王 領(lǐng) ，張 娜，王艷玲 ，趙福濤

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，上海201999；2. 上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，上海200135

干燥綜合征（Sj?gren’s syndrome, SS）是一種慢性自身免疫性疾病，以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)外分泌腺為特征，導(dǎo)致腺體分泌功能逐漸喪失，嚴(yán)重者累及腺外器官，引起系統(tǒng)性損害[1]。其病因及發(fā)病機(jī)制不明，是一種多因素疾?。涵h(huán)境因素觸發(fā)免疫反應(yīng)，損害具有遺傳易感性個(gè)體的唾液腺和淚腺細(xì)胞[2]。SS 屬于全球性疾病，在我國(guó)的患病率為0.29%～0.77%，男女比約為1:9[3]。目前尚無(wú)肯定的藥物改變SS 的病程。主要是采取措施改善癥狀，控制和延緩因免疫反應(yīng)而引起的組織器官損害的進(jìn)展，預(yù)防繼發(fā)性感染等并發(fā)癥[4]。近些年發(fā)現(xiàn)水通道蛋白5（aquaporin 5, AQP5）在SS 中起著重要的作用，其主要功能為：維持滲透壓平衡及調(diào)節(jié)水液轉(zhuǎn)運(yùn)；參與腺體分泌及細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡。因此，AQP5 有可能是緩解SS 癥狀的藥物的作用靶點(diǎn)[5]。目前對(duì)AQP5 的研究主要局限在嚙齒類動(dòng)物，對(duì)其在人體唇腺腺體中的作用還了解甚少。

SS 在臨床上分為原發(fā)性和繼發(fā)性2 種。前者指不具有另一個(gè)診斷明確的結(jié)締組織病，后者主要繼發(fā)于其他自身免疫病。原發(fā)性SS（primary SS, pSS）的基本病理變化為唾液腺呈灶性CD4+T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，B 淋巴細(xì)胞高反應(yīng)性，臨床上可以看到多數(shù)pSS 患者體內(nèi)存在著高免疫球蛋白血癥[6]。因此，常用紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）、免疫球蛋白G（immunoglobulin, IgG）以及唇腺組織病理的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度來(lái)提示pSS患者的病情活動(dòng)。血清白細(xì)胞介素-21（interleukin-21, IL-21）作為一種多效性的細(xì)胞因子，在多種自身免疫性疾病中均表現(xiàn)出明顯的致病性。既往研究[7]顯示，SS 患者中血清IL-21 表達(dá)水平增高，且與唇腺組織中淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)程度有關(guān)，提示IL-21 可能參與了pSS 的發(fā)病過(guò)程。β2微球蛋白（β2-microglobulin, β2-MG）主要由淋巴細(xì)胞合成，被發(fā)現(xiàn)在SS 患者的血清和唾液中含量明顯升高，且與唇腺活檢中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)[8]。

因此，為探討唇腺AQP5 的表達(dá)與血清IL-21、β2-MG 及病情活動(dòng)的關(guān)系，本研究擬對(duì)pSS 患者進(jìn)行微創(chuàng)唇腺活檢，用免疫組織化學(xué)（免疫組化）檢測(cè)唇腺中AQP5 的表達(dá)，采用ELISA 方法檢測(cè)患者血清中IL-21 和β2-MG 的水平，同時(shí)檢測(cè)ESR、IgG 等炎癥指標(biāo)的水平，并對(duì)AQP5 與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 的相關(guān)性進(jìn)行分析，以期為判斷pSS 患者的病情活動(dòng)提供一種重要的生物學(xué)標(biāo)志物，便于臨床評(píng)估病情和指導(dǎo)治療。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016 年7 月—2018 年1 月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診初診且未經(jīng)治療的pSS 患者39 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2002 年SS 分類標(biāo)準(zhǔn)[9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并急慢性感染及惡性腫瘤患者。39例患者中，男性1 例，女性38 例，年齡26 ～79 歲，平均年齡52.74 歲。在簽署知情同意書(shū)后，對(duì)患者進(jìn)行唇腺活檢，并采集晨起空腹血清。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（編號(hào)HKDL2017295），所有患者資料完整且來(lái)源真實(shí)可靠。

1.2 研究方法

1.2.1分組方法 所有研究對(duì)象均行唇腺活檢。唇腺腺體經(jīng)中性福爾馬林液固定24 h 后石蠟包埋，制成4 μm 切片，常規(guī)脫蠟后行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, H-E）染色。病理標(biāo)本由病理科醫(yī)師和臨床醫(yī)師于倒置顯微鏡下共同完成觀察，每例患者1 張片子，5 個(gè)視野。對(duì)結(jié)果有分歧的標(biāo)本，請(qǐng)高年資病理醫(yī)師再次審核。根據(jù)Chisholm唇腺病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[10]，將所有標(biāo)本分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個(gè)等級(jí)，分別代表少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、中等量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、1 個(gè)淋巴細(xì)胞灶浸潤(rùn)、多個(gè)淋巴細(xì)胞灶浸潤(rùn)（4 mm2組織內(nèi)至少50 個(gè)淋巴細(xì)胞聚集于唇腺間質(zhì)為1 個(gè)灶）。根據(jù)不同等級(jí)相應(yīng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 組。

1.2.2免疫組化檢測(cè) 按照AQP5 免疫組化試劑盒操作步驟進(jìn)行AQP5 表達(dá)的檢測(cè)，步驟簡(jiǎn)述如下。將包埋好的石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片，并進(jìn)行脫蠟及抗原熱修復(fù)。PBS 洗滌后，使用5% BSA（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行封閉，使用AQP5 抗體（美國(guó)Aきnity 公司，1:200 稀釋）4℃孵育過(guò)夜；PBS 洗滌后加入山羊抗兔IgG 抗體（美國(guó)Jackson 公司），并添加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（北京中山金橋生物公司），PBS 洗滌3 次后，進(jìn)行DAB（中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司）顯色。AQP5 表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞呈棕黃色，在倒置顯微鏡下每張切片取5 個(gè)不同視野，在相同面積下用Image-Pro-Plus 6.0 軟件進(jìn)行光密度（optical density, OD）計(jì)算。

1.2.3ELISA 檢測(cè) 收集患者新鮮靜脈血標(biāo)本，900×g 離心10 min，將血清轉(zhuǎn)移至EP 管中。依據(jù)ELISA 試劑盒操作方法檢測(cè)血清IL-21（美國(guó)Santa Cruz 公司）、β2-MG（廈門慧嘉生物科技有限公司）水平。步驟簡(jiǎn)述如下：按要求對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋并加樣，將稀釋后的血清樣品加入酶標(biāo)板底部。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品加樣均為100 μL/孔；用封板膜封住反應(yīng)孔，室溫孵育120 min；揭掉封板膜，棄掉液體，甩干后加入工作濃度洗滌液，洗滌重復(fù)4 ～5次。每孔加入酶標(biāo)抗體100 μL/孔，孵育1 h。洗滌后加入酶結(jié)合物100 μL，孵育并洗滌后，加入顯色劑TMB 溶液100 μL/孔，孵育20 min 后加入終止液50 μL/孔，混勻后立即使用酶標(biāo)儀測(cè)量D （450 nm）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算IL-21、β2-MG 表達(dá)水平。

1.2.4ESR、IgG 的測(cè)定 采用魏氏法檢測(cè)ESR，散射比濁法測(cè)定IgG。ESR、IgG 均由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)描述采用M（Q1, Q3）表示。對(duì)于不服從正態(tài)分布或方差不齊的定量資料采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理分級(jí)

根據(jù)Chisholm 唇腺病理分級(jí)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，各組H-E 染色結(jié)果顯示：Ⅰ、Ⅱ級(jí)唇腺組織腺泡大小均勻，導(dǎo)管排列整齊，無(wú)擴(kuò)張，間質(zhì)無(wú)或少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A、B）；Ⅲ、Ⅳ級(jí)唇腺組織腺泡大小不等，部分腺體萎縮，以導(dǎo)管周圍為主，間質(zhì)有1 個(gè)或數(shù)個(gè)淋巴細(xì)胞灶浸潤(rùn)（圖1C、D）。

2.2 唇 腺 組 織AQP5 的 表 達(dá) 及IL-21、β2-MG、ESR、IgG 濃度

唇腺腺體免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：AQP5 的表達(dá)水平隨著唇腺組織淋巴細(xì)胞數(shù)目的增加而減少。Ⅰ、Ⅱ組AQP5 表達(dá)主要在腺上皮及導(dǎo)管（圖2A、B）；Ⅲ、Ⅳ組AQP5 表達(dá)減弱，主要分布在導(dǎo)管區(qū)（圖2C、D）；4 組之間AQP5 表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。隨著唇腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的增加，IL-21 濃度、β2-MG 濃度、ESR 值、IgG 濃度增加；4 組之間IL-21、ESR、IgG 的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，β2-MG 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

圖1 Chisholm 唇腺病理分級(jí)（H-E 染色，×100）Fig 1 Pathological grades of Chisholm labial glands （H-E staining, ×100）

表1 各組唇腺組織AQP5 的OD 值、IL-21 濃度、β2-MG 濃度、ESR 值和IgG 濃度Tab 1 OD of AQP5 in labial gland tissue, concentration of IL-21, β2-MG and IgG, and value of ESR of each group

2.3 唇 腺 組 織AQP5 的 表 達(dá) 與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 的相關(guān)性

將AQP5 的表達(dá) 水 平與IL-21、β2-MG、ESR、IgG進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，AQP5 的表達(dá)與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 均呈負(fù)相關(guān)（表2）。

表2 唇腺組織AQP5 的表達(dá)與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 的相關(guān)性Tab 2 Correlation of AQP5 expression with IL-21, β2-MG, ESR and IgG in labial glands

3 討論

近年來(lái)，隨著對(duì)AQP5 研究的深入，其在pSS 發(fā)病中的作用得到肯定。AQP5 對(duì)水具有高度通透性，受自主神經(jīng)的調(diào)控，在唾液腺中大量表達(dá)[11]。它含有蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）和蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）磷酸化后的同源序列，受磷酸化作用的直接調(diào)節(jié)；在某些條件下，AQP5 磷酸化后增加了細(xì)胞膜對(duì)水的通透性[12]。有研究[13]認(rèn)為AQP5 表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致唾液、淚液分泌障礙。本研究從pSS 患者的唇腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度來(lái)探討AQP5 的表達(dá)水平與IL-21、β2-MG、ESR、IgG的關(guān)系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著唇腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的增加，AQP5 的表達(dá)水平降低，推測(cè)可能與患者口干癥狀有關(guān)。且進(jìn)一步的相關(guān)性分析表明，AQP5 的表達(dá)與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 呈負(fù)相關(guān)。

IL-21 由濾泡輔助性T 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞以及NK 細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)T、B 淋巴細(xì)胞增殖[14]。SS 患者的靶器官和血液之中，效應(yīng)T 細(xì)胞及其多種細(xì)胞因子的數(shù)量顯著增加。有學(xué)者[15]發(fā)現(xiàn)，SS 患者外周血淋巴細(xì)胞及唇腺組織中IL-21 受體表達(dá)明顯高于其他結(jié)締組織病和健康對(duì)照組，并且IL-21 受體水平與類風(fēng)濕因子、IgG、唇腺淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)隨著pSS 患者唇腺組 織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的增加，血清IL-21 表達(dá)水平逐漸升高，因此，我們推測(cè)IL-21 與pSS 的發(fā)生發(fā)展和病情活動(dòng)度有關(guān)。

β2-MG 含量少且恒定，可參與抗原提呈過(guò)程，但其在SS 中所起的作用仍不完全清楚，其水平可能代表免疫反應(yīng)的整體活化程度[16]。有研究[17]表明，β2-MG 與自身抗體和系統(tǒng)受累有關(guān)，可作為pSS 病情活動(dòng)的觀察指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)血清β2-MG 水平隨著唇腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的增加，而逐漸升高，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。產(chǎn)生該結(jié)果的原因，可能與樣本量少，分組類別及無(wú)健康對(duì)照組有關(guān)。

AQP5 的信號(hào)通路之一為Toll 樣受體4（Toll like receptor, TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）/核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）/AQP5 信號(hào)通路。NF-κB 的激活可以使AQP5 低表達(dá)，而NF-κB 是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號(hào)通路的下游調(diào)節(jié)因子[5]。IL-21 受體信號(hào)可激活MAPK 信號(hào)通路，進(jìn)而在介導(dǎo)細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[18]。并且編碼β2-MG 的基因中，有1 個(gè)保守的調(diào)控元件為NF-κB 樣位點(diǎn)，作用是啟動(dòng)增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄[19]。這說(shuō)明AQP5 和IL-21、β2-MG 在信號(hào)通路上存在交叉，而在本研究中，AQP5 的表達(dá)與IL-21、β2-MG 呈負(fù)相關(guān)。因此，進(jìn)一步研究其聯(lián)系機(jī)制，明確AQP5 及其信號(hào)通路在pSS 發(fā)病過(guò)程中的作用，對(duì)臨床診療具有重要意義。

綜上所述，本研究結(jié)果表明pSS 患者隨著唇腺組織淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)增多，AQP5 表達(dá)減少，IL-21、β2-MG、IgG 表達(dá)增加，ESR 增快，且AQP5 水平與IL-21、β2-MG、ESR、IgG 呈負(fù)相關(guān)。推測(cè)AQP5、IL-21、β2-MG與pSS 病情活動(dòng)存在相關(guān)性。因此，AQP5 聯(lián)合IL-21、β2-MG 有望成為監(jiān)測(cè)pSS 病情活動(dòng)的生物學(xué)標(biāo)志物。由于患者的數(shù)量受限及統(tǒng)計(jì)的參數(shù)較少，沒(méi)有進(jìn)一步探討AQP5 在pSS 中的發(fā)病機(jī)制，有待后續(xù)大樣本的進(jìn)一步研究，為治療SS 提供新的思路。

參·考·文·獻(xiàn)

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