劉凱凱，袁廷柱，唐君瑋，宋靜靜，劉洪軍，遲雯丹，蓋珊珊，于道德*

(1.山東省海洋生物研究院，山東省海水健康養(yǎng)殖技術(shù)工程技術(shù)研究中心，青島市海洋生物種質(zhì)資源挖掘與利用工程實(shí)驗(yàn)室，山東青島266104;2.長(zhǎng)島海洋生態(tài)文明綜合試驗(yàn)區(qū)海洋經(jīng)濟(jì)促進(jìn)中心，山東煙臺(tái)265800)

海水青鳉Oryzias melastigma隸屬于輻鰭亞綱Actinopterygii鳉形目Cypernodontiformes青鳉屬，原產(chǎn)于印度、巴基斯坦、緬甸和泰國(guó)沿海及淡水水域(Dong et al.，2014)。海水青鳉是小型的熱帶魚(yú)種，全年產(chǎn)卵，具有性別易區(qū)分、產(chǎn)卵率高、世代周期短、鹽度適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)，已逐漸成為一種理想的海洋模式魚(yú)種 (Kong et al.，2008;Chen et al.，2009;Dong et al.，2014)。由于對(duì)水質(zhì)和環(huán)境中各種污染物干預(yù)敏感，海水青鳉已被廣泛應(yīng)用于海洋生態(tài)毒理學(xué)研究(Bao et al.，2011;穆景利等，2011;Tian et al.，2011)，被國(guó)際生命科學(xué)學(xué)會(huì)健康和環(huán)境科學(xué)研究所(HESI)認(rèn)定為毒理學(xué)研究的重要工具(伍辛瀧等，2012)。

環(huán)境因子對(duì)于魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育、攝食、繁殖等起著重要作用。魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育易受溫度、pH、溶解氧、鹽度及光照強(qiáng)度等外界環(huán)境因素的影響。其中，溫度是影響?hù)~(yú)類(lèi)生存、生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子，影響?hù)~(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育時(shí)間、卵黃利用率、孵化后仔魚(yú)的大小以及關(guān)鍵組織和結(jié)構(gòu)的形成與功能(Kamler，1992;Saka et al.，2004;Gabillard et al.，2005)。不同魚(yú)類(lèi)對(duì)溫度的適應(yīng)范圍有很大差異，同種魚(yú)類(lèi)的不同生態(tài)類(lèi)群，其適溫范圍亦可能不同。確定魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育的適宜溫度范圍，是進(jìn)行人工繁育的關(guān)鍵。有關(guān)溫度對(duì)魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育影響的研究，國(guó)內(nèi)外已有很多報(bào)道(Petereit et al.，2008;柴學(xué)軍等，2011;Guillen et al.，2014)，然而，不同溫度下海水青鳉胚胎發(fā)育的相關(guān)研究尚處于空白。本文研究了溫度對(duì)海水青鳉胚胎發(fā)育的影響，旨在探索海水青鳉胚胎發(fā)育的最佳溫度范圍，以期為海水青鳉的基礎(chǔ)生物學(xué)積累資料，并為提高孵化率提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取實(shí)驗(yàn)室世代培養(yǎng)的3月齡性成熟海水青鳉(10雌×10雄)作為親魚(yú)，暫養(yǎng)于玻璃缸中，體長(zhǎng)28 mm±2 mm。每天定時(shí)投喂2次初孵鹵蟲(chóng)的無(wú)節(jié)幼體。實(shí)驗(yàn)用水為青島沙子口過(guò)濾海水，溫度為27℃ ±1℃，鹽度為32‰，光照周期為14 h∶10 h(光照∶黑暗)。親魚(yú)產(chǎn)卵受精后，用塑料吸管小心地將受精卵從玻璃缸底部吸出，放入盛滿(mǎn)海水的培養(yǎng)皿中，通過(guò)解剖鏡觀察挑選出發(fā)育正常且處于同一發(fā)育時(shí)期的受精卵(囊胚期)用于溫度試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)置19℃、22℃、25℃、28℃、31℃和34℃共6個(gè)溫度梯度。試驗(yàn)容器為200 mL燒杯，實(shí)驗(yàn)用水為紅海鹽(Israel)與超純水配制而成的人工海水，鹽度27‰。每個(gè)溫度組設(shè)置2個(gè)平行，每個(gè)燒杯放入30粒挑選好的受精卵。將試驗(yàn)容器放入玻璃缸中，使用恒溫加熱棒控制水溫，每天3次記錄水體實(shí)際溫度，計(jì)算平均值。采取逐漸升降溫的方法，以每小時(shí)升(降)0.5℃的速度逐漸升(降)溫度，達(dá)到預(yù)定溫度后恒溫孵化。每天使用等溫水體換水1/3，保證受精卵孵化水體的新鮮。

定期使用奧林巴斯SZ61解剖鏡觀察受精卵的發(fā)育情況，并使用Zeiss Stereo Discovery V12體視顯微鏡拍照記錄。在仔魚(yú)半數(shù)出膜時(shí)計(jì)算孵化時(shí)間，仔魚(yú)全部出膜后計(jì)算孵化率和畸形率，畸形主要指卵黃囊水腫和脊柱彎曲，結(jié)果取2組平行數(shù)據(jù)的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0和Excel 2016處理數(shù)據(jù)、制作圖表并對(duì)變化趨勢(shì)作相應(yīng)回歸分析。生物學(xué)零度(C)與有效積溫(K)是研究魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育的指標(biāo)，對(duì)人工育苗生產(chǎn)有重要的參考價(jià)值。胚胎發(fā)育速度的溫度系數(shù)(Q10)可以定量表示某一溫度范圍內(nèi)溫度變化對(duì)胚胎發(fā)育速度的影響。生物學(xué)零度、有效積溫和溫度系數(shù)按以下公式計(jì)算:

式中，t為胚胎完成發(fā)育所需要的時(shí)間，V為胚胎發(fā)育所需時(shí)間的倒數(shù)(1/t)，n為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度梯度的個(gè)數(shù)，T表示胚胎發(fā)育的平均溫度。

式中，T0表示胚胎發(fā)育的起始溫度，t0表示孵化溫度為T(mén)0時(shí)的孵化時(shí)間，ta表示孵化溫度為T(mén)a時(shí)的孵化時(shí)間。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 溫度與胚胎孵化時(shí)間的關(guān)系

海水青鳉的孵化時(shí)間隨孵化溫度升高而縮短。水溫為19.8℃時(shí)，孵化時(shí)間為33.4 d，水溫為33.8℃時(shí)，孵化時(shí)間僅為8.5 d。在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，孵化時(shí)間(y)與孵化溫度(x)呈負(fù)相關(guān):y=0.147 4x2－9.445 1x+160.4，R2=0.933 6(P ＜0.01)(圖1)。

圖1 海水青鳉Oryzias melastigma孵化時(shí)間與孵化溫度的關(guān)系Fig.1 Relationship between hatching time and hatching temperature of Oryzias melastigma

2.2 溫度對(duì)胚胎孵化率和畸形率的影響

19.8 ～33.8℃都可孵化出仔魚(yú)。其中，27.6℃的孵化率最高，為63.33%，而19.8℃和33.8℃的孵化率較低，分別為10%和33.33%。在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，孵化率(y)隨著孵化溫度(x)的升高，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(圖2)，其關(guān)系大致符合 y= －0.725 6x2+40.192x－500.2，R2=0.886 6(P＜0.01)。在解剖鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，28.0℃時(shí)胚胎畸形率最低(圖3)。孵化的正常仔魚(yú)形態(tài)特征正常、活力旺盛(圖3:a);19.8℃孵化的部分仔魚(yú)身體消瘦，脊椎彎曲呈V形(圖3:b);33.8℃孵化的部分仔魚(yú)卵黃囊出現(xiàn)水腫(圖3:c);30.5℃魚(yú)卵更易粘附臟污，滋生霉菌(圖3:d);仔魚(yú)通過(guò)尾部破膜的形式出卵(圖3:e)。

圖2 海水青鳉孵化率、畸形率與孵化溫度的關(guān)系Fig.2 Relationship between hatching temperature and hatching rate and deformity rate of Oryzias melastigma

圖3 孵化溫度對(duì)海水青鳉初孵仔魚(yú)發(fā)育的影響Fig.3 Effects of hatching temperature on the development of newly-hatched larvae of Oryzias melastigma

2.3 胚胎發(fā)育的有效積溫與生物學(xué)零度

試驗(yàn)結(jié)果顯示，海水青鳉胚胎發(fā)育的生物學(xué)零度和平均有效積溫分別為14.89℃和3 919.04℃·h(表1)。

表1 不同孵化溫度下海水青鳉胚胎發(fā)育的有效積溫Table 1 The effective accumulative temperature degree of Oryzias melastigma embryos at different temperatures

2.4 溫度系數(shù)

不同孵化溫度范圍內(nèi)海水青鳉胚胎發(fā)育速度的溫度系數(shù)顯示，海水青鳉在溫度22.5～33.8℃的 Q10接近2(2.04)(表2)。

3 討論

魚(yú)類(lèi)的胚胎發(fā)育容易受到外界環(huán)境因素的影響，其中溫度的影響最大(Korwin-Kossakowski，2012)。本研究發(fā)現(xiàn)海水青鳉胚胎發(fā)育過(guò)程對(duì)溫度比較敏感，孵化溫度過(guò)高或過(guò)低會(huì)加速或抑制胚胎發(fā)育進(jìn)程。在19.8～33.8℃溫度范圍內(nèi)，海水青鳉都能孵化出膜，且隨孵化溫度的升高，孵化歷時(shí)逐漸縮短。李岑等(2011)、Ahn等(2012)和黃賢克等(2017)分別研究了溫度與泰國(guó)斗魚(yú)Betta splendens、日本鰻鱺 Anguilla japonica和黃姑魚(yú)Nibea albiflora胚胎發(fā)育的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育時(shí)間與溫度呈負(fù)相關(guān)，本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致。

表2 海水青鳉胚胎在不同孵化溫度范圍的溫度系數(shù)Table 2 Q10of embryonic development of Oryzias melastigma at different temperatures

魚(yú)類(lèi)胚胎的孵化出膜主要靠胚體的運(yùn)動(dòng)和孵化酶的作用(肖楓，康懷彬，2007)。溫度主要通過(guò)影響孵化酶的分泌及其活性而控制仔魚(yú)的孵出，同時(shí)影響胚胎的孵化率和孵化進(jìn)程(樊廷俊，史振平，2002)。在33.8℃下，海水青鳉胚胎的孵化時(shí)間僅為8.5 d。可以推測(cè)，孵化溫度升高可能提高了孵化酶的活性，代謝過(guò)程比低溫時(shí)發(fā)生得更快，使得卵內(nèi)胚胎的發(fā)育比低溫時(shí)更活躍，從而加速了孵化進(jìn)程。而在19.8℃下，海水青鳉孵化時(shí)間為33.4 d，為33.8℃下孵化時(shí)長(zhǎng)的3.9倍。解剖鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，胚胎心跳和血流速度遲緩，發(fā)育速度緩慢。低溫環(huán)境降低了胚胎發(fā)育過(guò)程中孵化酶的活性，魚(yú)卵內(nèi)的新陳代謝活動(dòng)受到抑制，卵黃的消耗速度降低，最終導(dǎo)致孵化時(shí)間延長(zhǎng)。

升高孵化溫度雖然可以加速孵化，但對(duì)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育并非一定有利。高溫可能具有致畸作用或引起肌肉細(xì)胞的長(zhǎng)期改變(Finn，2007)。本實(shí)驗(yàn)中，孵化溫度升高，初孵仔魚(yú)出現(xiàn)卵黃囊水腫，畸形率增加。卵黃囊是仔魚(yú)逐步從內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)階段轉(zhuǎn)入外源性營(yíng)養(yǎng)階段的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源(殷名稱(chēng)，1995)。魚(yú)類(lèi)卵黃囊的消耗速度取決于周?chē)疁?Petereit et al.，2008)。高溫下初孵仔魚(yú)孵化歷時(shí)短，能夠提前進(jìn)入外源性營(yíng)養(yǎng)階段，消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較少，導(dǎo)致卵黃囊體積較大。同樣，溫度降低，初孵仔魚(yú)畸形率也會(huì)增加，其表現(xiàn)為身體消瘦、脊椎彎曲。

溫度升高還會(huì)影響?hù)~(yú)卵表面細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)(Cook et al.，2005)。海水青鳉魚(yú)卵為沉性卵，表面附有短絨毛和長(zhǎng)纖維絲，具有黏性(王友紅等，2017)。本研究發(fā)現(xiàn)，與其他試驗(yàn)溫度相比，在30.5℃下，魚(yú)卵表面更容易吸附臟污，推測(cè)此溫度可能適宜某種霉菌的生長(zhǎng)。海水青鳉通過(guò)尾部擺動(dòng)破膜出卵，此胚胎觀察結(jié)果與陳漪等(2016)的結(jié)果一致。仔魚(yú)尾部破膜后，頭部何時(shí)出卵取決于仔魚(yú)的力量和活力(Korwin-Kossakowski，2012)。霉菌的附著導(dǎo)致仔魚(yú)孵化出卵的能耗增加，甚至造成仔魚(yú)無(wú)法破膜而死亡，這是孵化率降低的原因之一。33.8℃并非海水青鳉孵化臨界溫度的上限。由孵化溫度與孵化率的曲線方程推算出海水青鳉胚胎孵化的理論上限溫度為36.51℃，真實(shí)的臨界溫度的上限需要設(shè)置更高的溫度梯度進(jìn)行試驗(yàn)。

當(dāng)胚胎發(fā)育的溫度系數(shù)Q10值約為2時(shí)，這一溫度范圍就可以確定為魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育的最適溫度范圍(謝仰杰等，2001)。本研究顯示，溫度為22.5～33.8℃時(shí)，Q10值最接近2，綜合考慮孵化率、孵化時(shí)間，可以得出海水青鳉胚胎的適宜孵化溫度為24.8～30.5℃，最適溫度在28℃左右。本實(shí)驗(yàn)所用親魚(yú)已繁殖3代以上，馴化溫度為27℃ ±1℃，此溫度范圍內(nèi)海水青鳉攝食及游動(dòng)行為活躍(王潤(rùn)萍等，2019)，與胚胎最適孵化溫度相同，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與花尾胡椒鯛Plectorhinchus cinctus(謝仰杰等，2001)和斑鱖 Siniperca scherzeri(胡振禧等，2014)的相關(guān)研究一致。胚胎的孵化受親魚(yú)質(zhì)量等多種因素的影響，海水青鳉的馴化溫度是否是影響胚胎發(fā)育最適溫度的因素需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 總結(jié)

本研究設(shè)置6個(gè)溫度梯度(19℃、22℃、25℃、28℃、31℃和34℃)探究了不同溫度對(duì)海水青鳉胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明:海水青鳉胚胎發(fā)育最適溫度在28℃左右，升高或降低溫度，都會(huì)導(dǎo)致孵化率降低，畸形率增加;胚胎發(fā)育時(shí)間與溫度呈負(fù)相關(guān);胚胎發(fā)育的生物學(xué)零度為14.89℃，平均有效積溫為3 919.04℃·h。本研究為海水青鳉的胚胎發(fā)育研究提供了數(shù)據(jù)參考。