吳志成 陳衛(wèi)布 宋美嘉 王小英 游 璠 吳志紅

1(北京大學(xué)深圳醫(yī)院 深圳 518036)

2(深圳市人民醫(yī)院 深圳 518020)

3(深圳市龍崗區(qū)慢性病防治院 深圳 518172)

4(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

5(深圳中科芯海智能科技有限公司 深圳 518116)

1 引 言

白細(xì)胞通常被稱為免疫細(xì)胞，具有細(xì)胞核，主要作用是吞噬病原微生物、防御疾病。臨床上，白細(xì)胞的檢測具有非常重要的意義。白細(xì)胞升高通常表明患者因細(xì)菌感染而導(dǎo)致身體組織和器官的急性或慢性炎癥反應(yīng)或組織損傷，一般需要給予特定的抗生素治療以控制病情的發(fā)展和惡化[1-2]。對于基層醫(yī)生接診最多的上呼吸道感染病例來說，白細(xì)胞增高往往意味著細(xì)菌感染，需要給予抗生素治療，而白細(xì)胞正?；蚱蜁r(shí)，無需使用抗生素干預(yù)[3-4]，因此白細(xì)胞計(jì)數(shù)指標(biāo)對抗生素用藥具有指導(dǎo)作用。在我國基層醫(yī)療衛(wèi)生單位(包括村衛(wèi)生室、社區(qū)衛(wèi)生站等)，由于缺乏白細(xì)胞測定的檢驗(yàn)設(shè)備，醫(yī)生無從判斷患者是細(xì)菌還是病毒感染，因此均給予抗生素和抗病毒雙重治療，導(dǎo)致抗生素濫用[5-7]?；鶎俞t(yī)療單位血細(xì)胞測定設(shè)備短缺的原因主要是現(xiàn)有常規(guī)血細(xì)胞檢驗(yàn)設(shè)備體積龐大、價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、試劑消耗大，不適合在基層應(yīng)用。因此，開發(fā)一種成本低廉、操作簡便的白細(xì)胞檢驗(yàn)設(shè)備將能很好地適用于基層醫(yī)療單位，有效改善抗生素濫用的現(xiàn)狀。 隨著微流控技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，開發(fā)基于微流控技術(shù)的即時(shí)檢驗(yàn)設(shè)備(Point-of-Care Testing，POCT)受到廣大研究者的青睞[8-9]?；谠摷夹g(shù)的即時(shí)檢驗(yàn)設(shè)備正好適合基層醫(yī)療單位的使用場景。Wang 等[10]研發(fā)了基于微流控紙芯片平臺(tái)的快速檢測血糖血脂的 POCT 裝置，該技術(shù)有望應(yīng)用于基層和家庭的個(gè)人血糖血脂檢測。該研究與本研究的市場目標(biāo)類似，都致力于解決基層臨床檢驗(yàn)設(shè)備短缺的難題，但檢測項(xiàng)目和原理均不相同。王小英等[11]研發(fā)了一款基于微流控流式細(xì)胞術(shù)的熒光微粒計(jì)數(shù)儀，該儀器對標(biāo)準(zhǔn)熒光微粒測試準(zhǔn)確，并對添加了熒光染色劑的白細(xì)胞樣本也能準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。該研究與本研究所使用的技術(shù)手段都是微流控技術(shù)，但檢測原理不同、成本差異大。Zhou 等[12]加工了一種基于阻抗法對液體中顆粒計(jì)數(shù)的微流控芯片，將庫爾特計(jì)數(shù)小孔設(shè)計(jì)在通道側(cè)面，顆粒不需要上下穿過小孔就能實(shí)現(xiàn)計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)靈敏度高，可計(jì)數(shù) 1 μm 直徑的粒子。Lee 等[13]開發(fā)了一款基于微流控技術(shù)的細(xì)胞計(jì)數(shù)平臺(tái)，可在芯片上處理腦脊液樣本并分別計(jì)數(shù)其中的白細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞。盡管上述的研究都充分利用了微流控技術(shù)體積小、功能集中等特點(diǎn)，但目前仍僅局限于實(shí)驗(yàn)室研究，均未形成商品化產(chǎn)品。

作為一種新的技術(shù)手段，微流控技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用鮮見報(bào)道。針對基層檢驗(yàn)設(shè)備短缺的現(xiàn)狀，本文研發(fā)了一款適合在基層醫(yī)療單位推廣應(yīng)用的微流控血細(xì)胞分析儀。本研究設(shè)備創(chuàng)造性地利用多層復(fù)合結(jié)構(gòu)的微流控芯片代替?zhèn)鹘y(tǒng)血液檢測設(shè)備的液路系統(tǒng)，將液體完全封存于芯片內(nèi)，使其與主機(jī)徹底隔離。同時(shí)，本研究設(shè)備利用微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)對微量液體的精準(zhǔn)控制，結(jié)合經(jīng)典的庫爾特原理，實(shí)現(xiàn)微?；蚣?xì)胞的在片整流、在片檢測。這一創(chuàng)新性的研究成果已獲得了我國食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的醫(yī)療器械注冊證，是目前全球首款獲批微流控白細(xì)胞檢測儀的產(chǎn)品。本文通過將所研發(fā)設(shè)備對商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)粒子檢測情況，及臨床樣本雙盲實(shí)驗(yàn)的實(shí)際檢測，來評價(jià)其性能和實(shí)際的應(yīng)用效果。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 儀器與試劑

微流控細(xì)胞分析儀 C S 1 7 0 0(序列號(hào)：1710001-0001、1710001-0002，深圳中科芯海智能科技有限公司)；白細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)?深圳中科芯海智能科技有限公司)；微流控芯片(深圳中科芯海智能科技有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)粒子(貨號(hào) 4K-03、4K-05、4K-10，美國賽默飛世爾科技公司)；血細(xì)胞分析儀 XN20(希森美康)，希森美康 XN20 使用配套的溯源性校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和原裝試劑。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 微流控芯片設(shè)計(jì)及庫爾特阻抗法原理

采用 Coreldraw 和 autoCAD 等制圖軟件設(shè)計(jì)微流控芯片流道和構(gòu)型。通過 GAMBIT 及 Fluent 軟件對流道及構(gòu)型進(jìn)行了建模及仿真，對其可能產(chǎn)生的“液體死角”現(xiàn)象進(jìn)行了分析并對流道構(gòu)型進(jìn)行了改進(jìn)。對于影響流體形態(tài)及寬度的外界因素(微通道結(jié)構(gòu)、微泵抽吸壓力及抽吸時(shí)間等)進(jìn)行了仿真分析，并用 SPSS 回歸分析進(jìn)行了分析，確定了影響流道寬度的主要因素。試驗(yàn)對比了實(shí)際流體形態(tài)與仿真結(jié)果，二者具有較好的一致性。

芯片主要材質(zhì)為高分子聚合物。通過沖壓成型、印刷、對準(zhǔn)封裝等步驟完成芯片的制作。該微流控芯片結(jié)構(gòu)分為 5 層，通過虹吸和負(fù)壓驅(qū)動(dòng)液體在上下各層間穿梭流動(dòng)。其中，庫爾特檢測小孔位于芯片的中間層，液體由下往上通過檢測小孔實(shí)現(xiàn)庫爾特阻抗計(jì)數(shù)，具體如圖 1 所示。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)粒子測試

將濃度為 5.00×1010/L、直徑為 2.995 μm，濃度為 1.00×1010/L、直徑為 4.993 μm，濃度為 1.00×109/L、直徑為 10.120 μm 的標(biāo)準(zhǔn)粒子溶液，分別在 CS1700 上重復(fù)測定 10 次，然后計(jì)算變異系數(shù) CV(Coefficient of Variation)。

圖 1 微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Structure diagram of microfluidic chip

2.2.3 臨床樣本測試

在北京大學(xué)深圳醫(yī)院和深圳市人民醫(yī)院各選取臨床血液樣本 120 例。樣本均為醫(yī)院患者臨床檢測所剩的離體 EDTA-2K 抗凝血樣本。試驗(yàn)以希森美康 XN20 上的白細(xì)胞測試值為對照值，以 CS1700 上的白細(xì)胞測試值為試驗(yàn)值，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析兩者的相關(guān)性和一致性等[14]。

3 結(jié) 果

3.1 設(shè)備及芯片外觀

本文中所用微流控芯片為深圳中科芯海智能科技有限公司設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的多層復(fù)合結(jié)構(gòu)的微流控芯片，其外觀如圖 2(a)所示，芯片長、寬、高分別為：76 mm、20 mm 和 1.2 mm。CS1700 外觀如圖 2(b) 所示，外觀長、寬、高分別為：25 cm、12 cm 和 26 cm。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)粒子測試結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)粒子脈沖信號(hào)

庫爾特電阻抗計(jì)數(shù)法的原理是懸浮在電解液中的顆粒隨電解液通過小孔管時(shí)，取代相同體積的電解液，在恒電流設(shè)計(jì)的電路中導(dǎo)致小孔管內(nèi)外兩電極間電阻發(fā)生瞬時(shí)變化，產(chǎn)生電位脈沖。脈沖信號(hào)的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比[15-16]。圖 3(a)、(b)和(c)分別是本文在測試標(biāo)準(zhǔn)粒子(3 μm、5 μm 和 10 μm)時(shí)的脈沖信號(hào)，圖 3(d)是在顯微鏡下捕捉的 3 μm 粒子通過計(jì)數(shù)小孔(直徑 40 μm)時(shí)的瞬時(shí)照片。

圖 2 微流控芯片和 CS1700 Fig. 2 Microfluidic chip and CS1700

圖 3 檢測脈沖信號(hào)和粒子過孔瞬間照片F(xiàn)ig. 3 Pulse signals of particles test and instant image of particle passing through orifice

表 1 標(biāo)準(zhǔn)粒子計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Count results of standard particle

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)粒子計(jì)數(shù)結(jié)果

將直徑和濃度不同的 3 種標(biāo)準(zhǔn)粒子分別在 CS1700 上各重復(fù)測定 10 次，統(tǒng)計(jì)測試結(jié)果均值和變異系數(shù)，結(jié)果如表 1 所示。從表 1 可看出，設(shè)備對不同濃度、不同直徑的標(biāo)準(zhǔn)粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果重復(fù)性良好。

3.3 臨床樣本測試結(jié)果

3.3.1 臨床樣本入選情況匯總

根據(jù)醫(yī)院檢驗(yàn)科血細(xì)胞分析儀希森美康 XN20 上的白細(xì)胞測試結(jié)果，共選取了 240 個(gè)樣本，具體分布如表 2 所示。隨后以希森美康 XN20 上的白細(xì)胞測試值為對照值，以 CS1700 上的白細(xì)胞測試值為試驗(yàn)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3.3.2 相關(guān)性及回歸分析

設(shè)測試值為 Y，相對應(yīng)的對照值為 X 作散點(diǎn)圖，結(jié)果如圖 4 所示。從圖 4 可看出，線性回歸系數(shù) R2＝0.999 7＞0.95，表明兩設(shè)備(XN20 和 CS1700)相關(guān)性良好。

表 2 入組樣本分布情況Table 2 Distribution of enrolled samples

圖 4 散點(diǎn)圖Fig. 4 Scatter diagram

3.3.3 Bland-Altman 一致性分析

根據(jù)測試值和對照值計(jì)算出一致性界限(均值±1.96 標(biāo)準(zhǔn)差)及一致性界限上下限的 95% 可信區(qū)間。如果 95% 的點(diǎn)都在一致性區(qū)間內(nèi)，那么認(rèn)為兩種方法的定量測定結(jié)果一致性好[17]。試驗(yàn)設(shè)備與對照設(shè)備測量值的 Bland-Altman 圖如圖 5：全部樣本共 240 例，位于一致區(qū)間內(nèi)的點(diǎn)有 228 例(95%)。這表明，試驗(yàn)設(shè)備與對照設(shè)備具有良好的一致性。

圖 5 樣本 Bland-Altman 圖Fig. 5 Bland-Altman figure

3.3.4 醫(yī)學(xué)決定水平預(yù)期偏倚

根據(jù)前面已建立的回歸方程，以醫(yī)學(xué)決定水平作為自變量(Xc)，計(jì)算因變量(Yc)，再依據(jù) Xc和 Yc算出預(yù)期偏倚(Bc)、系統(tǒng)誤差(System Error，SE)和相對偏倚[18]。以美國臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正法案(CLIA88)中規(guī)定的總?cè)菰S誤差(Total Allowable Error，TAe)的 1/5 作為判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)系統(tǒng)誤差 SE 小于或等于 1/5 TAe 時(shí)，則認(rèn)為偏倚可接受；當(dāng)系統(tǒng)誤差 SE大于 1/5 TAe 時(shí)，則認(rèn)為偏倚不可接受。將醫(yī)學(xué)決定水平 Xc＝3.00×109/L、11.00×109/L和 30.00×109/L，代入回歸方程，計(jì)算系統(tǒng)誤差 SE。獲得 SE 分別為 2.12%、0.54% 和 0.17%，參考臨床可接受性能的判斷標(biāo)準(zhǔn)[SE＝3%＜1/5 TAe]可知，3 個(gè)水平均可接受[19]。具體計(jì)算結(jié)果如表 3 所示。

4 討論與分析

試驗(yàn)結(jié)果顯示，微流控白細(xì)胞分析儀 CS1700 及其配套的微流控芯片，對標(biāo)準(zhǔn)粒子的重復(fù)測定實(shí)驗(yàn)，變異系數(shù)均不大于 5%，精密度良好。在兩家具有臨床試驗(yàn)資格的醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，共完成血液樣本 240 例，其中正常值樣本 70%，異常值樣本 30%(異常高值及異常低值比例為 1∶1)。CS1700 和 XN20 測定結(jié)果相關(guān)性強(qiáng)(R2＝0.999 7)，回歸方程 Y＝0.999 5X＋0.065 2；試驗(yàn)設(shè)備與對照設(shè)備測量值的 Bland-Altman 作圖可知，95% 的點(diǎn)在一致性區(qū)間內(nèi)，表明試驗(yàn)設(shè)備與對照設(shè)備具有良好的一致性；北京大學(xué)深圳醫(yī)院和深圳市人民醫(yī)院的臨床試驗(yàn)中心合計(jì)醫(yī)學(xué)決定水平處的預(yù)期偏倚及可信區(qū)間分析顯示，白細(xì)胞計(jì)數(shù)在 3 個(gè)醫(yī)學(xué)決定水平處(3.00×109/L、11.00×109/L 和 30.00×109/L)的可接受誤差均小于 1/5 TAe，表明兩個(gè)試驗(yàn)設(shè)備檢測結(jié)果的偏倚在各醫(yī)學(xué)決定水平處均可以接受。上述兩實(shí)驗(yàn)中心均沒有出現(xiàn)影響整機(jī)安全性的情況，試驗(yàn)設(shè)備與對照設(shè)備的質(zhì)控記錄均在各自的質(zhì)控靶值范圍，穩(wěn)定性良好。試驗(yàn)期間，試驗(yàn)組和對照組均未出現(xiàn)任何不良事件和嚴(yán)重不良事件。

表 3 醫(yī)學(xué)決定水平處的相對偏倚百分比Table 3 Relative bias at the medical decision levels

經(jīng)過比對試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基于微流控芯片的白細(xì)胞檢測平臺(tái)具有以下優(yōu)勢：(1)檢測靈敏度高，對白細(xì)胞的測試靈敏度比血細(xì)胞行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)高出 1 個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到 0.01×109/L。本文選取了 0.02×109/L、0.04×109/L、0.05×109/L 和 0.08×109/L 四個(gè)低濃度血液樣本進(jìn)行測試，與對照機(jī)的相對偏差分別為 0、0、6.67% 和 4.17%，均低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)范圍的 1/2(即 7.5%)。同時(shí)，這些樣本也進(jìn)行了鏡檢復(fù)檢，結(jié)果與機(jī)器測試結(jié)果高度一致。(2)由于液體與設(shè)備完全分隔，芯片即用即拋，完全摒棄了傳統(tǒng)的清洗維護(hù)等步驟，使用簡便。同時(shí)，液路的一次性使用也杜絕了攜帶污染，保證結(jié)果的準(zhǔn)確。與傳統(tǒng)的血細(xì)胞分析設(shè)備特征指標(biāo)相比，CS1700 具有便攜、無攜帶污染、所需試劑少、靈敏度高、無需專業(yè)人員操作等優(yōu)點(diǎn)。

表 4 CS1700 與傳統(tǒng)血細(xì)胞分析儀的比較Table 4 Comparison of CS1700 and traditional hematology analyzer

但目前該設(shè)備也存在一些缺陷：(1)功能單一，僅能測試白細(xì)胞總數(shù)，后續(xù)需盡快完善對白細(xì)胞的分類功能；(2)缺乏對有核紅細(xì)胞分辨的功能。在臨床樣本測試過程中，對于幾個(gè)在 XN20 上提示有核紅細(xì)胞增多的樣本，我們在 CS1700 上進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)其測試的白細(xì)胞值比 XN20 上報(bào)道的白細(xì)胞值高。因此，推測 CS1700 把有核紅細(xì)胞計(jì)算在白細(xì)胞總數(shù)內(nèi)，表明 CS1700 在進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，不能排除有核紅細(xì)胞的干擾，這也對后續(xù)的改進(jìn)及升級(jí)提出了進(jìn)一步的要求。

5 結(jié) 論

本文是我國及全球首款獲得微流控白細(xì)胞分析設(shè)備醫(yī)療器械注冊證的 POCT 儀器臨床應(yīng)用研究，首次公布了該設(shè)備在標(biāo)準(zhǔn)粒子檢測、臨床雙中心試驗(yàn)的結(jié)果。雖然微流控技術(shù)從提出至今廣受矚目，但真正應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化的產(chǎn)品十分鮮見，應(yīng)用于臨床血液細(xì)胞的快檢設(shè)備，更屬首次。為了確保臨床使用的準(zhǔn)確性及一致性，本文利用微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)對微量液體的精準(zhǔn)控制，結(jié)合庫爾特阻抗計(jì)數(shù)法，用多層復(fù)合結(jié)構(gòu)的微流控芯片代替?zhèn)鹘y(tǒng)的液路系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了微流控技術(shù)在臨床快檢領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。臨床測試表明，該設(shè)備及配套芯片的檢測結(jié)果，與業(yè)內(nèi)公認(rèn)的高端設(shè)備希森美康 XN20 的測試結(jié)果具有可比性。但目前該設(shè)備依然有較大的技術(shù)提升空間，為后續(xù)研發(fā)指明了方向。基于微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn) POCT 檢驗(yàn)設(shè)備研發(fā)和應(yīng)用的逐步發(fā)展和成熟，將助力分級(jí)診療，完善基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的檢驗(yàn)手段與診斷水平。