袁 蕓，張洪銘，黃 慧

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學院口腔修復科，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室,上海市口腔醫(yī)學研究所，上海200011

牙周炎是發(fā)生于牙周支持組織的炎癥反應，常伴發(fā)結合上皮的退縮、附著喪失、牙周袋形成，以及牙槽骨吸收。隨著病變逐漸向根方發(fā)展，患牙可出現松動移位、咀嚼困難等臨床表現，最終導致牙齒缺失的嚴重后果[1]。流行病學調查[2]顯示，牙周炎在成年人中的患病率高達90%，是我國成年人失牙的首要原因。

牙周致病菌主要包括牙齦卟啉單胞菌、福塞坦菌、伴放線聚集桿菌等[3-4]。這些病原菌及其毒素在入侵牙周組織時，可激活局部免疫環(huán)境中的固有免疫應答和特異性免疫應答。其中，輔助性T（helper T, Th）細胞介導的細胞免疫應答是特異性免疫應答的重要組成部分。根據Th 細胞在炎性疾病中的作用，可將其分為Th1、Th2、Th17 及調節(jié)性T（T-regulatory, Treg） 4 種細胞亞型[5]。這4 種細胞通過分泌不同的細胞因子來介導牙周炎局部的組織損傷。Th1 細胞主要分泌細胞因子干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）；Th2 細胞主要分泌白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）；Th17 細胞產生的細 胞因子以IL-17A 為 主；Treg細胞主要產生IL-10[6-7]。研究[8]表明，在牙周炎病損處，IFN-γ 濃度升高，IL-10 的表達量降低，且在重度牙周炎和急性進展性牙周炎患者中更加明顯。IL-17A 在牙周炎患者牙齦組織和齦溝液中的表達水平均高于正常對照 組[9]。

牙周致病菌在激活局部免疫應答的同時，也引起全身免疫應答。有學者發(fā)現慢性牙周炎患者與正常人相比，外周血中Th1、Th17 及Treg 細胞的比例明顯升高[10-11]。類似的現象也出現在模型動物中，IFN-γ 在實驗性牙周炎大鼠外周血清中的表達顯著升高，Th17 細胞、Treg 細胞及兩者的比值在牙周炎大鼠外周血中也明顯升高[12-13]。但是，也有學者[14-15]認為在牙周炎患者與正常人外周血中，Th17細胞并無明顯變化，且IL-17A+T 細胞、IFN-γ+T 細胞均無明顯變化。目前，關于牙周炎對全身免疫環(huán)境中Th 細胞分群的影響尚無一致定論。因此，本研究通過建立大鼠牙周炎模型，對比牙周炎與健康大鼠外周血中Th 細胞各亞群的比例，探討牙周炎對外周血中Th 細胞分群的影響，為牙周炎的免疫學研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

RPMI1640 培養(yǎng)液（Sigma 公司，美國），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS；江蘇凱基生物技術股份有限公司）；FITC 標記的CD3、BUV395標記的CD4、BV480 標記的CD8、BV421 標記的CD25、AF647 標記的IFN-γ、PE 標記的IL-4 抗體、APC-CY7 標記的死活染料、抗原封閉劑、刺激劑/蛋白轉運抑制劑、破胞膜劑、紅細胞裂解液、緩沖液、流式細胞儀，均購自美國BD 公司；PE-Cyanine 標記的IL-17A、PE-eFluor 標記的叉頭狀螺旋轉錄因子3（transcription factor forkhead box P3，Foxp3）抗體、破核膜劑，均購自美國eBioscience 公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司，顯微CT 掃描儀（micro-CT Skyscan1176）購自比利時布魯克公司。

1.2 牙周炎動物模型的建立

6 周齡SPF 級SD 雄性大鼠10 只，由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物實驗中心提供，體質量為（180±20）g，無牙周疾病，健康狀況良好。將大鼠隨機分為牙周炎組和對照組，每組各5 只。牙周炎組：稱重后以1%的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠（0.6 mL/100 g），分離雙側下頜第一磨牙（M1）頸部牙齦組織，采用3-0縫合線結扎M1 牙頸部，每日檢查結扎絲，如有松動則重新結扎。對照組：大鼠麻醉后分離牙齦，不結扎，其余均與牙周炎組相同。實驗期間給予實驗動物清潔飼料和純凈水，按時更換墊料，環(huán)境溫度25 ℃，光照12 h/d。術后2 周，采用牙周探針分別檢查牙周炎組與對照組大鼠下頜M1 牙周狀況，記錄探診深度。實驗獲得上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批（批準號HKDL-2017-249）。

1.3 牙槽骨吸收高度的測量

處死大鼠，每組隨機選擇3 只，取下頜骨，去除軟組織，經4%多聚甲醛固定24 h 后，進行顯微CT 掃描檢測。掃描參數設置為：電壓65 kV，電流280 μA，1.0 mm 鋁箔過濾，旋轉步長0.55°，像素為18 μm×18 μm×18 μm。掃描后利用NRecon 軟件進行三維重建。選取M1 頰側近中、中間、遠中及舌側近中、中間、遠中，共6 個位點，測量釉牙骨質界（cementoenamel junction，CEJ）至牙槽嵴頂（alveolar bone crest，ABC）的垂直距離（CEJ-ABC）作為牙槽骨吸收高度。每個樣本測量3 次，取平均值作為最終結果。

1.4 Th 細胞各亞群的流式細胞術檢測

1.4.1 外周血采集 采用心臟采血法獲取大鼠外周血，將外周血收集至含有EDTA-K2 抗凝劑的采血管中。取1.0 mL 外周血用于Th1、Th2 及Th17 細胞流式細胞術檢測，另取1.0 mL 外周血用于Treg 細胞流式檢測。

1.4.2 Th1、Th2、Th17 細胞樣本制備 將1.0 mL 外周血加入到六孔板中，每孔中加入1.0 mL 含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)液及2 μL 刺激劑/蛋白轉運抑制劑，培養(yǎng)4 ～6 h（37 ℃，5% CO2）。紅細胞裂解液去除紅細胞，DPBS 重懸，轉移至流式管中，死活染料染色，緩沖液清洗2 次，抗原封閉，用FITC 標記的CD3及BV480 標記的CD8 抗體進行胞外因子染色。經破胞膜劑固定破膜后，用AF647 標記的IFN-γ、PE 標記的IL-4、PE-Cyanine 標記的IL-17A 抗體進行胞內因子染色。緩沖液洗滌重懸，上機檢測。

1.4.3 Treg 細胞樣本制備 按1.4.2 中的方法去除紅細胞、死活染料染色、抗原封閉。用FITC 標記的CD3、BUV395 標記的CD4 及BV421 標記的CD25 抗體進行胞外因子染色。經破核膜劑固定破膜后，用PE-eFluor 標記的Foxp3 抗體進行核內因子染色。緩沖液洗滌重懸，上機檢測。

1.4.4 流式細胞術分析 利用FlowJo 10.5.3 軟件分析Th1、Th2、Th17、Treg 細胞的比例。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 8.0 軟件包進行數據分析。定量數據以x—±s 表示，定性數據以n（%）表示。牙槽骨吸收高度及Th1、Th2、Th17、Treg 細胞的百分比在2 組之間的比較均采用獨立樣本t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 牙周探診

牙周探診結果見圖1，結果顯示：牙周炎組大鼠下頜M1 周圍牙齦組織紅腫，頰側牙齦明顯增生，探診深度約為1.0 mm。對照組大鼠下頜M1 周圍牙齦組織呈淡粉色，未見明顯腫脹、增生，探診深度小于0.5 mm。

圖1 牙周探診結果Fig 1 Results of periodontal probing

2.2 牙槽骨吸收高度

牙槽骨吸收高度測量結果見圖2。頰側近中CEJ-ABC在牙周炎組和對照組中分別為（1 271.0±59.2）μm 和（833.7±59.2）μm，牙周炎組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.006）；頰側中間CEJ-ABC 在牙周炎組和對照組中分別為（1 303.7±23.8）μm 和（870.3±40.8）μm，牙周炎組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）；頰側遠中CEJ-ABC 在牙周炎組和對照組中分別為（1 019.7±62.8）μm 和（442.0±12.1）μm，牙周炎組高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。舌側近中CEJ-ABC在牙周炎組和對照組中分別為（1 084.0±13.0）μm 和（931.3±84.3）μm，牙周炎組高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.148）；舌側中間CEJ-ABC 在牙周炎組和對照組中分別為（987.7±18.2）μm 和（769.7±58.1）μm，牙周炎組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.023）；舌側遠中CEJ-ABC 在牙周炎組和對照組中分別為（885.7±15.6）μm 和（696.0±27.2）μm，牙周炎組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.004）。牙槽骨吸收高度測量結果表明，牙周炎組M1 頰舌側牙槽骨均發(fā)生明顯吸收。

2.3 流式細胞術檢測結果

流式細胞術檢測結果見圖3。Th1 細胞在牙周炎組大鼠外周血中的比例明顯高于對照組（P=0.002），Th17 細胞在牙周炎組大鼠外周血中的比例也明顯升高（P=0.028）；而Treg 細胞在牙周炎組大鼠外周血中的比例明顯降低（P=0.002）；Th2 細胞在牙周炎組大鼠外周血中的比例也低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 流式細胞術檢測結果Fig 3 Results of flow cytometry

3 討論

牙周炎是以牙齦紅腫、牙周袋形成、牙槽骨吸收為典型臨床表現的慢性炎癥破壞性疾病。本研究采用大鼠下頜第一磨牙牙頸部結扎的方法建立實驗性牙周炎大鼠模型。術后2 周，牙周炎組大鼠出現牙齦紅腫、探診出血，頰側探診深度達1.0 mm；而對照組大鼠未見牙齦紅腫出血，探診無牙周袋形成，頰側探診深度明顯小于牙周炎組。牙槽骨吸收高度測量結果顯示，除了舌側近中CEJ-ABC 在2組間無明顯差異外，牙周炎組在其余5 個位點的測量值均顯著高于對照組，表明牙周炎組M1 周圍牙槽骨發(fā)生明顯吸收。以上結果表明，結扎第一磨牙牙頸部2 周可誘導形成實驗性牙周炎大鼠模型。

牙周致病菌及其代謝產物激活病變局部的單核細胞、巨噬細胞，產生大量促炎性細胞因子，如白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和前列腺素E2 等[16]。這些細胞因子可通過血液循環(huán)進行擴散，從而引起外周血中Th 細胞分群的改變。本研究通過流式細胞術檢測實驗性牙周炎大鼠與對照組大鼠外周血中Th 細胞各亞群的比例，結果發(fā)現牙周炎組大鼠外周血中促炎型Th1、Th17 細胞的比例升高，炎癥調節(jié)型Treg細胞的比例降低。

然而，關于牙周炎對外周血中Th 細胞分群的影響，目前尚無一致結論。王琳源等[17]采用口腔涂抹牙齦卟啉單胞菌的方法建立小鼠牙周炎模型，4 周后檢測發(fā)現牙周炎小鼠外周血中Th17 細胞在總CD4+T 細胞中的比例和數量顯著高于對照組，且牙周炎組IL-17A 的表達增加。Chen 等[10]對68 例慢性牙周炎患者和43 例健康者外周血樣本進行檢測，發(fā)現牙周炎患者外周血中Th1 和Th17 細胞的比例明顯高于健康者。Gao 等[13]采用牙周結扎+涂抹牙齦卟啉單胞菌的方法建立大鼠牙周炎模型，通過流式細胞術發(fā)現牙周炎大鼠外周血中Th17 細胞比例升高，且Th17 與Treg 細胞的比值升高。而Sabarish 等[11]研究發(fā)現，慢性牙周炎患者外周血中Treg 細胞的比例明顯高于健康者；Cheng 等[18]研究發(fā)現牙周炎患者與健康者相比，外周血中Th17 及Treg 細胞的比例未見明顯變化，并認為牙齦局部的炎癥反應不會引起血液中主要的免疫細胞亞群發(fā)生改變。以上研究結果存在差異的原因可能有：①實驗動物的物種差異，大部分動物實驗均發(fā)現牙周炎能顯著影響嚙齒類動物外周血中Th 細胞的分群，而臨床研究結果的差異性較大。②病變程度不同，早、中、晚期牙周炎可能對外周血中Th 細胞的分群產生不同的影響。③個體差異，牙周炎引起的T 細胞免疫反應在不同個體之間的程度不同。

既往研究[19]認為Th1 細胞是造成牙周炎中牙周支持組織損傷的主要細胞，Th1 細胞通過分泌IFN-γ、TNF 等促炎性細胞因子破壞牙周組織。IFN-γ 可以提高黏附因子和趨化因子的含量，促使炎癥細胞向感染部位聚集，在牙周炎癥反應、骨吸收、附著組織喪失上都起著重要的作用[8]。近年來研究發(fā)現Th17 細胞的浸潤與牙周炎的病變輕重有著密切關系，IL-17A 水平升高在炎癥過程中起到重要作用，牙周炎組織的破壞緣于IL-17A 分泌增加[20-21]。Th2 細胞通過分泌IL-4 抑制T 細胞向Th1 細胞分化，抑制巨噬細胞的功能，抑制破骨細胞的生成，控制炎癥的進展[22]。Treg 細胞能通過接觸或分泌IL-10 和轉化生長因子抑制T 細胞的增殖和活化，對自身免疫性疾病和炎癥反應起負調控作用。因此，目前認為Th1 和Th17 細胞是主要的促炎型Th 細胞亞群，而Th2 和Treg 細胞是主要的炎癥調節(jié)型Th 細胞亞群。

綜上，本研究結果表明，牙周炎可促進大鼠外周血中促炎型Th 細胞亞群的分化，抑制炎癥調節(jié)型Th 細胞亞群的分化。而牙周炎引起Th 細胞各亞群比例變化的具體作用機制，仍有待進一步闡明。

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