周 晗，楊曉笙，廖陳龍，張文川

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200011

2019 年，約有4.63 億成年人患糖尿?。╠iabetes mellitus，DM），這一數(shù)字在2045 年預(yù)計(jì)將超過(guò)7 億[1]。糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulceration，DFU）是最常見(jiàn)且醫(yī)療負(fù)擔(dān)最高的DM 并發(fā)癥之一，DFU 患者約占DM 患者的15%[2]。隨著DM 患病人數(shù)的增加和DM 患者預(yù)期壽命的延長(zhǎng)，DFU 患者的數(shù)量將持續(xù)增加[3]。DFU 患者面臨復(fù)發(fā)和截肢的高風(fēng)險(xiǎn)，并承受著巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。DFU 的病因復(fù)雜多樣[4]，周?chē)窠?jīng)病變、周?chē)鷦?dòng)脈疾病和重復(fù)性創(chuàng)傷被認(rèn)為是主要誘發(fā)因素。與正常傷口愈合相比，DM患者傷口愈合過(guò)程中受到高血糖、慢性炎癥、缺氧和神經(jīng)肽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損的影響[4]，造成傷口愈合不良，最終可能導(dǎo)致慢性開(kāi)放性潰瘍[5]。此外，DM 患者的免疫反應(yīng)和對(duì)感染的抵抗力也發(fā)生了改變[6]。因此，有必要了解DFU發(fā)生過(guò)程中的潛在分子機(jī)制，并確定更具體有效的治療干預(yù)措施。

近年來(lái)，DFU 的分子生物學(xué)機(jī)制研究已取得一些成果。Nguyen 等[7]研究發(fā)現(xiàn)活性基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）上調(diào)是DM 小鼠傷口難以愈合的原因，并證明其抑制劑（R）-ND-336 較貝卡普勒明（becaplermin，一種現(xiàn)有的經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的DFU 藥物）對(duì)傷口愈合更有效。Sunkari 等[8]提出，缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1）的激活有助于改善DM 小鼠的傷口愈合。Icli 等[9]指出，miRNA-26a 可以顯著提高DM 小鼠傷口愈合的速度。Ramirez等[10]利用基因表達(dá)譜芯片研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的DFU 中miR-15b-5p 上調(diào)，并在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其對(duì)DNA 修復(fù)和炎癥反應(yīng)的抑制作用。

在本研究中，GSE80178 的芯片數(shù)據(jù)下載于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI） 基 因 表 達(dá) 綜 合 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）。通過(guò)這些數(shù)據(jù)來(lái)鑒定DFU與糖尿病足皮膚（diabetic foot skin，DFS）的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEG）及其生物學(xué)功能，并基于反卷積算法（CIBERSORTx）[11]探索影響DFU 發(fā)展的免疫細(xì)胞，旨在為DFU 靶向治療藥物的開(kāi)發(fā)提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)和預(yù)處理

mRNA 數(shù)據(jù)集GSE80178 下載自GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。 該 數(shù) 據(jù) 集 的 建 立 基 于GPL16686（Affymetrix Human Gene）平臺(tái)[10]，共包含12 個(gè)獨(dú)立樣本，包括6 個(gè)DFU 樣本、3 個(gè)DFS 樣本和3 個(gè)非糖尿病足部皮膚（non-diabetic foot skin，nDFS）樣本，即正常人皮膚樣本。通過(guò)R 語(yǔ)言中的oligo 軟件包[12]讀取CEL文件探針級(jí)數(shù)據(jù)。原始表達(dá)數(shù)據(jù)使用RMA（Robust Multi-Array Average）算法[13]進(jìn)行背景校正，log2轉(zhuǎn)換及歸一化。

1.2 差異基因篩選和功能富集分析

利用R 語(yǔ)言中的limma 包來(lái)鑒別DEG，且以P ＜ 0.05、log2|Fold Change|（log2|FC|） ＞1 用作截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)。為探索DEG 涉及的基因功能，我們將DEG 提交給DAVID（Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行注釋與聚類(lèi)[14-15]?；蚬δ艿目梢暬鞘褂肎Oplot 程序包[16]生成的。對(duì)應(yīng)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，基因計(jì)數(shù)＞5。

1.3 免疫細(xì)胞分析

CIBERSORTx 提供了一種反卷積算法，可根據(jù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)估算混合細(xì)胞群中成員細(xì)胞類(lèi)型的豐度。利用該算法及其提供的22 種免疫細(xì)胞的547 個(gè)標(biāo)記基因，對(duì)12 個(gè)樣本進(jìn)行反卷積分析，推斷22 種免疫細(xì)胞在nDFS、DFS 及DFU 的相對(duì)含量，并通過(guò)Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分析了nDFS、DFS 與DFU 之間各種免疫細(xì)胞比例的差異。使用R 語(yǔ)言的vioplot 軟件包繪制小提琴圖以可視化22 種浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的比例差異。

2 結(jié)果

2.1 DFU 與DFS 之間DEG 鑒別

經(jīng)RMA 算法預(yù)處理后，所有樣品的基因表達(dá)平均值處于同一水平，以P＜0.05 和log2|FC|＞2 為標(biāo)準(zhǔn)，共獲得296 個(gè)DFU 與DFS 之間的DEG。火山圖中顯示了80 個(gè)上調(diào)基因和216 個(gè)下調(diào)基因（圖1A）。按log2|FC| 排序，并在熱圖中展示前5 個(gè)上調(diào)和下調(diào)基因（圖1B），這10個(gè)基因的具體信息見(jiàn)表1。

圖1 DFU 和DFS 之間的DEGFig 1 DEGs between DFU and DFS

表1 DFU 和DFS 之間上調(diào)和下調(diào)的前5 位DEGTab 1 Top 5 up-regulated and down-regulated DEGs between DFU and DFS

2.2 功能注釋與富集分析

以基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋了DFU 和DFS 之間DEG 所代表的生物學(xué)特征（表2）。以P＜0.05、基因計(jì)數(shù)＞5 為篩選條件，篩選出3 個(gè)下調(diào)和11 個(gè)上調(diào)的生物過(guò)程，以及5 個(gè)下調(diào)和3 個(gè)上調(diào)的細(xì)胞成分。角質(zhì)形成細(xì)胞的分化、角質(zhì)化、肽交聯(lián)、表皮發(fā)育、中性粒細(xì)胞趨化性等生物過(guò)程在DFU 組上調(diào)，下調(diào)的生物過(guò)程包括來(lái)自于RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、軸突導(dǎo)向和細(xì)胞黏附。在細(xì)胞成分類(lèi)別中，DEG 主要集中在外泌體和細(xì)胞外空間。

表2 GO 分析DEG 的生物過(guò)程與細(xì)胞成分Tab 2 Biological process and cellular component of DEGs

2.3 nDFS、DFS 及DFU 中的免疫細(xì)胞分析

通 過(guò)CIBERSORTx 算 法，從6 個(gè)DFU 樣 品 和3 個(gè)DFS 樣品中獲得22 種免疫細(xì)胞的比例。與DFS 相比，DFU 中CD8+T 細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜息自然殺傷細(xì)胞（NK 細(xì)胞）和活化的肥大細(xì)胞比例增加，而靜息肥大細(xì)胞和活化的NK 細(xì)胞的比例降低（圖2）。

圖2 DFU、DFS 和nDFS 中免疫細(xì)胞的相對(duì)比例Fig 2 Relative proportions of immune cells in DFU, DFS and nDFS

圖3 DFU、DFS 和nDFS 中免疫細(xì)胞相對(duì)比例的比較Fig 3 Comparation of the relative proportions of immune cells in DFU, DFS and nDFS

為進(jìn)一步驗(yàn)證在DFU 發(fā)生前后各免疫細(xì)胞比例差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分別對(duì)nDFS 與DFS 組、DFS 與DFU 進(jìn)行比較。如圖3 所示，nDFS 與DFS 組間，未發(fā)現(xiàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的免疫細(xì)胞（均P ＞0.05）；DFS 組與DFU 組間，DFU 中CD8+T 細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞和靜息NK 細(xì)胞比例顯著升高，而活化的NK 細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞比例顯著降 低。

3 討論

DFU 是DM 的常見(jiàn)并發(fā)癥，每年影響全球2 610 萬(wàn)人[2]。DFU 的復(fù)發(fā)及因其導(dǎo)致的截肢是該疾病的主要難題。年復(fù)發(fā)率估計(jì)為22.1%[17]，截肢的年發(fā)生率為0.25%～1.80%，截肢后1 年的死亡率為44%[18-19]。盡管最近研究人員對(duì)DFU 發(fā)病機(jī)制展開(kāi)了一些研究，但是目前對(duì)其的了解仍相對(duì)有限，因此有必要對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行 更深入的了解以尋找潛在的治療靶點(diǎn)，提供更多的治療選擇。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了DFU 和DFS 的表達(dá)譜數(shù)據(jù)集。總共鑒定出80 個(gè)上調(diào)基因和216 個(gè)下調(diào)基因，用于后續(xù)的GO 功能富集。在前5 個(gè)上調(diào)的基因中，S100A12 參與先天免疫應(yīng)答的抗微生物感染，發(fā)揮細(xì)胞因子和趨化因子的作用，并可募集大量白細(xì)胞[20]；MMP-1 在傷口愈合過(guò)程所涉及的細(xì)胞遷移、上皮化和組織修復(fù)中起重要作用[21-22]；SPRR2B 和SPRR2F 編碼的蛋白質(zhì)是角質(zhì)化包膜的組成部分，是對(duì)抗細(xì)胞外和環(huán)境因素的屏障[23]。由此推測(cè)，DFU 組織中先天免疫應(yīng)答、抗菌功能以及特定的角質(zhì)形成有所增強(qiáng)。在前5 個(gè)下調(diào)的基因中，KRT2、DCD 和FLG2 或可作為潛在的治療靶點(diǎn)。KRT2 編碼在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的上棘層中表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白，KRT2 缺乏會(huì)導(dǎo)致角化過(guò)度，并引起局部炎癥[24-25]。DCD 編碼的C 端肽具有抗菌和抗真菌活性[26]。FLG2 蛋白可以為皮膚提供物理屏障，并且該蛋白的C 端片段具有抗菌作用。推測(cè)DCD 和FLG2 的顯著下調(diào)可能與DFU 復(fù)發(fā)有關(guān)。其他3個(gè)基因HEPHL-1、TYRP1 和PIP 在DFU 中的作用有待進(jìn)一步的研究。

GO 分析用于了解這些DEG 編碼蛋白可能涉及的生物過(guò)程和細(xì)胞成分?；捉琴|(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移是皮膚潰瘍恢復(fù)的關(guān)鍵因素[27]。在DFU 樣品，角質(zhì)形成細(xì)胞的分化、角質(zhì)化、肽交聯(lián)和表皮發(fā)育表現(xiàn)活躍。角質(zhì)形成細(xì)胞不僅提供物理屏障來(lái)預(yù)防細(xì)菌感染，而且還通過(guò)產(chǎn)生抗菌肽、炎癥細(xì)胞因子和趨化因子來(lái)促進(jìn)早期免疫反應(yīng)[28]。此外，與免疫相關(guān)的過(guò)程，例如中性粒細(xì)胞趨化性和對(duì)細(xì)菌的防御反應(yīng)、炎癥反應(yīng)也有所增強(qiáng)。其他上調(diào)的生物過(guò)程包括血管生成的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的正調(diào)控和細(xì)胞增殖的正調(diào)控。由這些上調(diào)的生物過(guò)程推測(cè)，DFU 局部皮膚正在進(jìn)行主動(dòng)表皮和血管修復(fù)和主動(dòng)的炎癥反應(yīng)，以及增強(qiáng)抗菌功能。下調(diào)的生物過(guò)程包括來(lái)自于RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、軸突導(dǎo)向和細(xì)胞黏附。在細(xì)胞成分類(lèi)別中DEG 主要集中在外泌體和細(xì)胞外空間，因此DFU 中的細(xì)胞外微環(huán)境和細(xì)胞之間的信息傳遞值得研究者關(guān)注。

根據(jù)上述研究結(jié)果推測(cè)，DFU 的形成可能伴隨著免疫微環(huán)境的改變。因此，本研究應(yīng)用CIBERSORTx 對(duì)DFU 發(fā)生前后各種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例進(jìn)行了全面評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DFS 和nDFS 中各免疫細(xì)胞比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與先前的研究[29]結(jié)果一致。因此，推測(cè)DM 患者皮膚對(duì)潰瘍的敏感性可能不是由于局部免疫微環(huán)境的改變，即在潰瘍發(fā)生前DM 患者皮膚局部免疫微環(huán)境改變并不明顯。而在DFU 和DFS 的對(duì)比中我們發(fā)現(xiàn)，活化的肥大細(xì)胞、靜息NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、單核細(xì)胞比例增加。

肥大細(xì)胞參與傷口愈合過(guò)程中的炎癥反應(yīng)、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)重吸收[30]。DFU 組中活化的肥大細(xì)胞比例顯著增加，而靜息肥大細(xì)胞比例顯著下降。該差異反映了DFU 中肥大細(xì)胞可能被激活，脫顆粒；而最近的研究表明，這種現(xiàn)象不利于傷口愈合。Tellechea 等[31]報(bào)道了在損傷之前或之后，局部應(yīng)用肥大細(xì)胞脫顆粒抑制劑MCS- 01 可以加速DM 小鼠的傷口愈合；在另一項(xiàng)研究[32]中，用肥大細(xì)胞脫顆粒抑制劑色甘酸二鈉預(yù)處理可以修復(fù)DM 小鼠的傷口愈合損傷。在一項(xiàng)應(yīng)用光生物調(diào)節(jié)和條件培養(yǎng)基治療DM 大鼠傷口的研究中，Bagheri 等[33]發(fā)現(xiàn)光生物調(diào)節(jié)和條件培養(yǎng)基加速了傷口愈合過(guò)程，并顯著減少了肥大細(xì)胞總數(shù)和肥大細(xì)胞脫顆粒。

單核細(xì)胞進(jìn)入棘層分化為朗格漢斯細(xì)胞[34]。DFU 中此類(lèi)細(xì)胞比例顯著增加，這與Stojadinovic 等[35]的研究一致；他們還報(bào)道了朗格漢斯細(xì)胞的數(shù)量在DFU 愈合后增 加，表明朗格漢斯細(xì)胞對(duì)潰瘍修復(fù)具有理論上的積極作 用。

NK 細(xì)胞的主要功能是識(shí)別病毒感染細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合物，觸發(fā)細(xì)胞因子釋放并引起細(xì)胞裂解或凋亡[36]。CD8+T 細(xì)胞具有與NK 細(xì)胞類(lèi)似的細(xì)胞殺傷功能[37]。本研究發(fā)現(xiàn)DFU 中活化的NK 細(xì)胞減少，CD8+T細(xì)胞的比例增加，反映局部細(xì)胞免疫可能參與了DFU 的病理過(guò)程，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

既往針對(duì)數(shù)據(jù)集GSE80178 的研究發(fā)現(xiàn)了miR-15b-5p 在DFU 中的作用[10]，以及DFS 與nDFS 間的差異[29]。與之不同，本研究旨在探究DFU 發(fā)病過(guò)程中分子和免疫細(xì)胞的變化。從該數(shù)據(jù)集中本研究共篩選出296 個(gè)DEG，用于功能富集和浸潤(rùn)免疫細(xì)胞分析，并發(fā)現(xiàn)了可能成為DFU 治療靶點(diǎn)的基因和免疫細(xì)胞。DFU 發(fā)展中的主要生物過(guò)程包括角質(zhì)化、先天免疫和抗菌功能。此外，高血糖對(duì)皮膚局部的免疫細(xì)胞比例影響較小，提示潰瘍的發(fā)生可能與其他因素如神經(jīng)或血管因素有關(guān)。在潰瘍發(fā)生后，活化的肥大細(xì)胞、靜息NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、單核細(xì)胞比例增加，提示它們與潰瘍的形成或修復(fù)存在關(guān)聯(lián)?？紤]到本研究局限于單個(gè)數(shù)據(jù)集，樣本數(shù)量較少且缺少臨床樣本驗(yàn)證，未來(lái)還需要進(jìn)一步開(kāi)展更為深入的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證本研究的結(jié)果。

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