許鋒，姚文靜，曹春霞，薛媛媛，李玉運(yùn)，馬立吉，付海波

淄博市中心醫(yī)院兒科，山東 淄博 255036

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxia-ischemia brain damage，HIBD)是圍生期缺氧或窒息后引起的腦神經(jīng)損傷性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)新生兒HIBD發(fā)生率為活產(chǎn)兒的0.3%～0.6%，其中15%～20%在新生兒期死亡，存活者中20%～30%可能遺留不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。目前對(duì)于新生兒HIBD 治療措施，主要是早期是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，后期行康復(fù)訓(xùn)練，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)值得肯定藥物干預(yù)措施。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(mouse nerve growth factor，mNGF)作為一種具有神經(jīng)修復(fù)功能生物活性蛋白，已廣泛應(yīng)用于眼科、骨科、神經(jīng)科等領(lǐng)域。近年來(lái)，已有報(bào)道m(xù)NGF 用于新生兒HIBD 康復(fù)治療，治療效果仍不確切。巢蛋白(nestin)作為于神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)特異性抗原，在受損的神經(jīng)部位廣泛表達(dá)，常作為NSCs 增殖再生研究的標(biāo)志物。本研究利用新生大鼠HIBD 模型，觀察腦海馬部位nestin 陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)變化，以探討mNGF 的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 108 只7 d 齡Wistar 大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)體質(zhì)量(15.4±2.2) g，雌雄不限；按完全隨機(jī)法原則分為對(duì)照組、HIBD組和治療組，每組36只。

1.1.2 主要試劑 兔抗鼠nestin 多克隆抗體(上?？泼羯锟萍加邢薰?；兔IgG 抗體-HRP 多聚體(武漢博士德生物工程有限公司)；注射用mNGF [舒泰神(北京)生物制藥股份有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 新生大鼠HIBD模型制作方法 參照文獻(xiàn)[1]，阻斷左側(cè)頸總動(dòng)脈，術(shù)后立即置于缺氧艙(50 cm×60 cm×60 cm，有兩個(gè)直徑為3 cm圓孔與外界相通，并放置鈉石灰吸收水和二氧化碳)，8%的氮氧混合氣體低氧暴露2 h。對(duì)照組僅暴露游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不做缺氧缺血處理。

1.2.2 干預(yù)措施 治療組HIBD后于左側(cè)股二頭肌部位肌肉注射mNGF [10 μg/(kg·d)]，連用3 d；對(duì)照組、HIBD 組在相同時(shí)間點(diǎn)相同部位僅肌肉注射等容積生理鹽水。

1.2.3 標(biāo)本采集和組織切片的制備 三組大鼠術(shù)后4 d、7 d、14 d 用4%多聚甲醛穿心灌注處死后留取腦組織標(biāo)本，室溫固定24 h，石蠟包埋，在海馬部位連續(xù)切片，片厚4 μm，隔4取1，制作免疫組織化學(xué)和HE染色切片。以1∶200兔抗鼠nestin多克隆抗體為一抗，行免疫組織化學(xué)非生物素二步法及常規(guī)HE染色。

1.2.4 數(shù)據(jù)采集與處理 在Olympus CX33 顯微鏡下，利用計(jì)算機(jī)細(xì)胞圖像分析技術(shù)完成圖像采集表及nestin陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞胞漿內(nèi)會(huì)出現(xiàn)棕紅色或褐色顆粒為nestin 陽(yáng)性細(xì)胞。取計(jì)數(shù)5 個(gè)非連續(xù)腦組織切片nestin 陽(yáng)性細(xì)胞，以平均值作為該只大鼠陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)利用SPSS21.0 自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，三組不同時(shí)點(diǎn)nestin 陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)的計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，三組間比較、同組內(nèi)不同亞組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織HE染色病理改變 對(duì)照組大鼠海馬部位錐體細(xì)胞排列整齊、密集；HIBD組大鼠海馬部位錐體細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞與周圍的細(xì)胞分離，核染色質(zhì)濃集呈藍(lán)色致密的球狀，可見(jiàn)較多凋亡的神經(jīng)細(xì)胞；治療組可見(jiàn)海馬部位錐體細(xì)胞層次排列較整齊，胞質(zhì)濃縮，嗜酸性增強(qiáng)，可見(jiàn)少量凋亡的神經(jīng)細(xì)胞(圖1)。

圖1 三組大鼠術(shù)后7 d海馬部位病理改變(HE染色，×400)

2.2 海馬DG區(qū)nestin表達(dá) 通常nestin染色陽(yáng)性細(xì)胞呈棕紅色或褐色，著色點(diǎn)位于細(xì)胞體和突起部分；陰性對(duì)照片無(wú)相應(yīng)的nestin免疫反應(yīng)產(chǎn)物。HIBD組同時(shí)點(diǎn)nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；治療組同時(shí)點(diǎn)nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組、HIBD組均增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)術(shù)后7 d達(dá)高峰，術(shù)后14 d有所降低，各時(shí)點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1和圖2。

圖2 三組大鼠術(shù)后7 d海馬部位nestin表達(dá)(非生物素二步法，×400)

表1 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬DG區(qū)nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(±s，個(gè))

表1 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬DG區(qū)nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(±s，個(gè))

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3 討論

NSCs 存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛能，在神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮一定作用。在腦組織內(nèi)側(cè)腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ) 及 海 馬 齒 狀 回(dentate gyrus，DG)區(qū)是NSCs主要的聚集區(qū)域[2]，故作為NSCs的特征性標(biāo)記物nestin 在SVZ 和DG 區(qū)有強(qiáng)表達(dá)。本研究以海馬DG區(qū)nestin陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)作為研究對(duì)象，來(lái)觀察內(nèi)源性NSCs的增殖情況。

研究發(fā)現(xiàn)新生大鼠HIBD 后腦組織DG 區(qū)及SVZ可見(jiàn)少量增殖的NSCs[3]，提示HIBD 本身可促進(jìn)內(nèi)源性NSCs 增殖。本研究發(fā)現(xiàn)新生Wistar 大鼠HIBD 組DG區(qū)nestin陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)較對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)均增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在術(shù)后7 d 達(dá)高峰。由此推測(cè)HIBD可誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs的增殖與再生，這與以前研究結(jié)果是一致的[4]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)mNGF 干預(yù)后的新生Wistar 大鼠HIBD模型，在各時(shí)點(diǎn)腦組織DG區(qū)nestin陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)較HIBD組、對(duì)照組均明顯增多，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示mNGF 可能促進(jìn)內(nèi)源性NSCs 的增殖再生，在新生大鼠HIBD 后發(fā)揮一定的神經(jīng)修復(fù)作用。已知mNGF 是一種分子量為26.5 kD 的生物活性蛋白，是在神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)、分化及功能維持中發(fā)揮重要作用的一種細(xì)胞因子。mNGF具有維持神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育和功能的作用[5]，對(duì)神經(jīng)元有營(yíng)養(yǎng)支持作用，且能夠促進(jìn)受損神經(jīng)組織的修復(fù)[6]。研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用mNGF體外誘導(dǎo)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，可以誘導(dǎo)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化成類神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[7]。還有研究表明mNGF能誘導(dǎo)NSCs向類神經(jīng)元分化[8]，對(duì)受損神經(jīng)有修復(fù)保護(hù)作用[9]。對(duì)于mNGF具體的生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制，目前尚未完全清楚，可能與TrkA 受體[10]和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體p75NTR[11-13]有相關(guān)性。此外，mNGF也可以通過(guò)激活ERK1/2和P13K/Akt通路來(lái)促進(jìn)神經(jīng)元的分化、存活[14]，對(duì)神經(jīng)元間聯(lián)系及損傷后神經(jīng)元的修復(fù)也有生物學(xué)效應(yīng)[15]。目前mNGF 已廣泛應(yīng)用于眼科、骨科、神經(jīng)科、兒科等領(lǐng)域，對(duì)于腦癱、缺氧缺血性腦損傷、面神經(jīng)炎、周圍神經(jīng)損傷等多種疾病的治療，均取得較好療效[16-19]。

總之，本研究已證實(shí)mNGF 可促進(jìn)新生大鼠HIBD 后nestin 表達(dá)增加，可能促NSCs 的增殖、分化，為臨床應(yīng)用mNGF治療新生兒HIBD提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但具體作用機(jī)制及增殖后NSCs是否具有生物學(xué)功能有待于進(jìn)一步研究探討。