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        原發(fā)性干燥綜合征患者唇腺組織水通道蛋白5 的表達及意義

        2020-11-30 03:49:36王艷玲趙福濤
        關(guān)鍵詞:淋巴細胞血清檢測

        王 領(lǐng) ,張 娜,王艷玲 ,趙福濤

        1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院風濕免疫科,上海201999;2. 上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院風濕免疫科,上海200135

        干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome, SS)是一種慢性自身免疫性疾病,以淋巴細胞浸潤外分泌腺為特征,導(dǎo)致腺體分泌功能逐漸喪失,嚴重者累及腺外器官,引起系統(tǒng)性損害[1]。其病因及發(fā)病機制不明,是一種多因素疾?。涵h(huán)境因素觸發(fā)免疫反應(yīng),損害具有遺傳易感性個體的唾液腺和淚腺細胞[2]。SS 屬于全球性疾病,在我國的患病率為0.29%~0.77%,男女比約為1:9[3]。目前尚無肯定的藥物改變SS 的病程。主要是采取措施改善癥狀,控制和延緩因免疫反應(yīng)而引起的組織器官損害的進展,預(yù)防繼發(fā)性感染等并發(fā)癥[4]。近些年發(fā)現(xiàn)水通道蛋白5(aquaporin 5, AQP5)在SS 中起著重要的作用,其主要功能為:維持滲透壓平衡及調(diào)節(jié)水液轉(zhuǎn)運;參與腺體分泌及細胞的轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡。因此,AQP5 有可能是緩解SS 癥狀的藥物的作用靶點[5]。目前對AQP5 的研究主要局限在嚙齒類動物,對其在人體唇腺腺體中的作用還了解甚少。

        SS 在臨床上分為原發(fā)性和繼發(fā)性2 種。前者指不具有另一個診斷明確的結(jié)締組織病,后者主要繼發(fā)于其他自身免疫病。原發(fā)性SS(primary SS, pSS)的基本病理變化為唾液腺呈灶性CD4+T 淋巴細胞浸潤,B 淋巴細胞高反應(yīng)性,臨床上可以看到多數(shù)pSS 患者體內(nèi)存在著高免疫球蛋白血癥[6]。因此,常用紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)、免疫球蛋白G(immunoglobulin, IgG)以及唇腺組織病理的淋巴細胞浸潤程度來提示pSS患者的病情活動。血清白細胞介素-21(interleukin-21, IL-21)作為一種多效性的細胞因子,在多種自身免疫性疾病中均表現(xiàn)出明顯的致病性。既往研究[7]顯示,SS 患者中血清IL-21 表達水平增高,且與唇腺組織中淋巴細胞的浸潤程度有關(guān),提示IL-21 可能參與了pSS 的發(fā)病過程。β2微球蛋白(β2-microglobulin, β2-MG)主要由淋巴細胞合成,被發(fā)現(xiàn)在SS 患者的血清和唾液中含量明顯升高,且與唇腺活檢中淋巴細胞浸潤程度呈正相關(guān)[8]。

        因此,為探討唇腺AQP5 的表達與血清IL-21、β2-MG 及病情活動的關(guān)系,本研究擬對pSS 患者進行微創(chuàng)唇腺活檢,用免疫組織化學(免疫組化)檢測唇腺中AQP5 的表達,采用ELISA 方法檢測患者血清中IL-21 和β2-MG 的水平,同時檢測ESR、IgG 等炎癥指標的水平,并對AQP5 與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 的相關(guān)性進行分析,以期為判斷pSS 患者的病情活動提供一種重要的生物學標志物,便于臨床評估病情和指導(dǎo)治療。

        1 對象與方法

        1.1 研究對象

        選擇2016 年7 月—2018 年1 月在上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院風濕免疫科門診初診且未經(jīng)治療的pSS 患者39 例。納入標準:符合2002 年SS 分類標準[9]。排除標準:合并急慢性感染及惡性腫瘤患者。39例患者中,男性1 例,女性38 例,年齡26 ~79 歲,平均年齡52.74 歲。在簽署知情同意書后,對患者進行唇腺活檢,并采集晨起空腹血清。本研究經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會審批通過(編號HKDL2017295),所有患者資料完整且來源真實可靠。

        1.2 研究方法

        1.2.1分組方法 所有研究對象均行唇腺活檢。唇腺腺體經(jīng)中性福爾馬林液固定24 h 后石蠟包埋,制成4 μm 切片,常規(guī)脫蠟后行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, H-E)染色。病理標本由病理科醫(yī)師和臨床醫(yī)師于倒置顯微鏡下共同完成觀察,每例患者1 張片子,5 個視野。對結(jié)果有分歧的標本,請高年資病理醫(yī)師再次審核。根據(jù)Chisholm唇腺病理分級標準[10],將所有標本分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個等級,分別代表少量淋巴細胞浸潤、中等量淋巴細胞浸潤、1 個淋巴細胞灶浸潤、多個淋巴細胞灶浸潤(4 mm2組織內(nèi)至少50 個淋巴細胞聚集于唇腺間質(zhì)為1 個灶)。根據(jù)不同等級相應(yīng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 組。

        1.2.2免疫組化檢測 按照AQP5 免疫組化試劑盒操作步驟進行AQP5 表達的檢測,步驟簡述如下。將包埋好的石蠟標本進行切片,并進行脫蠟及抗原熱修復(fù)。PBS 洗滌后,使用5% BSA(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進行封閉,使用AQP5 抗體(美國Aきnity 公司,1:200 稀釋)4℃孵育過夜;PBS 洗滌后加入山羊抗兔IgG 抗體(美國Jackson 公司),并添加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(北京中山金橋生物公司),PBS 洗滌3 次后,進行DAB(中國武漢博士德生物工程有限公司)顯色。AQP5 表達陽性的細胞呈棕黃色,在倒置顯微鏡下每張切片取5 個不同視野,在相同面積下用Image-Pro-Plus 6.0 軟件進行光密度(optical density, OD)計算。

        1.2.3ELISA 檢測 收集患者新鮮靜脈血標本,900×g 離心10 min,將血清轉(zhuǎn)移至EP 管中。依據(jù)ELISA 試劑盒操作方法檢測血清IL-21(美國Santa Cruz 公司)、β2-MG(廈門慧嘉生物科技有限公司)水平。步驟簡述如下:按要求對標準品進行倍比稀釋并加樣,將稀釋后的血清樣品加入酶標板底部。標準品及樣品加樣均為100 μL/孔;用封板膜封住反應(yīng)孔,室溫孵育120 min;揭掉封板膜,棄掉液體,甩干后加入工作濃度洗滌液,洗滌重復(fù)4 ~5次。每孔加入酶標抗體100 μL/孔,孵育1 h。洗滌后加入酶結(jié)合物100 μL,孵育并洗滌后,加入顯色劑TMB 溶液100 μL/孔,孵育20 min 后加入終止液50 μL/孔,混勻后立即使用酶標儀測量D (450 nm)值。根據(jù)標準品繪制標準曲線,并計算IL-21、β2-MG 表達水平。

        1.2.4ESR、IgG 的測定 采用魏氏法檢測ESR,散射比濁法測定IgG。ESR、IgG 均由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院檢驗科檢測。

        1.3 統(tǒng)計學方法

        采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計描述采用M(Q1, Q3)表示。對于不服從正態(tài)分布或方差不齊的定量資料采用秩和檢驗;相關(guān)性分析采用Spearman 等級相關(guān)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 病理分級

        根據(jù)Chisholm 唇腺病理分級分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組,各組H-E 染色結(jié)果顯示:Ⅰ、Ⅱ級唇腺組織腺泡大小均勻,導(dǎo)管排列整齊,無擴張,間質(zhì)無或少量炎性細胞浸潤(圖1A、B);Ⅲ、Ⅳ級唇腺組織腺泡大小不等,部分腺體萎縮,以導(dǎo)管周圍為主,間質(zhì)有1 個或數(shù)個淋巴細胞灶浸潤(圖1C、D)。

        2.2 唇 腺 組 織AQP5 的 表 達 及IL-21、β2-MG、ESR、IgG 濃度

        唇腺腺體免疫組化檢測結(jié)果顯示:AQP5 的表達水平隨著唇腺組織淋巴細胞數(shù)目的增加而減少。Ⅰ、Ⅱ組AQP5 表達主要在腺上皮及導(dǎo)管(圖2A、B);Ⅲ、Ⅳ組AQP5 表達減弱,主要分布在導(dǎo)管區(qū)(圖2C、D);4 組之間AQP5 表達的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。隨著唇腺組織淋巴細胞浸潤的增加,IL-21 濃度、β2-MG 濃度、ESR 值、IgG 濃度增加;4 組之間IL-21、ESR、IgG 的差異有統(tǒng)計學意義,β2-MG 差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

        圖1 Chisholm 唇腺病理分級(H-E 染色,×100)Fig 1 Pathological grades of Chisholm labial glands (H-E staining, ×100)

        表1 各組唇腺組織AQP5 的OD 值、IL-21 濃度、β2-MG 濃度、ESR 值和IgG 濃度Tab 1 OD of AQP5 in labial gland tissue, concentration of IL-21, β2-MG and IgG, and value of ESR of each group

        2.3 唇 腺 組 織AQP5 的 表 達 與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 的相關(guān)性

        將AQP5 的表達 水 平與IL-21、β2-MG、ESR、IgG進行相關(guān)性分析,結(jié)果表明,AQP5 的表達與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 均呈負相關(guān)(表2)。

        表2 唇腺組織AQP5 的表達與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 的相關(guān)性Tab 2 Correlation of AQP5 expression with IL-21, β2-MG, ESR and IgG in labial glands

        3 討論

        近年來,隨著對AQP5 研究的深入,其在pSS 發(fā)病中的作用得到肯定。AQP5 對水具有高度通透性,受自主神經(jīng)的調(diào)控,在唾液腺中大量表達[11]。它含有蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)磷酸化后的同源序列,受磷酸化作用的直接調(diào)節(jié);在某些條件下,AQP5 磷酸化后增加了細胞膜對水的通透性[12]。有研究[13]認為AQP5 表達異常會導(dǎo)致唾液、淚液分泌障礙。本研究從pSS 患者的唇腺組織淋巴細胞浸潤程度來探討AQP5 的表達水平與IL-21、β2-MG、ESR、IgG的關(guān)系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著唇腺組織淋巴細胞浸潤的增加,AQP5 的表達水平降低,推測可能與患者口干癥狀有關(guān)。且進一步的相關(guān)性分析表明,AQP5 的表達與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 呈負相關(guān)。

        IL-21 由濾泡輔助性T 細胞、Th17 細胞以及NK 細胞產(chǎn)生,可促進T、B 淋巴細胞增殖[14]。SS 患者的靶器官和血液之中,效應(yīng)T 細胞及其多種細胞因子的數(shù)量顯著增加。有學者[15]發(fā)現(xiàn),SS 患者外周血淋巴細胞及唇腺組織中IL-21 受體表達明顯高于其他結(jié)締組織病和健康對照組,并且IL-21 受體水平與類風濕因子、IgG、唇腺淋巴細胞浸潤程度呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)隨著pSS 患者唇腺組 織淋巴細胞浸潤的增加,血清IL-21 表達水平逐漸升高,因此,我們推測IL-21 與pSS 的發(fā)生發(fā)展和病情活動度有關(guān)。

        β2-MG 含量少且恒定,可參與抗原提呈過程,但其在SS 中所起的作用仍不完全清楚,其水平可能代表免疫反應(yīng)的整體活化程度[16]。有研究[17]表明,β2-MG 與自身抗體和系統(tǒng)受累有關(guān),可作為pSS 病情活動的觀察指標。本研究發(fā)現(xiàn)血清β2-MG 水平隨著唇腺組織淋巴細胞浸潤的增加,而逐漸升高,但各組間差異無統(tǒng)計學意義。產(chǎn)生該結(jié)果的原因,可能與樣本量少,分組類別及無健康對照組有關(guān)。

        AQP5 的信號通路之一為Toll 樣受體4(Toll like receptor, TLR4)/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)/核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)/AQP5 信號通路。NF-κB 的激活可以使AQP5 低表達,而NF-κB 是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路的下游調(diào)節(jié)因子[5]。IL-21 受體信號可激活MAPK 信號通路,進而在介導(dǎo)細胞增殖中發(fā)揮重要作用[18]。并且編碼β2-MG 的基因中,有1 個保守的調(diào)控元件為NF-κB 樣位點,作用是啟動增強子轉(zhuǎn)錄[19]。這說明AQP5 和IL-21、β2-MG 在信號通路上存在交叉,而在本研究中,AQP5 的表達與IL-21、β2-MG 呈負相關(guān)。因此,進一步研究其聯(lián)系機制,明確AQP5 及其信號通路在pSS 發(fā)病過程中的作用,對臨床診療具有重要意義。

        綜上所述,本研究結(jié)果表明pSS 患者隨著唇腺組織淋巴細胞的浸潤增多,AQP5 表達減少,IL-21、β2-MG、IgG 表達增加,ESR 增快,且AQP5 水平與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 呈負相關(guān)。推測AQP5、IL-21、β2-MG與pSS 病情活動存在相關(guān)性。因此,AQP5 聯(lián)合IL-21、β2-MG 有望成為監(jiān)測pSS 病情活動的生物學標志物。由于患者的數(shù)量受限及統(tǒng)計的參數(shù)較少,沒有進一步探討AQP5 在pSS 中的發(fā)病機制,有待后續(xù)大樣本的進一步研究,為治療SS 提供新的思路。

        參·考·文·獻

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