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        濃縮生長因子與血凝塊誘導(dǎo)根管內(nèi)組織再生的對比研究

        2020-11-30 03:49:38張?jiān)婍?/span>賴光云
        關(guān)鍵詞:管內(nèi)牙髓新生

        張?jiān)婍崳嚬庠?,?俊

        上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院兒童口腔科,國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所,上海 200011

        外傷、發(fā)育異常和齲病等常導(dǎo)致年輕恒牙出現(xiàn)牙髓壞死或根尖周炎,從而使其牙根發(fā)育終止。傳統(tǒng)的根尖誘導(dǎo)成形術(shù)及根尖屏障術(shù)雖可以消除炎癥,卻不能增加根管壁的厚度和牙根長度,遠(yuǎn)期治療效果不佳。目前,牙髓再生治療即使用生物學(xué)方法誘導(dǎo)新生牙髓組織生成,以替代原有壞死的牙髓組織、促進(jìn)牙根繼續(xù)發(fā)育等,成為了治療該類疾病的新方法[1]。有研究[2-3]表明,血凝塊可誘導(dǎo)根管內(nèi)形成類牙髓樣組織,促進(jìn)根尖孔閉合。2019 年美國牙體牙髓病學(xué)會發(fā)布的Guide to Clinical Endodontics,將刺激根尖出血納入了牙髓再生治療的標(biāo)準(zhǔn)治療流程[4]。然而在臨床操作中,該方法常面臨根尖出血量不足等問題,同時(shí)遠(yuǎn)期易引發(fā)牙冠變色、根管鈣化等并發(fā)癥[5]。近來有學(xué)者提出,第3 代血小板濃縮物[如濃縮生長因子(concentrated growth factor,CGF)]富含多種高濃度的生長因子,能促進(jìn)牙根尖乳頭干細(xì)胞和牙髓細(xì)胞的增殖、遷 移和分化[6-7];同時(shí),其特殊的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也可為組織再生提供支架,因此可作為一種較理想的支架替代血凝塊應(yīng)用于牙髓再生治療[8]。既往研究[9]發(fā)現(xiàn),以CGF 作為支架可誘導(dǎo)根管內(nèi)形成類牙髓樣組織,但目前尚無研 究就其與血凝塊間的差異進(jìn)行比較?;诖耍狙芯客ㄟ^動物實(shí)驗(yàn)探究CGF 與血凝塊誘導(dǎo)根管內(nèi)組織再生的能力之間的差異,以期為CGF 臨床應(yīng)用于牙髓再生治療提供參考。

        1 對象與方法

        1.1 研究對象、主要儀器和試劑

        1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取4 周齡雄性裸鼠18 只[由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供,生產(chǎn)許可證號:SYXK(滬)2017-0008],體質(zhì)量15 ~20 g。裸鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院SPF 級動物房的標(biāo)準(zhǔn)籠中,使用許可證號:SYXK(滬)2016-0016。裸鼠飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由攝食、飲水。飼養(yǎng)條件如下:光照時(shí)間為8:00 ~18:00,溫度為26 ℃,濕度為50%,環(huán)境噪聲<60 dB。動物飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》,所有動物相關(guān)操作均遵循上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院有關(guān)動物倫理規(guī)定及條例。

        1.1.2試驗(yàn)對象 向社會招募志愿者,納入標(biāo)準(zhǔn):平素身體健康,無全身系統(tǒng)性疾病,否認(rèn)處于妊娠期或月經(jīng)期,采血前3 個月內(nèi)未服用影響血小板功能的藥物(如阿司匹林等),血小板計(jì)數(shù)正常。本研究已通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會的審批(審批號:2018-18-T18)。在研究開始前,已向志愿者告知研究內(nèi)容和預(yù)期風(fēng)險(xiǎn),所有志愿者均簽署了知情同意書。

        1.1.3主要儀器及試劑 Medifuge 離心機(jī)(Silfradent,意大利),活性血漿蛋白凝膠(activated plasma albumin gel,A.P.A.G)恒溫儀(Silfradent,意大利),光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS,日本)。鼠抗S-100 一抗(Dako EnVisionTM,丹麥),辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠兔二抗(Dako EnVisionTM,丹麥),鼠抗CD31 一抗(Abcam,英國),綠色熒光標(biāo)記羊抗鼠二抗(Santa Cruz Biotechnology,美國)。改良Masson 三色染色液試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

        1.2 研究方法

        1.2.1選取離體牙 選取于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔外科門診中拔除的上、下頜恒前磨牙36顆。選取標(biāo)準(zhǔn):患牙經(jīng)影像學(xué)及臨床檢查,未發(fā)現(xiàn)有齲病、牙髓炎、根尖周炎及牙周炎等疾病,且無明顯缺損。拔除后,將患牙置于生理鹽水中,并于4 ℃保存(保存時(shí)間不超過1 個月)。

        1.2.2 制備離體牙牙根片段 用手術(shù)刀片刮除離體牙外周的軟組織,用高速渦輪手機(jī)截去牙冠,并用拔髓針摘除牙髓。將離體牙制備成長5 ~6 mm 的牙根片段,管徑1 ~3 mm。于室溫下,使用生理鹽水超聲蕩洗牙根片段1 min。自然晾干后,向牙根片段的一端充填玻璃離子以封閉根管,深度約 1 mm,另一端則開放。采用環(huán)氧乙烷對制備后的牙根片段進(jìn)行消毒,以備后用。

        1.2.3 制備CGF 抽取志愿者上臂靜脈全血,配平放入Medifuge 離心機(jī)中,選擇CGF 程序進(jìn)行離心。離心完畢后,全血分層為血清層、去血小板血漿層、富血小板血漿層、白膜層和紅細(xì)胞層。用無菌針頭吸取0.3 mL 白膜層,再用另一無菌針頭吸取0.6 mL 富血小板血漿層,于A.P.A.G 恒溫儀中75 ℃加熱20 min,取出后自然冷卻至室溫。隨后,用三通管將上述2 種成分混勻,形成CGF。

        1.2.4 分組及裸鼠體內(nèi)移植 于超凈臺中完成牙根片段移植操作。牙根片段被隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=18)和對照組(n=18);其中,向前者注入CGF,向后者注入全血后形成血凝塊。將裸鼠局部麻醉后,在其背部做2 個線性切口,鈍性分離兩側(cè)皮膚。分別于每只裸鼠背部左側(cè)、右側(cè)皮下植入1 個實(shí)驗(yàn)組樣本和1 個對照組樣本后進(jìn)行縫合。

        1.2.5 組織學(xué)觀察 分別于移植4 周或6 周后,采用頸部脫臼法處死裸鼠后取樣。用10%中性緩沖福爾馬林組織固定液固定樣本48 h 后,用10%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)脫鈣,繼而浸蠟、包埋。修整蠟塊后,用石蠟切片機(jī)在1 mm 深度處橫向切片,切片厚度為4 μm。采用蘇木精-伊紅染色(hematoxylin and eosin staining,H-E staining,H-E 染色)、免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光染色和改良Masson 染色對上述切片進(jìn)行組織學(xué)觀察。

        1.2.6 新生組織分析 H-E 染色后,在低倍鏡下觀察每張切片是否有新生組織長入及其結(jié)構(gòu)變化,計(jì)算各組新生組織長入率。選取能看到完整根管橫截面的視野并拍照,運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量新生組織面積和根管總面積,計(jì)算新生組織面積占比。每個樣本測量3 次取平均值。公式為:新生組織面積占比=新生組織面積/根管總面積×100%[10]。

        根據(jù)既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11],再生組織中可觀察到膠原纖維、血管、神經(jīng)纖維和脂肪組織。而在本研究中,由于脂肪組織非健康牙髓中包含的組織,因此僅就前3 種成分進(jìn)行定量分析。

        (1)微血管密度:CD31 陽性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,可用于反映微血管的數(shù)量[12]。經(jīng)免疫熒光染色后,于光學(xué)顯微鏡(×400)下觀察到熒光綠色組織,即判定為CD31陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取3 個視野,計(jì)數(shù)CD31+細(xì)胞個數(shù)后取平均值,作為CD31 標(biāo)記的微血管密度值。

        (2)新生神經(jīng)纖維面積占比、新生膠原纖維面積占比:S-100 陽性表達(dá)于牙髓中的神經(jīng)纖維[13],可用于反映神經(jīng)纖維的數(shù)量。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后,于光學(xué)顯微鏡(×400)下觀察到黃褐色組織,即判定為S-100 蛋白的陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取3 個視野并拍照,通過Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量S-100 蛋白陽性表達(dá)面積和視野總面積,并計(jì)算新生神經(jīng)纖維面積占比。新生神經(jīng)纖維面積占比=S-100 蛋白陽性表達(dá)面積/視野總面積×100%。同時(shí),經(jīng)改良Masson 染色后觀察,如見藍(lán)色組織則判定為膠原纖維表達(dá),并用同樣的方法測量新生膠原纖維面積和視野總面積。新生膠原纖維面積占比=膠原纖維面積/視野總面積×100%。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        運(yùn)用SPSS 24.0 軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對各組新生組織長入率采用Fisher's 確切概率法進(jìn)行比較。采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)對定量資料的正態(tài)分布情況進(jìn)行分析,符合正態(tài)分布的定量資料以x±s 表示,采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較;不符合正態(tài)分布的定量資料以M(Q1,Q3)表示,采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 皮下移植情況及2 組樣本獲取

        牙根片段植入裸鼠2 周后,實(shí)驗(yàn)組和對照組中分別有2 個、3 個移植位點(diǎn)的周圍出現(xiàn)傷口愈合不良,導(dǎo)致樣本部分暴露在體外。第4 周初,已暴露樣本脫落后隨即被丟棄,裸鼠皮下傷口自行愈合。移植4 周后,隨機(jī)處死9 只裸鼠,取出其皮下所有樣本,獲得實(shí)驗(yàn)組、對照組各8 個樣本。移植6 周后,處死剩余9 只裸鼠,并獲得8 個實(shí)驗(yàn)組樣本、7 個對照組樣本。獲取樣本時(shí)可見樣本的周圍由筋 膜包裹,且2 組部分樣本的根管表面均可見血管穿過(圖 1)。

        圖1 于移植4 周及6 周后獲取裸鼠皮下樣本的觀察Fig 1 Observation on obtaining subcutaneous samples from the nude mice after 4 and 6 weeks of implantation

        2.2 組織學(xué)觀察

        2.2.1 新生組織總量分析 通過H-E 染色觀察根管內(nèi)新生組織的長入情況,結(jié)果顯示在第4 周結(jié)束時(shí)2 組的長入率均為87.5%,在第6 周結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對照組的長入率分別為100%、85.7%且組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.886)。隨后,對沒有新生組織長入的根管進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),有破碎的組織或紅 細(xì)胞團(tuán)塊出現(xiàn)。通過對各組新生組織面積占比統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),移植4 周及6 周后實(shí)驗(yàn)組均高于對照組(均P<0.05)(表1)。

        表 1 2 組新生組織面積占比比較(%)Tab 1 Comparison of the proportion of the newly formed tissue between the two groups (%)

        2.2.2 新生組織結(jié)構(gòu)分析 H-E 染色結(jié)果(圖2)顯示,2 組樣本的根管內(nèi)形成的新生組織結(jié)構(gòu)類似,即新生組織的中央為空泡狀的脂肪組織,周圍有膠原纖維交織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),包含小血管及神經(jīng)纖維組織;未見類成牙本質(zhì)細(xì)胞及新生牙本質(zhì)形成。與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組新生組織的部分位置與根管壁連接更緊密,空泡狀的脂肪組織更少,膠原纖維更為致密;同時(shí),該組新生組織的纖維支架內(nèi)可見明顯的血管和團(tuán)塊狀的神經(jīng)纖維,血管內(nèi)可見散在的紅細(xì)胞。而各個組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn),對照組在移植4 周和6 周后的新生組織成分結(jié)構(gòu)間無明顯差別;實(shí)驗(yàn)組在移植6 周后較4 周后所形成的血管壁更厚,紅細(xì)胞團(tuán)塊更密集。

        圖2 2組樣本根管內(nèi)新生組織的H-E染色結(jié)果Fig 2 H-E staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

        免疫組織化學(xué)染色(圖3)、免疫熒光染色(圖4)及改良Masson 染色(圖5)結(jié)果顯示,2 組樣本在移植4 周和6 周后均可見S-100 蛋白、CD31 和膠原纖維的表達(dá);

        圖3 2 組樣本根管內(nèi)新生組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig 3 Immunohistochemical staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

        從而證實(shí),新生組織的主要成分包含神經(jīng)纖維、微血管及膠原纖維。

        圖4 2 組樣本根管內(nèi)新生組織的免疫熒光染色結(jié)果Fig 4 Immunofluorescence staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

        圖5 2 組樣本根管內(nèi)新生組織的改良Masson 染色結(jié)果Fig 5 Modified Masson staining results of the newly formed tissue in root canal of the two groups of samples

        2.2.3 新生組織各成分定量分析 新生組織各成分的定量分析結(jié)果見表2。組間比較結(jié)果顯示,移植4 周后,實(shí)驗(yàn)組新生組織中的微血管密度高于對照組(P=0.012);移植6 周后,實(shí)驗(yàn)組較對照組能誘導(dǎo)生成更多的神經(jīng)纖維(P=0.047)和血管(P=0.022),但2 組的膠原纖維生成量間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組內(nèi)比較結(jié)果顯示,2 組在移植6周后的膠原纖維生成量較4 周后更多(均P<0.05)。

        表 2 2 組樣本新生組織中各成分的定量分析Tab 2 Quantitative analysis of the newly formed tissue composition in the two groups of samples

        3 討論

        本實(shí)驗(yàn)針對CGF 與血凝塊誘導(dǎo)根管內(nèi)組織再生的差異進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均可誘導(dǎo)新生組織形成且組織結(jié)構(gòu)類似,其中實(shí)驗(yàn)組的誘導(dǎo)生成量更多,該組的新生組織中神經(jīng)纖維、血管的生成量顯著高于對照組。

        本研究中,實(shí)驗(yàn)組和對照組的新生組織長入率均高于85%,與韋維[14]等的研究結(jié)果近似,高于動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[12]的研究結(jié)果,這可能與有效控制感染有關(guān)。研究[15]顯示,有效控制感染是牙髓再生治療成功的前提。在臨床操作中,醫(yī)師常使用次氯酸鈉溶液對根管內(nèi)進(jìn)行沖洗消毒,以清除根管內(nèi)的感染組織。然而有研究[16]表明,次氯酸鈉溶液在消除感染的同時(shí)也具有一定的細(xì)胞毒性。因此,為最大程度地促進(jìn)新生組織的形成,本實(shí)驗(yàn)選擇使用環(huán)氧乙烷而非次氯酸鈉溶液對牙根片段進(jìn)行消毒,以達(dá)到控制感染目的。

        本研究中,根管內(nèi)新生組織的中央可見空泡狀的脂肪組織,周圍有膠原纖維交織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),與Galler等[11]應(yīng)用體外生長因子與人工支架誘導(dǎo)生成的新生組織結(jié)構(gòu)類似。本研究還發(fā)現(xiàn),在2 組新生組織的纖維網(wǎng)中可見小血管和團(tuán)塊狀的神經(jīng)纖維組織,這可能與自體血及其濃縮物含有多種與牙髓再生關(guān)系密切的生長因子有關(guān)[7]。因此,在目前應(yīng)用的幾種支架類型中,與體外合成的支架相比,自體血及其濃縮物能誘導(dǎo)更多的根管周圍的與牙髓再生有關(guān)的細(xì)胞遷移和分化,形成新生血管[17]和神經(jīng)纖維[18]。動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[12]和臨床病例[19-20]等研究發(fā)現(xiàn),血凝塊和血小板濃縮物均能促進(jìn)根管內(nèi)新生血管的形成和患牙感覺功能的恢復(fù);且本研究的發(fā)現(xiàn)或可部分解釋以上結(jié)論。但也有學(xué)者在動物實(shí)驗(yàn)[21]中發(fā)現(xiàn),根管內(nèi)形成的新生組織為類牙周樣組織而非類牙髓樣組織,這可能與生長因子誘導(dǎo)牙周來源的細(xì)胞增殖和分化有關(guān)。因此,在臨床應(yīng)用中,作為第3 代血小板濃縮物,CGF 是否能真正誘導(dǎo)牙髓組織再生,CGF 所含的生長因子在誘導(dǎo)再生中發(fā)揮的具體作用,仍需進(jìn)一步分析。

        本研究發(fā)現(xiàn),CGF 較血凝塊能誘導(dǎo)形成更多的新生組織,且其神經(jīng)纖維和血管的生成量亦較高,這可能與CGF 的獨(dú)特結(jié)構(gòu)有關(guān)。在CGF 的制備過程中,其特殊的離心速度使血小板破裂后釋放出大量的生長因子和細(xì)胞因子。這些因子被包裹在致密的三維網(wǎng)狀纖維蛋白結(jié)構(gòu)中,通過被緩慢釋放從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和施萬細(xì)胞的遷移和黏附[8]。此外,有學(xué)者經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CGF 的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中存在CD34+細(xì)胞[22-23],繼而表明CGF 有促進(jìn)血管新生的潛能。

        有動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[9,24]發(fā)現(xiàn),將CGF 作為支架應(yīng)用于牙髓再生治療后,可在根管內(nèi)觀察到類牙髓組織、柵欄狀排列的成牙本質(zhì)細(xì)胞和散在的血管。遺憾的是,在本研究的實(shí)驗(yàn)組和對照組根管內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)類成牙本質(zhì)細(xì)胞和新生的牙本質(zhì)層。有學(xué)者認(rèn)為,其原因可能與移植的部位有關(guān)。Ruangsawasdi 等[25]比較了移植于大鼠背部和頭部所產(chǎn)生的新生組織間的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植于背部產(chǎn)生的新生組織與本研究較為類似,而移植于頭部的新生組織中可見類成牙本質(zhì)細(xì)胞。雖然頭部的微環(huán)境可更好的模擬牙槽窩環(huán)境,也更有利于細(xì)胞的歸巢,但裸鼠頭部皮下空間狹小,無法同時(shí)植入2 個離體牙根片段,因此本研究僅于裸鼠背部進(jìn)行移植。同時(shí),針對更理想的牙髓再生前期研究的動物模型的探索或?qū)⑹茄浪柙偕芯康囊粋€新方向。

        綜上,本研究發(fā)現(xiàn),CGF 表現(xiàn)出了可誘導(dǎo)周圍組織再生和血管長入的能力,其誘導(dǎo)產(chǎn)生的新生組織與對照組相比,結(jié)構(gòu)類似、數(shù)量更多。雖然有學(xué)者在體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)CGF 可誘導(dǎo)產(chǎn)生類牙本質(zhì),但在本研究中未發(fā)現(xiàn)類成牙本質(zhì)細(xì)胞和礦化組織的形成。因此,有關(guān)于CGF在臨床治療中是否能真正誘導(dǎo)牙髓再生,仍需要更多的動物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

        參·考·文·獻(xiàn)

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