康婭，楊曉雨，王夢昌

西安交通大學第一附屬醫(yī)院血液內科1、醫(yī)療信息管理辦公室2，陜西 西安 710061

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，C ML)是血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，目前尚不能根治。大部分CML 經歷慢性期、加速期至急變期，最終進入疾病終末狀態(tài)?，F有的研究表明白血病干細胞是白血病發(fā)生的根源。尋找到靶向清除白血病干細胞的有效方法可治愈白血病[2]。微小RNA (miRNA)在轉錄后水平調控基因表達為白血病干細胞的研究提供了新的方向。本課題組初期運用微小RNA基因芯片，檢測2例服用二代酪氨酸激酶抑制劑尼洛替尼的CML (慢性期、加速期各1 例)患者治療前后外周血miRNA 表達譜，發(fā)現miR-144 治療前后存在明顯異常表達，治療后上調。這提示miR-144 可能與CML 治療藥物或發(fā)病機制有關。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路參與到CML發(fā)病的信號通路中，其中MAPK1 可調節(jié)細胞的各個階段[3]，與腫瘤的生長擴散密切相關。查詢Targetscan7.1數據庫系統(tǒng)，miR-144家族中的miR-144-3p是一個典型的癌癥抑制因子，參與多種癌癥細胞的增殖調控[4]。miR-144-3p 可與1 043 個mRNA 的3'非翻譯區(qū)結合，包括與白血病發(fā)病有關的MAPK等基因，推測在慢性粒細胞白血病急變期miR-144-3p與MAPK基因之間可能存在某種聯系。具體機制不清。本研究利用實時熒光定量PCR (RT-qPCR方法)，對慢性粒細胞白血病急變期患者和正常健康者的外周血單個核細胞進行miRNA-144-3p和MAPK1 mRNA定量檢測，比較兩組受檢者是否存在差異表達，以期能為慢性粒細胞白血病干細胞研究提供新的思路。現將結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗所需要的C ML急變期外周血均來自于2018 年11 月至2019 年3 月就診于西安交通大學第一附屬醫(yī)院血液內科的患者(病例組)，共10 例，男性3 例，女性7 例，中位年齡41.00 [30.50～51.25]歲；慢性粒細胞白血病急粒變5 例，慢性粒細胞白血病急淋變5 例。CML 急變期診斷符合《中國慢性髓性白血病診斷與治療指南(2016 年版)》[1]。正常對照組外周血樣本均來自西安交通大學第一附屬醫(yī)院血液內科工作人員，共11 例。所有標本獲取及處理流程按照西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會所制定的倫理學標準，并獲得倫理批件，實驗獲得受試對象或其家庭成員的同意，并簽署相關同意書。

1.2 實驗主要試劑及來源 Trizol (美國，Ambion公司)；HiScript逆轉錄酶、5×HiScript緩沖液、50×ROX Reference Dye 2、SYBR 綠色標記材料(美國，VAZYME公司)；核糖核酸酶抑制劑(北京，全式金生物技術有限公司)；dNTP、Taq Plus DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker(北京，天根生化科技有限公司)；Random Primer(N6)(日本，TaKaRa)；聚合酶鏈反應引物的制備來自武漢擎科公司。

1.3 實驗所用主要儀器及生產公司 RT-PCR(美國，ABI)；PCR管(美國，EXTRAGENE/illumina)；微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)；微波爐(韓國，LG)；Aquapro 超級純水儀(美國，Aquapro)；pH 計(德國，Metter-Toledo GmbH公司)；PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)；水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；紫外分析儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；無RNase袋裝吸頭(美國，EXTRAGENE)。

1.4 實時定量PCR 引物序列 實時定量PCR引物序列見表1。 miRNA 反義鏈通用引物：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT。

表1 引物序列

1.5 Trizol法提取RNA 抽取實驗對象外周血液2 mL，按照Trizol試劑盒說明書提取RNA。利用微量分光光度計測定吸光光度值，計算樣品RNA 的濃度。將總RNA放于-80℃冰箱內保存以備用。

1.6 逆轉錄成cDNA 根據試劑盒的說明書對RNA 進行反轉錄。反應體系配制見表2。實驗所用的移液器吸頭和離心管，均必須提早采用0.1% DEPC溶劑浸沒過夜，再用高壓殺菌、烘干后方可應用于本實驗。

1.7 RT-qPCR 檢測 將實時定量PCR 所需試劑置于冰上融解，上下輕柔顛倒使之混勻，短暫離心后將試劑放置冰上待用。根據說明書，冰上配制實時定量PCR 反應液，反應體系見表3。

表2 逆轉錄反應體系

表3 PCR反應體系

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0 統(tǒng)計學軟件進行實驗數據的統(tǒng)計分析，計量資料不符合正態(tài)分布，采用M[P25～P75]表示，兩兩組間比較采用獨立樣本秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者的臨床資料比較 兩組受檢者的年齡和白細胞計數比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但病例組患者的血紅蛋白含量和血小板計數明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4。

2.2 兩組受檢者的miR-144-3p、MAPK1mRNA表達水平比較 病例組患者的miR-144-3p mRNA和MAPK1 mRNA 的表達水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表5。 miR-144-3p mRNA PCR曲線見圖1，miR-144-3p的溶解曲線見圖2。

表4 兩組受檢者的臨床資料比較(M[P25～P75])

表5 兩組受檢者的miR-144-3p 、MAPK1 mRNA 表達水平比較(M[P25～P75])

圖2 miR-144-3p的溶解曲線

3 討論

慢性粒細胞白血病好發(fā)于中年人，是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。盡管酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors (TKIs)在控制CML 慢性期取得了顯著的成功[5]，但由于TKIs 不能殺死白血病干細胞而導致CML 復發(fā)、耐藥[6]。對大部分患者來說，CML 目前仍不能根治，進入急變期后預后更差，急需要研究發(fā)現新的針對白血病干細胞有關的發(fā)病機制及治療手段。

miRNA 是一種非編碼小RNA，具有癌基因或抑癌基因功能[7-9]。研究發(fā)現人體骨髓白血病干細胞中存在miRNA 的表達[10]，miRNA 對白血病干細胞有著重要的調控作用。已有研究證實，通過靶向BCR-ABL基因，miR-96在慢性粒細胞白血病疾病轉化過程中充當腫瘤抑制因子的作用[11]?？梢娢⑿NA 與慢性粒細胞白血疾病進展機制密切相關，而目前CML疾病進展機制不清。

MAPK 信號通路參與到CML 發(fā)病的信號通路中[12]。MAPK 亞族中的MAPK1 可調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡和血管形成[13]，從而促進腫瘤生長與擴散。已有文獻報道了各種參與調控CML相關的MAPK信號通路蛋白級聯的miRNAs的潛在作用[14]。miRNA在信號通路中有靶向多個基因的能力，這使得其作用及研究復雜化。課題組前期鑒定出的miR-144 與生物體蛋白磷酸化密切相關，能穩(wěn)定存在于人體體液中。文獻提示：在直腸癌中，miR-144 存在低表達，并參與了絲裂原活化蛋白激酶途徑，最終抑制直腸癌細胞凋亡，促進腫瘤增殖[15]。有學者通過實時定量PCR方法證實miR-144在CML急變期細胞中表達下調[16]，它參與了MAPK 信號通路，在費城染色體陽性的K562 細胞中抑制MAPK 信號通路，促進K562 細胞的凋亡[17]。推測miR-144可能成為未來的治療靶標。

本研究通過Targetscan7.1 數據庫系統(tǒng)查找miR-144，發(fā)現其家族包括2 個成員，即miR-144-3p、miR-144-5p。其中研究較多的是miR-144-3p，它與腦膠質瘤[18]、結腸癌[19]等細胞增殖、凋亡、疾病預后密切相關。在非小細胞肺癌中利用微陣列及RT-PCR技術證明miR-144-3p 下調，它可能是潛在的疾病標志物[20]，與患者預后有關。研究還提示，在多發(fā)性骨髓瘤中，miR-144-3p 通過靶向c-Met 抑制細胞增殖，促進凋亡[21]；在前列腺癌中，miR-144-3p 通過靶向CEP55抑制細胞增殖，誘導凋亡[22]。miR-144-3p在多種腫瘤細胞中起著重要作用。Targetscan 7.1 數據庫提示miR-144-3p 可與MAPK1 基因的3'非翻譯區(qū)結合，在結腸癌細胞中已經證實miR-144-3p 可以靶向抑制MAPK1，從而抑制細胞增殖擴散，并誘導結腸癌細胞凋亡[19]。推測miR-144-3p與MAPK1基因在慢性粒細胞白血病急變期也可能有潛在聯系，具體調控機制不清。

查詢miRBase 數據庫系統(tǒng)，miR-144-3p 位于17號染色體上，與現有的CML 主要的發(fā)病機制t(9;22)(q34;q11)易位所不同。探索miR-144-3p 與MAPK1在慢性粒細胞白血病中的表達及調控機制有利于尋找CML未知的發(fā)病機制及新的靶向治療手段。

本研究結果顯示，病例組患者血常規(guī)中血紅蛋白含量、血小板計數明顯低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示在醫(yī)療過程中關注血紅蛋白含量及血小板計數的改變可以協(xié)助判斷慢性粒細胞白血病患者是否進入急變期，以便及時調整治療方案。

本研究結果還顯示，病例組患者的miR-144-3p mRNA 和MAPK1 mRNA 的表達水平明顯低于對照組, 差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示miR-144-3p、MAPK1 基因參與了慢性粒細胞白血病急變期，而急變期單個核細胞中存在大量的白血病干細胞，推測miR-144-3p、MAPK1與白血病干細胞有關，可為慢性粒細胞白血病干細胞研究提供新的思路。本研究因為人體標本，研究數量少，目前尚缺少miRNA 與MAPK1 靶向作用沒有驗證，以及miR-144-3p 對慢性粒細胞白血病急變期單個核細胞增殖、凋亡、周期影響的實驗，因此有待課題組下一步實驗完成來得出更客觀準確的結論。