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        糖尿病足潰瘍相關(guān)基因與免疫細胞特征分析

        2020-11-30 03:49:38楊曉笙廖陳龍張文川
        關(guān)鍵詞:肥大細胞活化傷口

        周 晗,楊曉笙,廖陳龍,張文川

        上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院神經(jīng)外科,上海 200011

        2019 年,約有4.63 億成年人患糖尿?。╠iabetes mellitus,DM),這一數(shù)字在2045 年預(yù)計將超過7 億[1]。糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulceration,DFU)是最常見且醫(yī)療負擔最高的DM 并發(fā)癥之一,DFU 患者約占DM 患者的15%[2]。隨著DM 患病人數(shù)的增加和DM 患者預(yù)期壽命的延長,DFU 患者的數(shù)量將持續(xù)增加[3]。DFU 患者面臨復(fù)發(fā)和截肢的高風(fēng)險,并承受著巨大的經(jīng)濟負擔。DFU 的病因復(fù)雜多樣[4],周圍神經(jīng)病變、周圍動脈疾病和重復(fù)性創(chuàng)傷被認為是主要誘發(fā)因素。與正常傷口愈合相比,DM患者傷口愈合過程中受到高血糖、慢性炎癥、缺氧和神經(jīng)肽信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受損的影響[4],造成傷口愈合不良,最終可能導(dǎo)致慢性開放性潰瘍[5]。此外,DM 患者的免疫反應(yīng)和對感染的抵抗力也發(fā)生了改變[6]。因此,有必要了解DFU發(fā)生過程中的潛在分子機制,并確定更具體有效的治療干預(yù)措施。

        近年來,DFU 的分子生物學(xué)機制研究已取得一些成果。Nguyen 等[7]研究發(fā)現(xiàn)活性基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)上調(diào)是DM 小鼠傷口難以愈合的原因,并證明其抑制劑(R)-ND-336 較貝卡普勒明(becaplermin,一種現(xiàn)有的經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的DFU 藥物)對傷口愈合更有效。Sunkari 等[8]提出,缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)的激活有助于改善DM 小鼠的傷口愈合。Icli 等[9]指出,miRNA-26a 可以顯著提高DM 小鼠傷口愈合的速度。Ramirez等[10]利用基因表達譜芯片研究發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的DFU 中miR-15b-5p 上調(diào),并在進一步的實驗中證實其對DNA 修復(fù)和炎癥反應(yīng)的抑制作用。

        在本研究中,GSE80178 的芯片數(shù)據(jù)下載于美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI) 基 因 表 達 綜 合 數(shù) 據(jù) 庫(Gene Expression Omnibus,GEO)。通過這些數(shù)據(jù)來鑒定DFU與糖尿病足皮膚(diabetic foot skin,DFS)的差異表達基因(differentially expressed genes,DEG)及其生物學(xué)功能,并基于反卷積算法(CIBERSORTx)[11]探索影響DFU 發(fā)展的免疫細胞,旨在為DFU 靶向治療藥物的開發(fā)提供新的思路。

        1 資料與方法

        1.1 芯片數(shù)據(jù)和預(yù)處理

        mRNA 數(shù)據(jù)集GSE80178 下載自GEO 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。 該 數(shù) 據(jù) 集 的 建 立 基 于GPL16686(Affymetrix Human Gene)平臺[10],共包含12 個獨立樣本,包括6 個DFU 樣本、3 個DFS 樣本和3 個非糖尿病足部皮膚(non-diabetic foot skin,nDFS)樣本,即正常人皮膚樣本。通過R 語言中的oligo 軟件包[12]讀取CEL文件探針級數(shù)據(jù)。原始表達數(shù)據(jù)使用RMA(Robust Multi-Array Average)算法[13]進行背景校正,log2轉(zhuǎn)換及歸一化。

        1.2 差異基因篩選和功能富集分析

        利用R 語言中的limma 包來鑒別DEG,且以P < 0.05、log2|Fold Change|(log2|FC|) >1 用作截斷標準。為探索DEG 涉及的基因功能,我們將DEG 提交給DAVID(Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行注釋與聚類[14-15]。基因功能的可視化是使用GOplot 程序包[16]生成的。對應(yīng)的篩選標準為P<0.05,基因計數(shù)>5。

        1.3 免疫細胞分析

        CIBERSORTx 提供了一種反卷積算法,可根據(jù)基因表達數(shù)據(jù)估算混合細胞群中成員細胞類型的豐度。利用該算法及其提供的22 種免疫細胞的547 個標記基因,對12 個樣本進行反卷積分析,推斷22 種免疫細胞在nDFS、DFS 及DFU 的相對含量,并通過Wilcoxon 秩和檢驗分析了nDFS、DFS 與DFU 之間各種免疫細胞比例的差異。使用R 語言的vioplot 軟件包繪制小提琴圖以可視化22 種浸潤免疫細胞的比例差異。

        2 結(jié)果

        2.1 DFU 與DFS 之間DEG 鑒別

        經(jīng)RMA 算法預(yù)處理后,所有樣品的基因表達平均值處于同一水平,以P<0.05 和log2|FC|>2 為標準,共獲得296 個DFU 與DFS 之間的DEG?;鹕綀D中顯示了80 個上調(diào)基因和216 個下調(diào)基因(圖1A)。按log2|FC| 排序,并在熱圖中展示前5 個上調(diào)和下調(diào)基因(圖1B),這10個基因的具體信息見表1。

        圖1 DFU 和DFS 之間的DEGFig 1 DEGs between DFU and DFS

        表1 DFU 和DFS 之間上調(diào)和下調(diào)的前5 位DEGTab 1 Top 5 up-regulated and down-regulated DEGs between DFU and DFS

        2.2 功能注釋與富集分析

        以基因本體論(Gene Ontology,GO)注釋了DFU 和DFS 之間DEG 所代表的生物學(xué)特征(表2)。以P<0.05、基因計數(shù)>5 為篩選條件,篩選出3 個下調(diào)和11 個上調(diào)的生物過程,以及5 個下調(diào)和3 個上調(diào)的細胞成分。角質(zhì)形成細胞的分化、角質(zhì)化、肽交聯(lián)、表皮發(fā)育、中性粒細胞趨化性等生物過程在DFU 組上調(diào),下調(diào)的生物過程包括來自于RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄負調(diào)控、軸突導(dǎo)向和細胞黏附。在細胞成分類別中,DEG 主要集中在外泌體和細胞外空間。

        表2 GO 分析DEG 的生物過程與細胞成分Tab 2 Biological process and cellular component of DEGs

        2.3 nDFS、DFS 及DFU 中的免疫細胞分析

        通 過CIBERSORTx 算 法,從6 個DFU 樣 品 和3 個DFS 樣品中獲得22 種免疫細胞的比例。與DFS 相比,DFU 中CD8+T 細胞、單核細胞、靜息自然殺傷細胞(NK 細胞)和活化的肥大細胞比例增加,而靜息肥大細胞和活化的NK 細胞的比例降低(圖2)。

        圖2 DFU、DFS 和nDFS 中免疫細胞的相對比例Fig 2 Relative proportions of immune cells in DFU, DFS and nDFS

        圖3 DFU、DFS 和nDFS 中免疫細胞相對比例的比較Fig 3 Comparation of the relative proportions of immune cells in DFU, DFS and nDFS

        為進一步驗證在DFU 發(fā)生前后各免疫細胞比例差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義,采用Wilcoxon 秩和檢驗分別對nDFS 與DFS 組、DFS 與DFU 進行比較。如圖3 所示,nDFS 與DFS 組間,未發(fā)現(xiàn)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的免疫細胞(均P >0.05);DFS 組與DFU 組間,DFU 中CD8+T 細胞、單核細胞、活化的肥大細胞和靜息NK 細胞比例顯著升高,而活化的NK 細胞和靜息肥大細胞比例顯著降 低。

        3 討論

        DFU 是DM 的常見并發(fā)癥,每年影響全球2 610 萬人[2]。DFU 的復(fù)發(fā)及因其導(dǎo)致的截肢是該疾病的主要難題。年復(fù)發(fā)率估計為22.1%[17],截肢的年發(fā)生率為0.25%~1.80%,截肢后1 年的死亡率為44%[18-19]。盡管最近研究人員對DFU 發(fā)病機制展開了一些研究,但是目前對其的了解仍相對有限,因此有必要對其發(fā)病機制進行 更深入的了解以尋找潛在的治療靶點,提供更多的治療選擇。

        本研究通過生物信息學(xué)方法分析了DFU 和DFS 的表達譜數(shù)據(jù)集。總共鑒定出80 個上調(diào)基因和216 個下調(diào)基因,用于后續(xù)的GO 功能富集。在前5 個上調(diào)的基因中,S100A12 參與先天免疫應(yīng)答的抗微生物感染,發(fā)揮細胞因子和趨化因子的作用,并可募集大量白細胞[20];MMP-1 在傷口愈合過程所涉及的細胞遷移、上皮化和組織修復(fù)中起重要作用[21-22];SPRR2B 和SPRR2F 編碼的蛋白質(zhì)是角質(zhì)化包膜的組成部分,是對抗細胞外和環(huán)境因素的屏障[23]。由此推測,DFU 組織中先天免疫應(yīng)答、抗菌功能以及特定的角質(zhì)形成有所增強。在前5 個下調(diào)的基因中,KRT2、DCD 和FLG2 或可作為潛在的治療靶點。KRT2 編碼在表皮角質(zhì)形成細胞的上棘層中表達的結(jié)構(gòu)蛋白,KRT2 缺乏會導(dǎo)致角化過度,并引起局部炎癥[24-25]。DCD 編碼的C 端肽具有抗菌和抗真菌活性[26]。FLG2 蛋白可以為皮膚提供物理屏障,并且該蛋白的C 端片段具有抗菌作用。推測DCD 和FLG2 的顯著下調(diào)可能與DFU 復(fù)發(fā)有關(guān)。其他3個基因HEPHL-1、TYRP1 和PIP 在DFU 中的作用有待進一步的研究。

        GO 分析用于了解這些DEG 編碼蛋白可能涉及的生物過程和細胞成分。基底角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移是皮膚潰瘍恢復(fù)的關(guān)鍵因素[27]。在DFU 樣品,角質(zhì)形成細胞的分化、角質(zhì)化、肽交聯(lián)和表皮發(fā)育表現(xiàn)活躍。角質(zhì)形成細胞不僅提供物理屏障來預(yù)防細菌感染,而且還通過產(chǎn)生抗菌肽、炎癥細胞因子和趨化因子來促進早期免疫反應(yīng)[28]。此外,與免疫相關(guān)的過程,例如中性粒細胞趨化性和對細菌的防御反應(yīng)、炎癥反應(yīng)也有所增強。其他上調(diào)的生物過程包括血管生成的正調(diào)控、凋亡過程的正調(diào)控和細胞增殖的正調(diào)控。由這些上調(diào)的生物過程推測,DFU 局部皮膚正在進行主動表皮和血管修復(fù)和主動的炎癥反應(yīng),以及增強抗菌功能。下調(diào)的生物過程包括來自于RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄負調(diào)控、軸突導(dǎo)向和細胞黏附。在細胞成分類別中DEG 主要集中在外泌體和細胞外空間,因此DFU 中的細胞外微環(huán)境和細胞之間的信息傳遞值得研究者關(guān)注。

        根據(jù)上述研究結(jié)果推測,DFU 的形成可能伴隨著免疫微環(huán)境的改變。因此,本研究應(yīng)用CIBERSORTx 對DFU 發(fā)生前后各種免疫細胞的浸潤比例進行了全面評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在DFS 和nDFS 中各免疫細胞比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,這與先前的研究[29]結(jié)果一致。因此,推測DM 患者皮膚對潰瘍的敏感性可能不是由于局部免疫微環(huán)境的改變,即在潰瘍發(fā)生前DM 患者皮膚局部免疫微環(huán)境改變并不明顯。而在DFU 和DFS 的對比中我們發(fā)現(xiàn),活化的肥大細胞、靜息NK 細胞、CD8+T 細胞、單核細胞比例增加。

        肥大細胞參與傷口愈合過程中的炎癥反應(yīng)、血管生成和細胞外基質(zhì)重吸收[30]。DFU 組中活化的肥大細胞比例顯著增加,而靜息肥大細胞比例顯著下降。該差異反映了DFU 中肥大細胞可能被激活,脫顆粒;而最近的研究表明,這種現(xiàn)象不利于傷口愈合。Tellechea 等[31]報道了在損傷之前或之后,局部應(yīng)用肥大細胞脫顆粒抑制劑MCS- 01 可以加速DM 小鼠的傷口愈合;在另一項研究[32]中,用肥大細胞脫顆粒抑制劑色甘酸二鈉預(yù)處理可以修復(fù)DM 小鼠的傷口愈合損傷。在一項應(yīng)用光生物調(diào)節(jié)和條件培養(yǎng)基治療DM 大鼠傷口的研究中,Bagheri 等[33]發(fā)現(xiàn)光生物調(diào)節(jié)和條件培養(yǎng)基加速了傷口愈合過程,并顯著減少了肥大細胞總數(shù)和肥大細胞脫顆粒。

        單核細胞進入棘層分化為朗格漢斯細胞[34]。DFU 中此類細胞比例顯著增加,這與Stojadinovic 等[35]的研究一致;他們還報道了朗格漢斯細胞的數(shù)量在DFU 愈合后增 加,表明朗格漢斯細胞對潰瘍修復(fù)具有理論上的積極作 用。

        NK 細胞的主要功能是識別病毒感染細胞表面的主要組織相容性復(fù)合物,觸發(fā)細胞因子釋放并引起細胞裂解或凋亡[36]。CD8+T 細胞具有與NK 細胞類似的細胞殺傷功能[37]。本研究發(fā)現(xiàn)DFU 中活化的NK 細胞減少,CD8+T細胞的比例增加,反映局部細胞免疫可能參與了DFU 的病理過程,但具體機制有待進一步研究。

        既往針對數(shù)據(jù)集GSE80178 的研究發(fā)現(xiàn)了miR-15b-5p 在DFU 中的作用[10],以及DFS 與nDFS 間的差異[29]。與之不同,本研究旨在探究DFU 發(fā)病過程中分子和免疫細胞的變化。從該數(shù)據(jù)集中本研究共篩選出296 個DEG,用于功能富集和浸潤免疫細胞分析,并發(fā)現(xiàn)了可能成為DFU 治療靶點的基因和免疫細胞。DFU 發(fā)展中的主要生物過程包括角質(zhì)化、先天免疫和抗菌功能。此外,高血糖對皮膚局部的免疫細胞比例影響較小,提示潰瘍的發(fā)生可能與其他因素如神經(jīng)或血管因素有關(guān)。在潰瘍發(fā)生后,活化的肥大細胞、靜息NK 細胞、CD8+T 細胞、單核細胞比例增加,提示它們與潰瘍的形成或修復(fù)存在關(guān)聯(lián)??紤]到本研究局限于單個數(shù)據(jù)集,樣本數(shù)量較少且缺少臨床樣本驗證,未來還需要進一步開展更為深入的實驗來驗證本研究的結(jié)果。

        參·考·文·獻

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