周 晗，楊曉笙，廖陳龍，張文川

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200011

2019 年，約有4.63 億成年人患糖尿?。╠iabetes mellitus，DM），這一數(shù)字在2045 年預(yù)計將超過7 億[1]。糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulceration，DFU）是最常見且醫(yī)療負擔最高的DM 并發(fā)癥之一，DFU 患者約占DM 患者的15%[2]。隨著DM 患病人數(shù)的增加和DM 患者預(yù)期壽命的延長，DFU 患者的數(shù)量將持續(xù)增加[3]。DFU 患者面臨復(fù)發(fā)和截肢的高風(fēng)險，并承受著巨大的經(jīng)濟負擔。DFU 的病因復(fù)雜多樣[4]，周圍神經(jīng)病變、周圍動脈疾病和重復(fù)性創(chuàng)傷被認為是主要誘發(fā)因素。與正常傷口愈合相比，DM患者傷口愈合過程中受到高血糖、慢性炎癥、缺氧和神經(jīng)肽信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受損的影響[4]，造成傷口愈合不良，最終可能導(dǎo)致慢性開放性潰瘍[5]。此外，DM 患者的免疫反應(yīng)和對感染的抵抗力也發(fā)生了改變[6]。因此，有必要了解DFU發(fā)生過程中的潛在分子機制，并確定更具體有效的治療干預(yù)措施。

近年來，DFU 的分子生物學(xué)機制研究已取得一些成果。Nguyen 等[7]研究發(fā)現(xiàn)活性基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）上調(diào)是DM 小鼠傷口難以愈合的原因，并證明其抑制劑（R）-ND-336 較貝卡普勒明（becaplermin，一種現(xiàn)有的經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的DFU 藥物）對傷口愈合更有效。Sunkari 等[8]提出，缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1）的激活有助于改善DM 小鼠的傷口愈合。Icli 等[9]指出，miRNA-26a 可以顯著提高DM 小鼠傷口愈合的速度。Ramirez等[10]利用基因表達譜芯片研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的DFU 中miR-15b-5p 上調(diào)，并在進一步的實驗中證實其對DNA 修復(fù)和炎癥反應(yīng)的抑制作用。

在本研究中，GSE80178 的芯片數(shù)據(jù)下載于美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI） 基 因 表 達 綜 合 數(shù) 據(jù) 庫（Gene Expression Omnibus，GEO）。通過這些數(shù)據(jù)來鑒定DFU與糖尿病足皮膚（diabetic foot skin，DFS）的差異表達基因（differentially expressed genes，DEG）及其生物學(xué)功能，并基于反卷積算法（CIBERSORTx）[11]探索影響DFU 發(fā)展的免疫細胞，旨在為DFU 靶向治療藥物的開發(fā)提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)和預(yù)處理

mRNA 數(shù)據(jù)集GSE80178 下載自GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。 該 數(shù) 據(jù) 集 的 建 立 基 于GPL16686（Affymetrix Human Gene）平臺[10]，共包含12 個獨立樣本，包括6 個DFU 樣本、3 個DFS 樣本和3 個非糖尿病足部皮膚（non-diabetic foot skin，nDFS）樣本，即正常人皮膚樣本。通過R 語言中的oligo 軟件包[12]讀取CEL文件探針級數(shù)據(jù)。原始表達數(shù)據(jù)使用RMA（Robust Multi-Array Average）算法[13]進行背景校正，log2轉(zhuǎn)換及歸一化。

1.2 差異基因篩選和功能富集分析

利用R 語言中的limma 包來鑒別DEG，且以P ＜ 0.05、log2|Fold Change|（log2|FC|） ＞1 用作截斷標準。為探索DEG 涉及的基因功能，我們將DEG 提交給DAVID（Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery）數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行注釋與聚類[14-15]。基因功能的可視化是使用GOplot 程序包[16]生成的。對應(yīng)的篩選標準為P＜0.05，基因計數(shù)＞5。

1.3 免疫細胞分析

CIBERSORTx 提供了一種反卷積算法，可根據(jù)基因表達數(shù)據(jù)估算混合細胞群中成員細胞類型的豐度。利用該算法及其提供的22 種免疫細胞的547 個標記基因，對12 個樣本進行反卷積分析，推斷22 種免疫細胞在nDFS、DFS 及DFU 的相對含量，并通過Wilcoxon 秩和檢驗分析了nDFS、DFS 與DFU 之間各種免疫細胞比例的差異。使用R 語言的vioplot 軟件包繪制小提琴圖以可視化22 種浸潤免疫細胞的比例差異。

2 結(jié)果

2.1 DFU 與DFS 之間DEG 鑒別

經(jīng)RMA 算法預(yù)處理后，所有樣品的基因表達平均值處于同一水平，以P＜0.05 和log2|FC|＞2 為標準，共獲得296 個DFU 與DFS 之間的DEG?；鹕綀D中顯示了80 個上調(diào)基因和216 個下調(diào)基因（圖1A）。按log2|FC| 排序，并在熱圖中展示前5 個上調(diào)和下調(diào)基因（圖1B），這10個基因的具體信息見表1。

圖1 DFU 和DFS 之間的DEGFig 1 DEGs between DFU and DFS

表1 DFU 和DFS 之間上調(diào)和下調(diào)的前5 位DEGTab 1 Top 5 up-regulated and down-regulated DEGs between DFU and DFS

2.2 功能注釋與富集分析

以基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋了DFU 和DFS 之間DEG 所代表的生物學(xué)特征（表2）。以P＜0.05、基因計數(shù)＞5 為篩選條件，篩選出3 個下調(diào)和11 個上調(diào)的生物過程，以及5 個下調(diào)和3 個上調(diào)的細胞成分。角質(zhì)形成細胞的分化、角質(zhì)化、肽交聯(lián)、表皮發(fā)育、中性粒細胞趨化性等生物過程在DFU 組上調(diào)，下調(diào)的生物過程包括來自于RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄負調(diào)控、軸突導(dǎo)向和細胞黏附。在細胞成分類別中，DEG 主要集中在外泌體和細胞外空間。

表2 GO 分析DEG 的生物過程與細胞成分Tab 2 Biological process and cellular component of DEGs

2.3 nDFS、DFS 及DFU 中的免疫細胞分析

通 過CIBERSORTx 算 法，從6 個DFU 樣 品 和3 個DFS 樣品中獲得22 種免疫細胞的比例。與DFS 相比，DFU 中CD8+T 細胞、單核細胞、靜息自然殺傷細胞（NK 細胞）和活化的肥大細胞比例增加，而靜息肥大細胞和活化的NK 細胞的比例降低（圖2）。

圖2 DFU、DFS 和nDFS 中免疫細胞的相對比例Fig 2 Relative proportions of immune cells in DFU, DFS and nDFS

圖3 DFU、DFS 和nDFS 中免疫細胞相對比例的比較Fig 3 Comparation of the relative proportions of immune cells in DFU, DFS and nDFS

為進一步驗證在DFU 發(fā)生前后各免疫細胞比例差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Wilcoxon 秩和檢驗分別對nDFS 與DFS 組、DFS 與DFU 進行比較。如圖3 所示，nDFS 與DFS 組間，未發(fā)現(xiàn)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的免疫細胞（均P ＞0.05）；DFS 組與DFU 組間，DFU 中CD8+T 細胞、單核細胞、活化的肥大細胞和靜息NK 細胞比例顯著升高，而活化的NK 細胞和靜息肥大細胞比例顯著降 低。

3 討論

DFU 是DM 的常見并發(fā)癥，每年影響全球2 610 萬人[2]。DFU 的復(fù)發(fā)及因其導(dǎo)致的截肢是該疾病的主要難題。年復(fù)發(fā)率估計為22.1%[17]，截肢的年發(fā)生率為0.25%～1.80%，截肢后1 年的死亡率為44%[18-19]。盡管最近研究人員對DFU 發(fā)病機制展開了一些研究，但是目前對其的了解仍相對有限，因此有必要對其發(fā)病機制進行 更深入的了解以尋找潛在的治療靶點，提供更多的治療選擇。

本研究通過生物信息學(xué)方法分析了DFU 和DFS 的表達譜數(shù)據(jù)集。總共鑒定出80 個上調(diào)基因和216 個下調(diào)基因，用于后續(xù)的GO 功能富集。在前5 個上調(diào)的基因中，S100A12 參與先天免疫應(yīng)答的抗微生物感染，發(fā)揮細胞因子和趨化因子的作用，并可募集大量白細胞[20]；MMP-1 在傷口愈合過程所涉及的細胞遷移、上皮化和組織修復(fù)中起重要作用[21-22]；SPRR2B 和SPRR2F 編碼的蛋白質(zhì)是角質(zhì)化包膜的組成部分，是對抗細胞外和環(huán)境因素的屏障[23]。由此推測，DFU 組織中先天免疫應(yīng)答、抗菌功能以及特定的角質(zhì)形成有所增強。在前5 個下調(diào)的基因中，KRT2、DCD 和FLG2 或可作為潛在的治療靶點。KRT2 編碼在表皮角質(zhì)形成細胞的上棘層中表達的結(jié)構(gòu)蛋白，KRT2 缺乏會導(dǎo)致角化過度，并引起局部炎癥[24-25]。DCD 編碼的C 端肽具有抗菌和抗真菌活性[26]。FLG2 蛋白可以為皮膚提供物理屏障，并且該蛋白的C 端片段具有抗菌作用。推測DCD 和FLG2 的顯著下調(diào)可能與DFU 復(fù)發(fā)有關(guān)。其他3個基因HEPHL-1、TYRP1 和PIP 在DFU 中的作用有待進一步的研究。

GO 分析用于了解這些DEG 編碼蛋白可能涉及的生物過程和細胞成分。基底角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移是皮膚潰瘍恢復(fù)的關(guān)鍵因素[27]。在DFU 樣品，角質(zhì)形成細胞的分化、角質(zhì)化、肽交聯(lián)和表皮發(fā)育表現(xiàn)活躍。角質(zhì)形成細胞不僅提供物理屏障來預(yù)防細菌感染，而且還通過產(chǎn)生抗菌肽、炎癥細胞因子和趨化因子來促進早期免疫反應(yīng)[28]。此外，與免疫相關(guān)的過程，例如中性粒細胞趨化性和對細菌的防御反應(yīng)、炎癥反應(yīng)也有所增強。其他上調(diào)的生物過程包括血管生成的正調(diào)控、凋亡過程的正調(diào)控和細胞增殖的正調(diào)控。由這些上調(diào)的生物過程推測，DFU 局部皮膚正在進行主動表皮和血管修復(fù)和主動的炎癥反應(yīng)，以及增強抗菌功能。下調(diào)的生物過程包括來自于RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄負調(diào)控、軸突導(dǎo)向和細胞黏附。在細胞成分類別中DEG 主要集中在外泌體和細胞外空間，因此DFU 中的細胞外微環(huán)境和細胞之間的信息傳遞值得研究者關(guān)注。

根據(jù)上述研究結(jié)果推測，DFU 的形成可能伴隨著免疫微環(huán)境的改變。因此，本研究應(yīng)用CIBERSORTx 對DFU 發(fā)生前后各種免疫細胞的浸潤比例進行了全面評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DFS 和nDFS 中各免疫細胞比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，這與先前的研究[29]結(jié)果一致。因此，推測DM 患者皮膚對潰瘍的敏感性可能不是由于局部免疫微環(huán)境的改變，即在潰瘍發(fā)生前DM 患者皮膚局部免疫微環(huán)境改變并不明顯。而在DFU 和DFS 的對比中我們發(fā)現(xiàn)，活化的肥大細胞、靜息NK 細胞、CD8+T 細胞、單核細胞比例增加。

肥大細胞參與傷口愈合過程中的炎癥反應(yīng)、血管生成和細胞外基質(zhì)重吸收[30]。DFU 組中活化的肥大細胞比例顯著增加，而靜息肥大細胞比例顯著下降。該差異反映了DFU 中肥大細胞可能被激活，脫顆粒；而最近的研究表明，這種現(xiàn)象不利于傷口愈合。Tellechea 等[31]報道了在損傷之前或之后，局部應(yīng)用肥大細胞脫顆粒抑制劑MCS- 01 可以加速DM 小鼠的傷口愈合；在另一項研究[32]中，用肥大細胞脫顆粒抑制劑色甘酸二鈉預(yù)處理可以修復(fù)DM 小鼠的傷口愈合損傷。在一項應(yīng)用光生物調(diào)節(jié)和條件培養(yǎng)基治療DM 大鼠傷口的研究中，Bagheri 等[33]發(fā)現(xiàn)光生物調(diào)節(jié)和條件培養(yǎng)基加速了傷口愈合過程，并顯著減少了肥大細胞總數(shù)和肥大細胞脫顆粒。

單核細胞進入棘層分化為朗格漢斯細胞[34]。DFU 中此類細胞比例顯著增加，這與Stojadinovic 等[35]的研究一致；他們還報道了朗格漢斯細胞的數(shù)量在DFU 愈合后增 加，表明朗格漢斯細胞對潰瘍修復(fù)具有理論上的積極作 用。

NK 細胞的主要功能是識別病毒感染細胞表面的主要組織相容性復(fù)合物，觸發(fā)細胞因子釋放并引起細胞裂解或凋亡[36]。CD8+T 細胞具有與NK 細胞類似的細胞殺傷功能[37]。本研究發(fā)現(xiàn)DFU 中活化的NK 細胞減少，CD8+T細胞的比例增加，反映局部細胞免疫可能參與了DFU 的病理過程，但具體機制有待進一步研究。

既往針對數(shù)據(jù)集GSE80178 的研究發(fā)現(xiàn)了miR-15b-5p 在DFU 中的作用[10]，以及DFS 與nDFS 間的差異[29]。與之不同，本研究旨在探究DFU 發(fā)病過程中分子和免疫細胞的變化。從該數(shù)據(jù)集中本研究共篩選出296 個DEG，用于功能富集和浸潤免疫細胞分析，并發(fā)現(xiàn)了可能成為DFU 治療靶點的基因和免疫細胞。DFU 發(fā)展中的主要生物過程包括角質(zhì)化、先天免疫和抗菌功能。此外，高血糖對皮膚局部的免疫細胞比例影響較小，提示潰瘍的發(fā)生可能與其他因素如神經(jīng)或血管因素有關(guān)。在潰瘍發(fā)生后，活化的肥大細胞、靜息NK 細胞、CD8+T 細胞、單核細胞比例增加，提示它們與潰瘍的形成或修復(fù)存在關(guān)聯(lián)?？紤]到本研究局限于單個數(shù)據(jù)集，樣本數(shù)量較少且缺少臨床樣本驗證，未來還需要進一步開展更為深入的實驗來驗證本研究的結(jié)果。

參·考·文·獻

[1] Saeedi P, Petersohn I, Salpea P, et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2019, 157: 107843.

[2] Armstrong DG, Boulton AJM, Bus SA. Diabetic foot ulcers and their recurrence[J]. N Engl J Med, 2017, 376(24): 2367-2375.

[3] Lin CJ, Lan YM, Ou MQ, et al. Expression of miR-217 and HIF-1α/VEGF pathway in patients with diabetic foot ulcer and its effect on angiogenesis of diabetic foot ulcer rats[J]. J Endocrinol Invest, 2019, 42(11): 1307-1317.

[4] Baltzis D, Eleftheriadou I, Veves A. Pathogenesis and treatment of impaired wound healing in diabetes mellitus: new insights[J]. Adv Ther, 2014, 31(8): 817-836.

[5] Sinwar PD. The diabetic foot management: recent advance[J]. Int J Surg, 2015, 15: 27-30.

[6] Tsourdi E, Barthel A, Rietzsch H, et al. Current aspects in the pathophysiology and treatment of chronic wounds in diabetes mellitus[J]. Biomed Res Int, 2013, 2013: 385641.

[7] Nguyen TT, Ding DR, Wolter WR, et al. Validation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) as a novel target for treatment of diabetic foot ulcers in humans and discovery of a potent and selective small-molecule MMP-9 inhibitor that accelerates healing[J]. J Med Chem, 2018, 61(19): 8825-8837.

[8] Sunkari VG, Lind F, Botusan IR, et al. Hyperbaric oxygen therapy activates hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1), which contributes to improved wound healing in diabetic mice[J]. Wound Repair Regen, 2015, 23(1): 98-103.

[9] Icli B, Nabzdyk CS, Lujan-Hernandez J, et al. Regulation of impaired angiogenesis in diabetic dermal wound healing by microRNA-26a[J]. J Mol Cell Cardiol, 2016, 91: 151-159.

[10] Ramirez HA, Pastar I, Jozic I, et al. Staphylococcus aureus triggers induction of miR-15B-5P to diminish DNA repair and deregulate inflammatory response in diabetic foot ulcers[J]. J Invest Dermatol, 2018, 138(5): 1187-1196.

[11] Newman AM, Steen CB, Liu CL, et al. Determining cell type abundance and expression from bulk tissues with digital cytometry[J]. Nat Biotechnol, 2019, 37(7): 773-782.

[12] Carvalho BS, Irizarry RA. A framework for oligonucleotide microarray preprocessing[J]. Bioinformatics, 2010, 26(19): 2363-2367.

[13] Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data[J]. Biostatistics, 2003, 4(2): 249-264.

[14] Ashburner M, Ball CA, Blake JA, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium[J]. Nat Genet, 2000, 25(1): 25-29.

[15] Dennis G Jr, Sherman BT, Hosack DA, et al. DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery[J]. Genome Biol, 2003, 4(5): P3.

[16] Walter W, Sánchez-Cabo F, Ricote M. GOplot: an R package for visually combining expression data with functional analysis[J]. Bioinformatics, 2015, 31(17): 2912-2914.

[17] Fu XL, Ding H, Miao WW, et al. Global recurrence rates in diabetic foot ulcers: a systematic review and meta-analysis[J]. Diabetes Metab Res Rev, 2019, 35(6): e3160.

[18] Hunt DL. Diabetes: foot ulcers and amputations[J]. BMJ Clin Evid, 2011, 2011: 0602.

[19] Bruttocao A, Terranova C, Martella B, et al. Rate of amputation and mortality in new-onset diabetic foot ulcers in the elderly[J]. BMC Geriatr, 2010, 10(Suppl 1): A48.

[20] Oesterle A, Bowman MA. S100A12 and the S100/calgranulins: emerging biomarkers for atherosclerosis and possibly therapeutic targets[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2015, 35(12): 2496-2507.

[21] Trengove NJ, Stacey MC, MacAuley S, et al. Analysis of the acute and chronic wound environments: the role of proteases and their inhibitors[J]. Wound Repair Regen, 1999, 7(6): 442-452.

[22] Ladwig GP, Robson MC, Liu R, et al. Ratios of activated matrix metalloproteinase-9 to tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in wound fluids are inversely correlated with healing of pressure ulcers[J]. Wound Repair Regen, 2002, 10(1): 26-37.

[23] Tesfaigzi J, Carlson DM. Expression, regulation, and function of the SPR family of proteins. A review[J]. Cell Biochem Biophys, 1999, 30(2): 243-265.

[24] Fischer H, Langbein L, Reichelt J, et al. Loss of keratin K2 expression causes aberrant aggregation of K10, hyperkeratosis, and inflammation[J]. J Invest Dermatol, 2014, 134(10): 2579-2588.

[25] Fischer H, Langbein L, Reichelt J, et al. Keratins K2 and K10 are essential for the epidermal integrity of plantar skin[J]. J Dermatol Sci, 2016, 81(1): 10-16.

[26] Steffen H, Rieg S, Wiedemann I, et al. Naturally processed dermcidin-derived peptides do not permeabilize bacterial membranes and kill microorganisms irrespective of their charge[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(8): 2608-2620.

[27] Kurita M, Araoka T, Hishida T, et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue[J]. Nature, 2018, 561(7722): 243-247.

[28] Krishna S, Miller LS. Innate and adaptive immune responses against Staphylococcus aureus skin infections[J]. Semin Immunopathol, 2012, 34(2): 261-280.

對于±800 kV滇西北至廣東特高壓直流輸電線路工程共塔段線路，若將接地極線的鐵塔橫擔更換為復(fù)合橫擔，復(fù)合橫擔長度暫取4.2 m(暫取該工程各塔型鐵塔橫擔長度中的最小值)，雷擊閃絡(luò)率如表2所示。

[29] Ramirez HA, Liang L, Pastar I, et al. Comparative genomic, microRNA, and tissue analyses reveal subtle differences between non-diabetic and diabetic foot skin[J]. PLoS One, 2015, 10(8): e0137133.

[30] Oskeritzian CA. Mast cells and wound healing[J]. Adv Wound Care, 2012, 1(1): 23-28.

[31] Tellechea A, Bai S, Dangwal S, et al. Topical application of a mast cell stabilizer improves impaired diabetic wound healing[J]. J Invest Dermatol, 2020, 140(4): 901-911.e11.

[32] Tellechea A, Leal EC, Kafanas A, et al. Mast cells regulate wound healing in diabetes[J]. Diabetes, 2016, 65(7): 2006-2019.

[33] Bagheri M, Amini A, Abdollahifar MA, et al. Effects of photobiomodulation on degranulation and number of mast cells and wound strength in skin wound healing of streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Photomed Laser Surg, 2018, 36(8): 415-423.

[34] Deckers J, Hammad H, Hoste E. Langerhans cells: sensing the environment in health and disease[J]. Front Immunol, 2018, 9: 93.

[36] Paul S, Lal G. The molecular mechanism of natural killer cells function and its importance in cancer immunotherapy[J]. Front Immunol, 2017, 8: 1124.

[37] Rosenberg J, Huang J. CD8+T cells and NK cells: parallel and complementary soldiers of immunotherapy[J]. Curr Opin Chem Eng, 2018, 19: 9-20.