蔣鳳，朱靜和，劉青員，于建秀

濱?？h人民醫(yī)院內(nèi)分泌科1、檢驗科2，江蘇 鹽城 224500

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病的一種微血管并發(fā)癥，患病率約為30%，而高達(dá)50%的患者在患病期間肯定會發(fā)展成神經(jīng)病變[1]。高血糖在糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病機制中起著重要作用，它通過激活醛糖還原酶導(dǎo)致山梨醇水平升高，導(dǎo)致周圍神經(jīng)細(xì)胞損傷和肌醇降低，從而導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)所必需的Na+/K+-ATP酶活性降低[2]。最近的研究表明，NLRP3 炎性體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)激活與各種繼發(fā)性糖尿病并發(fā)癥以及糖尿病引起的炎癥性并發(fā)癥(如心血管疾病)的病理生理有關(guān)[3-4]。但高血糖誘導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)在糖尿病周圍神經(jīng)病變中的作用尚不清楚。本研究通過調(diào)查醛糖還原酶抑制劑對高糖誘導(dǎo)的單核細(xì)胞NLRP3 炎性體的調(diào)控，探討其在糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生發(fā)展過程中的潛在治療作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019 年7 月至2020年1月濱?？h人民醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的90例2型糖尿病(T2DM)患者的臨床資料，其中DPN組患者45例，非DPN (NDPN)組患者45 例，同時選取同期在本院體檢的健康人群45例作為對照組。DPN診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國糖尿病防治指南》[5]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對照組下肢神經(jīng)傳導(dǎo)檢查顯示無多神經(jīng)病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：中毒性周圍神經(jīng)病變、重癥肌無力等神經(jīng)系統(tǒng)疾?。幌到y(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等血管炎性疾病；急性傳染病者；近期服用營養(yǎng)神經(jīng)、抗氧化藥物等；整體狀態(tài)差無法配合檢查者。三組受檢者在年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性，見表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號2019-03)，所有受檢者均簽署知情同意書。

表1 三組受檢者的臨床資料比較(±s)

表1 三組受檢者的臨床資料比較(±s)

注：分別與對照組比較，aP＜0.05。

組別DPN組NDPN組對照組t/F/χ2值P值例數(shù)45 45 45年齡(歲)61.05±5.03 60.21±4.88 59.83±4.61 0.747 7 0.475 4男/女(例)25/20 23/22 23/22 0.237 7 0.888 0 BMI (kg/m2)24.41±3.26 24.37±3.15 23.57±3.06 1.013 0.365 8病史(年)12.34±2.53 11.51±2.33-1.619 0.109 1空腹血糖(mmol/L)9.11±3.25a 8.63±3.07a 4.77±1.65 33.65＜0.01糖化血紅蛋白(%)8.34±2.79a 8.12 ±2.68a 5.36±2.31 18.34＜0.01

1.2 儀器和試劑 實時定量PCR儀7500、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒均 購 自Applied Biosystems；Trizol 購 自Invitrogen 公司；采用上海恒信公司提供的Ficoll-HyPaque 分離液分離外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)；D-葡萄糖粉購自Sigma 公司；RPMI 1640 購自美國Gibco；細(xì)胞因子IL-1β及IL-18檢測試劑盒購自美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血采集 抽取三組受檢者靜脈血8 mL，4 mL 離心分離血清，用于空腹血糖及胰島素檢測；剩余2 mL 全血用于糖化血紅蛋白檢測，2 mL 離心分離血清，存于-80℃，用于批量檢測IL-1β、IL-18濃度。

1.3.2 Liminex200 檢測三組受檢者血清IL-1β、IL-18 濃度 取出上述-80℃保存的血清，室溫融化，根據(jù)試劑說明書提供的操作步驟檢測組患者血清IL-1β、IL-18濃度，每個標(biāo)本檢測兩次，取均值。

1.3.3 RT-PCR法檢測三組受檢者PBMCs中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA 水平 采用Ficoll-HyPaque分離液制備PBMCs，Trizol試劑提取PBMC中總RNA，然后通過cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將及QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒擴增NLRP3、ASC、Caspase-1。引物設(shè)計如下：NLRP3，正義鏈：GCTGCGATCAACAGGAGAGA，反 義 鏈：GCTCACACTCTCACCCAGA；ASC，正義鏈：AAGCCAGGCCTGCACTTTAT，反義鏈：AGAGCTTCCGCATCTTGCTT；Caspase-1，正義鏈：CATCCCACAATGGGCTCTGT，反義鏈：TTCACTCTTTCAGTGGTGGGC；β-actin ：正義鏈：GGGAAATCGTGCGTGACATT 反義鏈：GGAAG GAAGGCTGGAAGAGT。PCR 反應(yīng)條件如下：50℃2 min，95℃預(yù)變性2 min，95℃預(yù)變性15 s，60℃預(yù)變性1 min，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT方法評估歸RNA水平(19)。95℃15 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃35 s 40 個循環(huán)。mRNA 相對表達(dá)水平通過比較Ct 方法計算，即相對量=2-ΔΔCt。

1.4 高糖刺激培養(yǎng)PBMCs 抽取5 例DPN 患者空腹靜脈血20 mL，采用Ficoll-HyPaque 分離液制備PBMCs，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱2 h，去除未貼壁細(xì)胞，PBS 洗滌。細(xì)胞經(jīng)特異性單抗CD14 孵育后，采用流式細(xì)胞儀鑒定單核細(xì)胞純度，陽性率達(dá)90%。用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再將細(xì)胞以1×105個/mL的濃度接種至12 孔板中培養(yǎng)48 h，分為三組：空白組(5 mmol/L 葡萄糖)、高糖處理組(HG，25 mmol/L 葡萄糖)、非達(dá)司他+HG 組(Fid 10 μmol/L+25 mmol/L 葡萄糖)。培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞，通過RT-PCR 法檢測各組NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA，IL-1β mRNA (正義鏈：CTCCGACCACCACTACAGCAA，反義鏈：CAACACGCAGGACAGGTACAG)、IL-18 mRNA( 正義鏈：TGCATCAACTTTGTGGCAAT，反義鏈：ATAGAGGCCGATTTCCTTGG)表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism6 軟件對各種數(shù)據(jù)進行分析，性別采用χ2檢驗；正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，兩組比較采用t檢驗，三組比較采用單因素方差分析；偏態(tài)資料采用中位數(shù)[M (P25～P75)]表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney U 檢驗，三組數(shù)據(jù)比較采用Kruskai-wallis 檢驗；采用Pearson 進行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受檢者的血清IL-1β、IL-18水平比較 與對照組相比，DPN 及NDPN 組血清IL-1β、IL-18 濃度均升高，且NDPN 組升高更為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 三組受檢者的血清IL-1β、IL-18水平比較[M (P25～P75)，pg/mL]

2.2 三組受檢者PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA表達(dá)水平比較 與對照組相比，NDPN組及DPN組患者PBMCs中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA 表達(dá)升高，且NLRP3 mRNA表達(dá)在DPN組升高更為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 三組受檢者PBMCs中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA表達(dá)[M (P25～P75)]

2.3 DPN患者NLRP3炎性體與相關(guān)細(xì)胞因子相關(guān)性 DPN 患者PBMCs 中NLRP3 與IL-1β、IL-18 呈正相關(guān)(P＜0.05)；ASC 與IL-1β 、IL-18 呈正相關(guān)(P＜0.05)；Caspase-1 與IL-1β、IL-18 呈正相關(guān)(P＜0.05)，見表4。

表4 DPN患者NLRP3炎性體與相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)性

2.4 醛糖還原酶抑制劑非達(dá)司他抑制高糖誘導(dǎo)的PBMCs 中炎性體表達(dá) 體外通過醛糖還原酶抑制劑非達(dá)司他刺激培養(yǎng)PBMCs，與空白組相比，HG 組PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1 mRNA及IL-18 mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng) 計 學(xué) 意 義(P＜0.05)；與HG 組 相 比，F(xiàn)id + HG 組PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1 mRNA及IL-18 mRNA表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表5。

表5 醛糖還原酶抑制高糖誘導(dǎo)的DPN患者PBMCs中炎性體表達(dá)[M (P25～P75)]

3 討論

糖尿病是一種全球性的慢性疾病，良好的血糖控制可以延遲糖尿病患者神經(jīng)病性癥狀的出現(xiàn)，但不足以預(yù)防或治愈該疾病[6]。多元醇途徑在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制中起重要作用，包括糖尿病白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變和腎病。醛糖還原酶是醛固酮還原酶超家族的一種酶，在葡萄糖代謝的多元醇途徑中催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨醇。在此背景下，醛糖還原酶抑制劑在世界范圍內(nèi)備受關(guān)注[7]。本次研究通過調(diào)查醛糖還原酶抑制劑對高糖誘導(dǎo)的單核細(xì)胞NLRP3 炎性體的調(diào)控，探討其在糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生發(fā)展過程中潛在的治療作用。

NLRP3 炎性體是迄今為止研究最為充分的炎癥小體，包括NLRP3、ASC和Caspase-1[8]。NLRP3作為炎性體激活的傳感器，可以通過膽固醇晶體、尿酸、微生物和各種其他配體觸發(fā)。NLRP3 是炎癥體家族的重要成員，由p10 和p20 亞基組裝而成的活性Caspase-1 異 四 聚 體 可 以 將 無 活 性 的pro-IL-1 β 和pro-IL-18轉(zhuǎn)化為其生物學(xué)活性的分泌形式，從而參與先天免疫應(yīng)答[9]。本次研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，NDPN組 及DPN 組 患 者PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA表達(dá)升高，且NLRP3 mRNA表達(dá)在DPN 組升高更為明顯。DPN 患者PBMCs中NLRP3、ASC 及Caspase-1 與IL-1β、IL-18 均呈正相關(guān)。

IL-1β是先天免疫反應(yīng)最突出和早期的介質(zhì)之一，它介導(dǎo)許多炎癥性疾病的發(fā)病機制，包括糖尿病和動脈粥樣硬化等[10]。但其在葡萄糖代謝中的生理作用仍然未知，IL-1β的長期上調(diào)導(dǎo)致胰島素水平升高，這可能對代謝有害。這可能是因為胰島素通過促進葡萄糖攝取和代謝來增強巨噬細(xì)胞的炎癥狀態(tài)。IL-18屬于IL-1細(xì)胞因子家族，具有主要的促炎作用。研究表明IL-18與肥胖[11]、胰島素抵抗[12]和血脂異常[13]等疾病有關(guān)。研究表明血糖調(diào)節(jié)受損或2型糖尿病患者血清中IL-18水平顯著升高[14]。2型糖尿病患者血清IL-18水平升高與迷走神經(jīng)活動降低相關(guān)[15]。 本次研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，DPN 及NDPN 組血清IL-1β、IL-18 濃度高于對照組，且NDPN組升高更為明顯。

單核細(xì)胞可釋放多種促炎細(xì)胞因子，通過自分泌/旁分泌方式引起免疫應(yīng)答。高血糖是糖尿病患者發(fā)生炎癥、細(xì)胞凋亡、嚴(yán)重的血管舒張、組織損傷和功能障礙的主要因素[16]。醛糖還原酶既是多元醇途徑的關(guān)鍵酶，其在高血糖條件下的激活又會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本次研究通過體外醛糖還原酶抑制劑及高糖刺激PBMCs，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，HG組PBMCs中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1mRNA 及IL-18 mRNA 表達(dá)升高；與HG 組相比，F(xiàn)id + HG 組PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1mRNA 及IL-18 mRNA 表達(dá)降低。對糖尿病大鼠的研究表明，非達(dá)司他可以預(yù)防糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激和VEGF 的過度表達(dá)[17]。非達(dá)司坦治療糖尿病神經(jīng)病變大鼠10 周后，背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中山梨醇和果糖水平的增加趨于正常[18]。

綜上所述，DPN 患者血清血清IL-1β、IL-18 濃度升高，PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA表達(dá)升高；體外高糖刺激培養(yǎng)DPN患者的PBMCs，發(fā)現(xiàn)醛糖還原酶抑制劑可抑制NALP3 炎癥體通路的激活，可能有助于延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展。