張詩韻，賴光云，汪 俊

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學院兒童口腔科，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室，上海市口腔醫(yī)學研究所，上海 200011

外傷、發(fā)育異常和齲病等常導致年輕恒牙出現(xiàn)牙髓壞死或根尖周炎，從而使其牙根發(fā)育終止。傳統(tǒng)的根尖誘導成形術及根尖屏障術雖可以消除炎癥，卻不能增加根管壁的厚度和牙根長度，遠期治療效果不佳。目前，牙髓再生治療即使用生物學方法誘導新生牙髓組織生成，以替代原有壞死的牙髓組織、促進牙根繼續(xù)發(fā)育等，成為了治療該類疾病的新方法[1]。有研究[2-3]表明，血凝塊可誘導根管內形成類牙髓樣組織，促進根尖孔閉合。2019 年美國牙體牙髓病學會發(fā)布的Guide to Clinical Endodontics，將刺激根尖出血納入了牙髓再生治療的標準治療流程[4]。然而在臨床操作中，該方法常面臨根尖出血量不足等問題，同時遠期易引發(fā)牙冠變色、根管鈣化等并發(fā)癥[5]。近來有學者提出，第3 代血小板濃縮物[如濃縮生長因子（concentrated growth factor，CGF）]富含多種高濃度的生長因子，能促進牙根尖乳頭干細胞和牙髓細胞的增殖、遷 移和分化[6-7]；同時，其特殊的纖維蛋白網(wǎng)狀結構也可為組織再生提供支架，因此可作為一種較理想的支架替代血凝塊應用于牙髓再生治療[8]。既往研究[9]發(fā)現(xiàn)，以CGF 作為支架可誘導根管內形成類牙髓樣組織，但目前尚無研 究就其與血凝塊間的差異進行比較?；诖耍狙芯客ㄟ^動物實驗探究CGF 與血凝塊誘導根管內組織再生的能力之間的差異，以期為CGF 臨床應用于牙髓再生治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象、主要儀器和試劑

1.1.1實驗動物 選取4 周齡雄性裸鼠18 只[由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，生產許可證號：SYXK（滬）2017-0008]，體質量15 ～20 g。裸鼠飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院SPF 級動物房的標準籠中，使用許可證號：SYXK（滬）2016-0016。裸鼠飼以標準飼料，自由攝食、飲水。飼養(yǎng)條件如下：光照時間為8:00 ～18:00，溫度為26 ℃，濕度為50%，環(huán)境噪聲＜60 dB。動物飼養(yǎng)條件符合《實驗動物管理條例》，所有動物相關操作均遵循上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院有關動物倫理規(guī)定及條例。

1.1.2試驗對象 向社會招募志愿者，納入標準：平素身體健康，無全身系統(tǒng)性疾病，否認處于妊娠期或月經期，采血前3 個月內未服用影響血小板功能的藥物（如阿司匹林等），血小板計數(shù)正常。本研究已通過上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會的審批（審批號：2018-18-T18）。在研究開始前，已向志愿者告知研究內容和預期風險，所有志愿者均簽署了知情同意書。

1.1.3主要儀器及試劑 Medifuge 離心機（Silfradent，意大利），活性血漿蛋白凝膠（activated plasma albumin gel，A.P.A.G）恒溫儀（Silfradent，意大利），光學顯微鏡（OLYMPUS，日本）。鼠抗S-100 一抗（Dako EnVisionTM，丹麥），辣根過氧化物酶標記羊抗鼠兔二抗（Dako EnVisionTM，丹麥），鼠抗CD31 一抗（Abcam，英國），綠色熒光標記羊抗鼠二抗（Santa Cruz Biotechnology，美國）。改良Masson 三色染色液試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1選取離體牙 選取于上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔外科門診中拔除的上、下頜恒前磨牙36顆。選取標準：患牙經影像學及臨床檢查，未發(fā)現(xiàn)有齲病、牙髓炎、根尖周炎及牙周炎等疾病，且無明顯缺損。拔除后，將患牙置于生理鹽水中，并于4 ℃保存（保存時間不超過1 個月）。

1.2.2 制備離體牙牙根片段 用手術刀片刮除離體牙外周的軟組織，用高速渦輪手機截去牙冠，并用拔髓針摘除牙髓。將離體牙制備成長5 ～6 mm 的牙根片段，管徑1 ～3 mm。于室溫下，使用生理鹽水超聲蕩洗牙根片段1 min。自然晾干后，向牙根片段的一端充填玻璃離子以封閉根管，深度約 1 mm，另一端則開放。采用環(huán)氧乙烷對制備后的牙根片段進行消毒，以備后用。

1.2.3 制備CGF 抽取志愿者上臂靜脈全血，配平放入Medifuge 離心機中，選擇CGF 程序進行離心。離心完畢后，全血分層為血清層、去血小板血漿層、富血小板血漿層、白膜層和紅細胞層。用無菌針頭吸取0.3 mL 白膜層，再用另一無菌針頭吸取0.6 mL 富血小板血漿層，于A.P.A.G 恒溫儀中75 ℃加熱20 min，取出后自然冷卻至室溫。隨后，用三通管將上述2 種成分混勻，形成CGF。

1.2.4 分組及裸鼠體內移植 于超凈臺中完成牙根片段移植操作。牙根片段被隨機分為實驗組（n=18）和對照組（n=18）；其中，向前者注入CGF，向后者注入全血后形成血凝塊。將裸鼠局部麻醉后，在其背部做2 個線性切口，鈍性分離兩側皮膚。分別于每只裸鼠背部左側、右側皮下植入1 個實驗組樣本和1 個對照組樣本后進行縫合。

1.2.5 組織學觀察 分別于移植4 周或6 周后，采用頸部脫臼法處死裸鼠后取樣。用10%中性緩沖福爾馬林組織固定液固定樣本48 h 后，用10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣，繼而浸蠟、包埋。修整蠟塊后，用石蠟切片機在1 mm 深度處橫向切片，切片厚度為4 μm。采用蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H-E staining，H-E 染色）、免疫組織化學染色、免疫熒光染色和改良Masson 染色對上述切片進行組織學觀察。

1.2.6 新生組織分析 H-E 染色后，在低倍鏡下觀察每張切片是否有新生組織長入及其結構變化，計算各組新生組織長入率。選取能看到完整根管橫截面的視野并拍照，運用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量新生組織面積和根管總面積，計算新生組織面積占比。每個樣本測量3 次取平均值。公式為：新生組織面積占比=新生組織面積/根管總面積×100%[10]。

根據(jù)既往實驗結果[11]，再生組織中可觀察到膠原纖維、血管、神經纖維和脂肪組織。而在本研究中，由于脂肪組織非健康牙髓中包含的組織，因此僅就前3 種成分進行定量分析。

（1）微血管密度：CD31 陽性表達于血管內皮細胞，可用于反映微血管的數(shù)量[12]。經免疫熒光染色后，于光學顯微鏡（×400）下觀察到熒光綠色組織，即判定為CD31陽性表達。每張切片隨機選取3 個視野，計數(shù)CD31＋細胞個數(shù)后取平均值，作為CD31 標記的微血管密度值。

（2）新生神經纖維面積占比、新生膠原纖維面積占比：S-100 陽性表達于牙髓中的神經纖維[13]，可用于反映神經纖維的數(shù)量。經免疫組織化學染色后，于光學顯微鏡（×400）下觀察到黃褐色組織，即判定為S-100 蛋白的陽性表達。每張切片隨機選取3 個視野并拍照，通過Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量S-100 蛋白陽性表達面積和視野總面積，并計算新生神經纖維面積占比。新生神經纖維面積占比=S-100 蛋白陽性表達面積/視野總面積×100%。同時，經改良Masson 染色后觀察，如見藍色組織則判定為膠原纖維表達，并用同樣的方法測量新生膠原纖維面積和視野總面積。新生膠原纖維面積占比=膠原纖維面積/視野總面積×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法

運用SPSS 24.0 軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。對各組新生組織長入率采用Fisher's 確切概率法進行比較。采用Shapiro-Wilk 檢驗對定量資料的正態(tài)分布情況進行分析，符合正態(tài)分布的定量資料以x±s 表示，采用獨立樣本t 檢驗進行比較；不符合正態(tài)分布的定量資料以M（Q1，Q3）表示，采用兩獨立樣本秩和檢驗進行比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 皮下移植情況及2 組樣本獲取

牙根片段植入裸鼠2 周后，實驗組和對照組中分別有2 個、3 個移植位點的周圍出現(xiàn)傷口愈合不良，導致樣本部分暴露在體外。第4 周初，已暴露樣本脫落后隨即被丟棄，裸鼠皮下傷口自行愈合。移植4 周后，隨機處死9 只裸鼠，取出其皮下所有樣本，獲得實驗組、對照組各8 個樣本。移植6 周后，處死剩余9 只裸鼠，并獲得8 個實驗組樣本、7 個對照組樣本。獲取樣本時可見樣本的周圍由筋 膜包裹，且2 組部分樣本的根管表面均可見血管穿過（圖 1）。

圖1 于移植4 周及6 周后獲取裸鼠皮下樣本的觀察Fig 1 Observation on obtaining subcutaneous samples from the nude mice after 4 and 6 weeks of implantation

2.2 組織學觀察

2.2.1 新生組織總量分析 通過H-E 染色觀察根管內新生組織的長入情況，結果顯示在第4 周結束時2 組的長入率均為87.5%，在第6 周結束時實驗組和對照組的長入率分別為100%、85.7%且組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.886）。隨后，對沒有新生組織長入的根管進行觀察發(fā)現(xiàn)，有破碎的組織或紅 細胞團塊出現(xiàn)。通過對各組新生組織面積占比統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，移植4 周及6 周后實驗組均高于對照組（均P＜0.05）（表1）。

表 1 2 組新生組織面積占比比較（%）Tab 1 Comparison of the proportion of the newly formed tissue between the two groups （%）

2.2.2 新生組織結構分析 H-E 染色結果（圖2）顯示，2 組樣本的根管內形成的新生組織結構類似，即新生組織的中央為空泡狀的脂肪組織，周圍有膠原纖維交織呈網(wǎng)狀結構，包含小血管及神經纖維組織；未見類成牙本質細胞及新生牙本質形成。與對照組相比，實驗組新生組織的部分位置與根管壁連接更緊密，空泡狀的脂肪組織更少，膠原纖維更為致密；同時，該組新生組織的纖維支架內可見明顯的血管和團塊狀的神經纖維，血管內可見散在的紅細胞。而各個組內比較發(fā)現(xiàn)，對照組在移植4 周和6 周后的新生組織成分結構間無明顯差別；實驗組在移植6 周后較4 周后所形成的血管壁更厚，紅細胞團塊更密集。

圖2 2組樣本根管內新生組織的H-E染色結果Fig 2 H-E staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

免疫組織化學染色（圖3）、免疫熒光染色（圖4）及改良Masson 染色（圖5）結果顯示，2 組樣本在移植4 周和6 周后均可見S-100 蛋白、CD31 和膠原纖維的表達；

圖3 2 組樣本根管內新生組織的免疫組織化學染色結果Fig 3 Immunohistochemical staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

從而證實，新生組織的主要成分包含神經纖維、微血管及膠原纖維。

圖4 2 組樣本根管內新生組織的免疫熒光染色結果Fig 4 Immunofluorescence staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

圖5 2 組樣本根管內新生組織的改良Masson 染色結果Fig 5 Modified Masson staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

2.2.3 新生組織各成分定量分析 新生組織各成分的定量分析結果見表2。組間比較結果顯示，移植4 周后，實驗組新生組織中的微血管密度高于對照組（P=0.012）；移植6 周后，實驗組較對照組能誘導生成更多的神經纖維（P=0.047）和血管（P=0.022），但2 組的膠原纖維生成量間差異無統(tǒng)計學意義。組內比較結果顯示，2 組在移植6周后的膠原纖維生成量較4 周后更多（均P＜0.05）。

表 2 2 組樣本新生組織中各成分的定量分析Tab 2 Quantitative analysis of the newly formed tissue composition in the two groups of samples

3 討論

本實驗針對CGF 與血凝塊誘導根管內組織再生的差異進行分析，結果發(fā)現(xiàn)兩者均可誘導新生組織形成且組織結構類似，其中實驗組的誘導生成量更多，該組的新生組織中神經纖維、血管的生成量顯著高于對照組。

本研究中，實驗組和對照組的新生組織長入率均高于85%，與韋維[14]等的研究結果近似，高于動物體內實驗[12]的研究結果，這可能與有效控制感染有關。研究[15]顯示，有效控制感染是牙髓再生治療成功的前提。在臨床操作中，醫(yī)師常使用次氯酸鈉溶液對根管內進行沖洗消毒，以清除根管內的感染組織。然而有研究[16]表明，次氯酸鈉溶液在消除感染的同時也具有一定的細胞毒性。因此，為最大程度地促進新生組織的形成，本實驗選擇使用環(huán)氧乙烷而非次氯酸鈉溶液對牙根片段進行消毒，以達到控制感染目的。

本研究中，根管內新生組織的中央可見空泡狀的脂肪組織，周圍有膠原纖維交織呈網(wǎng)狀結構，與Galler等[11]應用體外生長因子與人工支架誘導生成的新生組織結構類似。本研究還發(fā)現(xiàn)，在2 組新生組織的纖維網(wǎng)中可見小血管和團塊狀的神經纖維組織，這可能與自體血及其濃縮物含有多種與牙髓再生關系密切的生長因子有關[7]。因此，在目前應用的幾種支架類型中，與體外合成的支架相比，自體血及其濃縮物能誘導更多的根管周圍的與牙髓再生有關的細胞遷移和分化，形成新生血管[17]和神經纖維[18]。動物體內實驗[12]和臨床病例[19-20]等研究發(fā)現(xiàn)，血凝塊和血小板濃縮物均能促進根管內新生血管的形成和患牙感覺功能的恢復；且本研究的發(fā)現(xiàn)或可部分解釋以上結論。但也有學者在動物實驗[21]中發(fā)現(xiàn)，根管內形成的新生組織為類牙周樣組織而非類牙髓樣組織，這可能與生長因子誘導牙周來源的細胞增殖和分化有關。因此，在臨床應用中，作為第3 代血小板濃縮物，CGF 是否能真正誘導牙髓組織再生，CGF 所含的生長因子在誘導再生中發(fā)揮的具體作用，仍需進一步分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，CGF 較血凝塊能誘導形成更多的新生組織，且其神經纖維和血管的生成量亦較高，這可能與CGF 的獨特結構有關。在CGF 的制備過程中，其特殊的離心速度使血小板破裂后釋放出大量的生長因子和細胞因子。這些因子被包裹在致密的三維網(wǎng)狀纖維蛋白結構中，通過被緩慢釋放從而促進成纖維細胞、血管內皮細胞和施萬細胞的遷移和黏附[8]。此外，有學者經體外實驗發(fā)現(xiàn)，CGF 的纖維蛋白網(wǎng)絡結構中存在CD34＋細胞[22-23]，繼而表明CGF 有促進血管新生的潛能。

有動物體內實驗[9,24]發(fā)現(xiàn)，將CGF 作為支架應用于牙髓再生治療后，可在根管內觀察到類牙髓組織、柵欄狀排列的成牙本質細胞和散在的血管。遺憾的是，在本研究的實驗組和對照組根管內均未發(fā)現(xiàn)類成牙本質細胞和新生的牙本質層。有學者認為，其原因可能與移植的部位有關。Ruangsawasdi 等[25]比較了移植于大鼠背部和頭部所產生的新生組織間的差異，結果發(fā)現(xiàn)移植于背部產生的新生組織與本研究較為類似，而移植于頭部的新生組織中可見類成牙本質細胞。雖然頭部的微環(huán)境可更好的模擬牙槽窩環(huán)境，也更有利于細胞的歸巢，但裸鼠頭部皮下空間狹小，無法同時植入2 個離體牙根片段，因此本研究僅于裸鼠背部進行移植。同時，針對更理想的牙髓再生前期研究的動物模型的探索或將是牙髓再生研究的一個新方向。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，CGF 表現(xiàn)出了可誘導周圍組織再生和血管長入的能力，其誘導產生的新生組織與對照組相比，結構類似、數(shù)量更多。雖然有學者在體內研究中發(fā)現(xiàn)CGF 可誘導產生類牙本質，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)類成牙本質細胞和礦化組織的形成。因此，有關于CGF在臨床治療中是否能真正誘導牙髓再生，仍需要更多的動物實驗和臨床實驗加以證實。

參·考·文·獻

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