張?jiān)婍?，賴光云，?俊

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院兒童口腔科，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011

外傷、發(fā)育異常和齲病等常導(dǎo)致年輕恒牙出現(xiàn)牙髓壞死或根尖周炎，從而使其牙根發(fā)育終止。傳統(tǒng)的根尖誘導(dǎo)成形術(shù)及根尖屏障術(shù)雖可以消除炎癥，卻不能增加根管壁的厚度和牙根長度，遠(yuǎn)期治療效果不佳。目前，牙髓再生治療即使用生物學(xué)方法誘導(dǎo)新生牙髓組織生成，以替代原有壞死的牙髓組織、促進(jìn)牙根繼續(xù)發(fā)育等，成為了治療該類疾病的新方法[1]。有研究[2-3]表明，血凝塊可誘導(dǎo)根管內(nèi)形成類牙髓樣組織，促進(jìn)根尖孔閉合。2019 年美國牙體牙髓病學(xué)會(huì)發(fā)布的Guide to Clinical Endodontics，將刺激根尖出血納入了牙髓再生治療的標(biāo)準(zhǔn)治療流程[4]。然而在臨床操作中，該方法常面臨根尖出血量不足等問題，同時(shí)遠(yuǎn)期易引發(fā)牙冠變色、根管鈣化等并發(fā)癥[5]。近來有學(xué)者提出，第3 代血小板濃縮物[如濃縮生長因子（concentrated growth factor，CGF）]富含多種高濃度的生長因子，能促進(jìn)牙根尖乳頭干細(xì)胞和牙髓細(xì)胞的增殖、遷 移和分化[6-7]；同時(shí)，其特殊的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也可為組織再生提供支架，因此可作為一種較理想的支架替代血凝塊應(yīng)用于牙髓再生治療[8]。既往研究[9]發(fā)現(xiàn)，以CGF 作為支架可誘導(dǎo)根管內(nèi)形成類牙髓樣組織，但目前尚無研 究就其與血凝塊間的差異進(jìn)行比較。基于此，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究CGF 與血凝塊誘導(dǎo)根管內(nèi)組織再生的能力之間的差異，以期為CGF 臨床應(yīng)用于牙髓再生治療提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象、主要儀器和試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取4 周齡雄性裸鼠18 只[由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（滬）2017-0008]，體質(zhì)量15 ～20 g。裸鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物房的標(biāo)準(zhǔn)籠中，使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2016-0016。裸鼠飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由攝食、飲水。飼養(yǎng)條件如下：光照時(shí)間為8:00 ～18:00，溫度為26 ℃，濕度為50%，環(huán)境噪聲＜60 dB。動(dòng)物飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，所有動(dòng)物相關(guān)操作均遵循上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院有關(guān)動(dòng)物倫理規(guī)定及條例。

1.1.2試驗(yàn)對(duì)象 向社會(huì)招募志愿者，納入標(biāo)準(zhǔn)：平素身體健康，無全身系統(tǒng)性疾病，否認(rèn)處于妊娠期或月經(jīng)期，采血前3 個(gè)月內(nèi)未服用影響血小板功能的藥物（如阿司匹林等），血小板計(jì)數(shù)正常。本研究已通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批（審批號(hào)：2018-18-T18）。在研究開始前，已向志愿者告知研究內(nèi)容和預(yù)期風(fēng)險(xiǎn)，所有志愿者均簽署了知情同意書。

1.1.3主要儀器及試劑 Medifuge 離心機(jī)（Silfradent，意大利），活性血漿蛋白凝膠（activated plasma albumin gel，A.P.A.G）恒溫儀（Silfradent，意大利），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，日本）。鼠抗S-100 一抗（Dako EnVisionTM，丹麥），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠兔二抗（Dako EnVisionTM，丹麥），鼠抗CD31 一抗（Abcam，英國），綠色熒光標(biāo)記羊抗鼠二抗（Santa Cruz Biotechnology，美國）。改良Masson 三色染色液試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1選取離體牙 選取于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔外科門診中拔除的上、下頜恒前磨牙36顆。選取標(biāo)準(zhǔn)：患牙經(jīng)影像學(xué)及臨床檢查，未發(fā)現(xiàn)有齲病、牙髓炎、根尖周炎及牙周炎等疾病，且無明顯缺損。拔除后，將患牙置于生理鹽水中，并于4 ℃保存（保存時(shí)間不超過1 個(gè)月）。

1.2.2 制備離體牙牙根片段 用手術(shù)刀片刮除離體牙外周的軟組織，用高速渦輪手機(jī)截去牙冠，并用拔髓針摘除牙髓。將離體牙制備成長5 ～6 mm 的牙根片段，管徑1 ～3 mm。于室溫下，使用生理鹽水超聲蕩洗牙根片段1 min。自然晾干后，向牙根片段的一端充填玻璃離子以封閉根管，深度約 1 mm，另一端則開放。采用環(huán)氧乙烷對(duì)制備后的牙根片段進(jìn)行消毒，以備后用。

1.2.3 制備CGF 抽取志愿者上臂靜脈全血，配平放入Medifuge 離心機(jī)中，選擇CGF 程序進(jìn)行離心。離心完畢后，全血分層為血清層、去血小板血漿層、富血小板血漿層、白膜層和紅細(xì)胞層。用無菌針頭吸取0.3 mL 白膜層，再用另一無菌針頭吸取0.6 mL 富血小板血漿層，于A.P.A.G 恒溫儀中75 ℃加熱20 min，取出后自然冷卻至室溫。隨后，用三通管將上述2 種成分混勻，形成CGF。

1.2.4 分組及裸鼠體內(nèi)移植 于超凈臺(tái)中完成牙根片段移植操作。牙根片段被隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n=18）和對(duì)照組（n=18）；其中，向前者注入CGF，向后者注入全血后形成血凝塊。將裸鼠局部麻醉后，在其背部做2 個(gè)線性切口，鈍性分離兩側(cè)皮膚。分別于每只裸鼠背部左側(cè)、右側(cè)皮下植入1 個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣本和1 個(gè)對(duì)照組樣本后進(jìn)行縫合。

1.2.5 組織學(xué)觀察 分別于移植4 周或6 周后，采用頸部脫臼法處死裸鼠后取樣。用10%中性緩沖福爾馬林組織固定液固定樣本48 h 后，用10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣，繼而浸蠟、包埋。修整蠟塊后，用石蠟切片機(jī)在1 mm 深度處橫向切片，切片厚度為4 μm。采用蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H-E staining，H-E 染色）、免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光染色和改良Masson 染色對(duì)上述切片進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.2.6 新生組織分析 H-E 染色后，在低倍鏡下觀察每張切片是否有新生組織長入及其結(jié)構(gòu)變化，計(jì)算各組新生組織長入率。選取能看到完整根管橫截面的視野并拍照，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量新生組織面積和根管總面積，計(jì)算新生組織面積占比。每個(gè)樣本測量3 次取平均值。公式為：新生組織面積占比=新生組織面積/根管總面積×100%[10]。

根據(jù)既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11]，再生組織中可觀察到膠原纖維、血管、神經(jīng)纖維和脂肪組織。而在本研究中，由于脂肪組織非健康牙髓中包含的組織，因此僅就前3 種成分進(jìn)行定量分析。

（1）微血管密度：CD31 陽性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可用于反映微血管的數(shù)量[12]。經(jīng)免疫熒光染色后，于光學(xué)顯微鏡（×400）下觀察到熒光綠色組織，即判定為CD31陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取3 個(gè)視野，計(jì)數(shù)CD31＋細(xì)胞個(gè)數(shù)后取平均值，作為CD31 標(biāo)記的微血管密度值。

（2）新生神經(jīng)纖維面積占比、新生膠原纖維面積占比：S-100 陽性表達(dá)于牙髓中的神經(jīng)纖維[13]，可用于反映神經(jīng)纖維的數(shù)量。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后，于光學(xué)顯微鏡（×400）下觀察到黃褐色組織，即判定為S-100 蛋白的陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取3 個(gè)視野并拍照，通過Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量S-100 蛋白陽性表達(dá)面積和視野總面積，并計(jì)算新生神經(jīng)纖維面積占比。新生神經(jīng)纖維面積占比=S-100 蛋白陽性表達(dá)面積/視野總面積×100%。同時(shí)，經(jīng)改良Masson 染色后觀察，如見藍(lán)色組織則判定為膠原纖維表達(dá)，并用同樣的方法測量新生膠原纖維面積和視野總面積。新生膠原纖維面積占比=膠原纖維面積/視野總面積×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 24.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)各組新生組織長入率采用Fisher's 確切概率法進(jìn)行比較。采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)對(duì)定量資料的正態(tài)分布情況進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的定量資料以x±s 表示，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較；不符合正態(tài)分布的定量資料以M（Q1，Q3）表示，采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮下移植情況及2 組樣本獲取

牙根片段植入裸鼠2 周后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中分別有2 個(gè)、3 個(gè)移植位點(diǎn)的周圍出現(xiàn)傷口愈合不良，導(dǎo)致樣本部分暴露在體外。第4 周初，已暴露樣本脫落后隨即被丟棄，裸鼠皮下傷口自行愈合。移植4 周后，隨機(jī)處死9 只裸鼠，取出其皮下所有樣本，獲得實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各8 個(gè)樣本。移植6 周后，處死剩余9 只裸鼠，并獲得8 個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣本、7 個(gè)對(duì)照組樣本。獲取樣本時(shí)可見樣本的周圍由筋 膜包裹，且2 組部分樣本的根管表面均可見血管穿過（圖 1）。

圖1 于移植4 周及6 周后獲取裸鼠皮下樣本的觀察Fig 1 Observation on obtaining subcutaneous samples from the nude mice after 4 and 6 weeks of implantation

2.2 組織學(xué)觀察

2.2.1 新生組織總量分析 通過H-E 染色觀察根管內(nèi)新生組織的長入情況，結(jié)果顯示在第4 周結(jié)束時(shí)2 組的長入率均為87.5%，在第6 周結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的長入率分別為100%、85.7%且組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.886）。隨后，對(duì)沒有新生組織長入的根管進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，有破碎的組織或紅 細(xì)胞團(tuán)塊出現(xiàn)。通過對(duì)各組新生組織面積占比統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，移植4 周及6 周后實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組（均P＜0.05）（表1）。

表 1 2 組新生組織面積占比比較（%）Tab 1 Comparison of the proportion of the newly formed tissue between the two groups （%）

2.2.2 新生組織結(jié)構(gòu)分析 H-E 染色結(jié)果（圖2）顯示，2 組樣本的根管內(nèi)形成的新生組織結(jié)構(gòu)類似，即新生組織的中央為空泡狀的脂肪組織，周圍有膠原纖維交織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包含小血管及神經(jīng)纖維組織；未見類成牙本質(zhì)細(xì)胞及新生牙本質(zhì)形成。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組新生組織的部分位置與根管壁連接更緊密，空泡狀的脂肪組織更少，膠原纖維更為致密；同時(shí)，該組新生組織的纖維支架內(nèi)可見明顯的血管和團(tuán)塊狀的神經(jīng)纖維，血管內(nèi)可見散在的紅細(xì)胞。而各個(gè)組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組在移植4 周和6 周后的新生組織成分結(jié)構(gòu)間無明顯差別；實(shí)驗(yàn)組在移植6 周后較4 周后所形成的血管壁更厚，紅細(xì)胞團(tuán)塊更密集。

圖2 2組樣本根管內(nèi)新生組織的H-E染色結(jié)果Fig 2 H-E staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

免疫組織化學(xué)染色（圖3）、免疫熒光染色（圖4）及改良Masson 染色（圖5）結(jié)果顯示，2 組樣本在移植4 周和6 周后均可見S-100 蛋白、CD31 和膠原纖維的表達(dá)；

圖3 2 組樣本根管內(nèi)新生組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig 3 Immunohistochemical staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

從而證實(shí)，新生組織的主要成分包含神經(jīng)纖維、微血管及膠原纖維。

圖4 2 組樣本根管內(nèi)新生組織的免疫熒光染色結(jié)果Fig 4 Immunofluorescence staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

圖5 2 組樣本根管內(nèi)新生組織的改良Masson 染色結(jié)果Fig 5 Modified Masson staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

2.2.3 新生組織各成分定量分析 新生組織各成分的定量分析結(jié)果見表2。組間比較結(jié)果顯示，移植4 周后，實(shí)驗(yàn)組新生組織中的微血管密度高于對(duì)照組（P=0.012）；移植6 周后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組能誘導(dǎo)生成更多的神經(jīng)纖維（P=0.047）和血管（P=0.022），但2 組的膠原纖維生成量間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組內(nèi)比較結(jié)果顯示，2 組在移植6周后的膠原纖維生成量較4 周后更多（均P＜0.05）。

表 2 2 組樣本新生組織中各成分的定量分析Tab 2 Quantitative analysis of the newly formed tissue composition in the two groups of samples

3 討論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)CGF 與血凝塊誘導(dǎo)根管內(nèi)組織再生的差異進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均可誘導(dǎo)新生組織形成且組織結(jié)構(gòu)類似，其中實(shí)驗(yàn)組的誘導(dǎo)生成量更多，該組的新生組織中神經(jīng)纖維、血管的生成量顯著高于對(duì)照組。

本研究中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的新生組織長入率均高于85%，與韋維[14]等的研究結(jié)果近似，高于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[12]的研究結(jié)果，這可能與有效控制感染有關(guān)。研究[15]顯示，有效控制感染是牙髓再生治療成功的前提。在臨床操作中，醫(yī)師常使用次氯酸鈉溶液對(duì)根管內(nèi)進(jìn)行沖洗消毒，以清除根管內(nèi)的感染組織。然而有研究[16]表明，次氯酸鈉溶液在消除感染的同時(shí)也具有一定的細(xì)胞毒性。因此，為最大程度地促進(jìn)新生組織的形成，本實(shí)驗(yàn)選擇使用環(huán)氧乙烷而非次氯酸鈉溶液對(duì)牙根片段進(jìn)行消毒，以達(dá)到控制感染目的。

本研究中，根管內(nèi)新生組織的中央可見空泡狀的脂肪組織，周圍有膠原纖維交織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與Galler等[11]應(yīng)用體外生長因子與人工支架誘導(dǎo)生成的新生組織結(jié)構(gòu)類似。本研究還發(fā)現(xiàn)，在2 組新生組織的纖維網(wǎng)中可見小血管和團(tuán)塊狀的神經(jīng)纖維組織，這可能與自體血及其濃縮物含有多種與牙髓再生關(guān)系密切的生長因子有關(guān)[7]。因此，在目前應(yīng)用的幾種支架類型中，與體外合成的支架相比，自體血及其濃縮物能誘導(dǎo)更多的根管周圍的與牙髓再生有關(guān)的細(xì)胞遷移和分化，形成新生血管[17]和神經(jīng)纖維[18]。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[12]和臨床病例[19-20]等研究發(fā)現(xiàn)，血凝塊和血小板濃縮物均能促進(jìn)根管內(nèi)新生血管的形成和患牙感覺功能的恢復(fù)；且本研究的發(fā)現(xiàn)或可部分解釋以上結(jié)論。但也有學(xué)者在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[21]中發(fā)現(xiàn)，根管內(nèi)形成的新生組織為類牙周樣組織而非類牙髓樣組織，這可能與生長因子誘導(dǎo)牙周來源的細(xì)胞增殖和分化有關(guān)。因此，在臨床應(yīng)用中，作為第3 代血小板濃縮物，CGF 是否能真正誘導(dǎo)牙髓組織再生，CGF 所含的生長因子在誘導(dǎo)再生中發(fā)揮的具體作用，仍需進(jìn)一步分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，CGF 較血凝塊能誘導(dǎo)形成更多的新生組織，且其神經(jīng)纖維和血管的生成量亦較高，這可能與CGF 的獨(dú)特結(jié)構(gòu)有關(guān)。在CGF 的制備過程中，其特殊的離心速度使血小板破裂后釋放出大量的生長因子和細(xì)胞因子。這些因子被包裹在致密的三維網(wǎng)狀纖維蛋白結(jié)構(gòu)中，通過被緩慢釋放從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和施萬細(xì)胞的遷移和黏附[8]。此外，有學(xué)者經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CGF 的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中存在CD34＋細(xì)胞[22-23]，繼而表明CGF 有促進(jìn)血管新生的潛能。

有動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[9,24]發(fā)現(xiàn)，將CGF 作為支架應(yīng)用于牙髓再生治療后，可在根管內(nèi)觀察到類牙髓組織、柵欄狀排列的成牙本質(zhì)細(xì)胞和散在的血管。遺憾的是，在本研究的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組根管內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)類成牙本質(zhì)細(xì)胞和新生的牙本質(zhì)層。有學(xué)者認(rèn)為，其原因可能與移植的部位有關(guān)。Ruangsawasdi 等[25]比較了移植于大鼠背部和頭部所產(chǎn)生的新生組織間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植于背部產(chǎn)生的新生組織與本研究較為類似，而移植于頭部的新生組織中可見類成牙本質(zhì)細(xì)胞。雖然頭部的微環(huán)境可更好的模擬牙槽窩環(huán)境，也更有利于細(xì)胞的歸巢，但裸鼠頭部皮下空間狹小，無法同時(shí)植入2 個(gè)離體牙根片段，因此本研究僅于裸鼠背部進(jìn)行移植。同時(shí)，針對(duì)更理想的牙髓再生前期研究的動(dòng)物模型的探索或?qū)⑹茄浪柙偕芯康囊粋€(gè)新方向。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，CGF 表現(xiàn)出了可誘導(dǎo)周圍組織再生和血管長入的能力，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的新生組織與對(duì)照組相比，結(jié)構(gòu)類似、數(shù)量更多。雖然有學(xué)者在體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)CGF 可誘導(dǎo)產(chǎn)生類牙本質(zhì)，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)類成牙本質(zhì)細(xì)胞和礦化組織的形成。因此，有關(guān)于CGF在臨床治療中是否能真正誘導(dǎo)牙髓再生，仍需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

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