的相對偏倚百分比Table 3 Relative bias at the medical decision levels

經(jīng)過比對試驗發(fā)現(xiàn)，基于微流控芯片的白細胞檢測平臺具有以下優(yōu)勢：(1)檢測靈敏度高，對白細胞的測試靈敏度比血細胞行業(yè)標準高出 1 個數(shù)量級，達到 0.01×109/L。本文選取了 0.02×109/L、0.04×109/L、0.05×109/L 和 0.08×109/L 四個低濃度血液樣本進行測試，與對照機的相對偏差分別為 0、0、6.67% 和 4.17%，均低于行業(yè)標準范圍的 1/2(即 7.5%)。同時，這些樣本也進行了鏡檢復檢，結果與機器測試結果高度一致。(2)由于液體與設備完全分隔，芯片即用即拋，完全摒棄了傳統(tǒng)的清洗維護等步驟，使用簡便。同時，液路的一次性使用也杜絕了攜帶污染，保證結果的準確。與傳統(tǒng)的血細胞分析設備特征指標相比，CS1700 具有便攜、無攜帶污染、所需試劑少、靈敏度高、無需專業(yè)人員操作等優(yōu)點。

表 4 CS1700 與傳統(tǒng)血細胞分析儀的比較Table 4 Comparison of CS1700 and traditional hematology analyzer

但目前該設備也存在一些缺陷：(1)功能單一，僅能測試白細胞總數(shù)，后續(xù)需盡快完善對白細胞的分類功能；(2)缺乏對有核紅細胞分辨的功能。在臨床樣本測試過程中，對于幾個在 XN20 上提示有核紅細胞增多的樣本，我們在 CS1700 上進行了測試，發(fā)現(xiàn)其測試的白細胞值比 XN20 上報道的白細胞值高。因此，推測 CS1700 把有核紅細胞計算在白細胞總數(shù)內，表明 CS1700 在進行白細胞計數(shù)時，不能排除有核紅細胞的干擾，這也對后續(xù)的改進及升級提出了進一步的要求。

5 結 論

本文是我國及全球首款獲得微流控白細胞分析設備醫(yī)療器械注冊證的 POCT 儀器臨床應用研究，首次公布了該設備在標準粒子檢測、臨床雙中心試驗的結果。雖然微流控技術從提出至今廣受矚目，但真正應用于產(chǎn)業(yè)化的產(chǎn)品十分鮮見，應用于臨床血液細胞的快檢設備，更屬首次。為了確保臨床使用的準確性及一致性，本文利用微流控技術實現(xiàn)對微量液體的精準控制，結合庫爾特阻抗計數(shù)法，用多層復合結構的微流控芯片代替?zhèn)鹘y(tǒng)的液路系統(tǒng)，實現(xiàn)了微流控技術在臨床快檢領域的產(chǎn)業(yè)化應用。臨床測試表明，該設備及配套芯片的檢測結果，與業(yè)內公認的高端設備希森美康 XN20 的測試結果具有可比性。但目前該設備依然有較大的技術提升空間，為后續(xù)研發(fā)指明了方向?；谖⒘骺丶夹g實現(xiàn) POCT 檢驗設備研發(fā)和應用的逐步發(fā)展和成熟，將助力分級診療，完善基層醫(yī)療機構的檢驗手段與診斷水平。