鄭 磊，林佳昀，張馳豪，趙治鋒，李泓杰，戚曉亮，火海鐘，羅 蒙

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院普外科，上海 200011

門(mén)靜脈高壓癥（portal hypertension，PHT）是指由于門(mén)靜脈系統(tǒng)的血液循環(huán)受阻導(dǎo)致門(mén)靜脈壓力（portal pressure，PP）升高，從而出現(xiàn)一系列如脾大、脾功能亢進(jìn)、血液系統(tǒng)三系減少、直腸和臍周淺靜脈曲張、食管胃底靜脈曲張（esophageal and gastric varices，EGV）、腹水等臨床表現(xiàn)的綜合征[1-3]。在我國(guó)，由于肝移植受多方面因素的制約，其尚未被作為治療肝硬化PHT 的主要方式，因此絕大多數(shù)病例仍需進(jìn)行內(nèi)外科綜合治療[4-5]。所以，針對(duì)PHT 發(fā)病機(jī)制的研究，探索有效的PHT 治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

肝臟出現(xiàn)不可逆的硬化是引起PHT 的始動(dòng)因素[6]。在PHT 中，PP 的逐漸升高可引起門(mén)脈系統(tǒng)血管中眾多機(jī)械力如內(nèi)皮拉伸力、血管壁張力和流體剪切應(yīng)力等的增加，一氧化氮（nitric oxide，NO）產(chǎn)生的增多，進(jìn)而導(dǎo)致脾大及腸系膜上動(dòng)脈（superior mesenteric artery，SMA）對(duì)縮血管物質(zhì)的低反應(yīng)性，從而引起內(nèi)臟循環(huán)血量增多，引發(fā)高動(dòng)力循環(huán)綜合征并促進(jìn)廣泛側(cè)支循環(huán)形成[7-8]。而動(dòng)脈重構(gòu)是由于長(zhǎng)期血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改變和機(jī)械力作用導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，包括動(dòng)脈壁彈性的快速調(diào)節(jié)、動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重塑的慢性調(diào)節(jié)等[9-10]。已有研究[11]表明，肝硬化PHT 患者的腹主動(dòng)脈發(fā)生順應(yīng)性改變，以管壁變薄、每個(gè)截面積細(xì)胞數(shù)量變少為特征。因此，本研究針對(duì)肝硬化PHT 發(fā)病機(jī)制中的SMA 重構(gòu)的具體表型進(jìn)行探討，以期為PHT患者的綜合治療提供新的思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要儀器及試劑

SPF 級(jí) 健 康 雄 性Sprague-Dawley 大 鼠26 只[ 由 上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2018-0004]，體質(zhì)量為250 ～300 g。該大鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物房的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（滬）2016-0016。所有大鼠飼以鈷-60 輻照滅菌標(biāo)準(zhǔn)干顆粒飼料，于溫度約25℃、濕度60%～70%、12 h 光照與黑暗交替條件下，自由進(jìn)食、飲水。本研究根據(jù)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》對(duì)動(dòng)物進(jìn)行操作。

四氯化碳（CCl4）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），苯巴比妥（Sigma，美國(guó)），蘇木精伊紅液、馬松（Masson）染液、天狼星紅（Sirius Red）染液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、彈性蛋白抗體、鈣調(diào)蛋白抗體、cleaved caspase-3 抗體（Cell Signal Technology，美國(guó)），Ki-67 抗體（Abcam，美國(guó)），RZ-6240E 四通道生物信號(hào)采集系統(tǒng)（上海脈永醫(yī)療科技有限公司），全自動(dòng)生物組織包埋機(jī)、凍臺(tái)（Leica，德國(guó)），正置光學(xué)顯微鏡、解剖顯微鏡及成像系統(tǒng)（Nikon，日本），熒光顯微鏡（Zeiss，德國(guó)），LEICA RM 2235 切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組和肝硬化PHT 大鼠模型制備 為觀察肝硬化PHT 不同嚴(yán)重程度對(duì)SMA 重構(gòu)表型的影響，本研究將大鼠分為正常對(duì)照組（Normal group）8 只、CCl4吸入8周PHT 組（CCl48 w group）8 只、CCl4吸入12 周PHT 組（CCl412 w group）10 只。對(duì)于CCl4吸入8 周及12 周組大鼠：將CCl4溶液置入容器中，一邊接入流動(dòng)空氣，一邊接入飼養(yǎng)籠。大鼠平均每次吸入CCl4的時(shí)間為1 ～2 min，前3 周吸入CCl4的時(shí)間為3 ～5 min，每周2 次；飲用苯巴比妥水（0.3 g/L）。正常對(duì)照組大鼠則采用不給予含CCl4溶液的空氣，每周2 次，正常飲水。后續(xù)，可通過(guò)檢測(cè)3 組大鼠的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)、觀察其肝臟的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，判斷模型構(gòu)建是否成功。

1.2.2 大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 稱(chēng)重后，用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉3 組大鼠。根據(jù)大鼠股動(dòng)脈搏動(dòng)情 況確定股動(dòng)脈走行，在游離股動(dòng)脈約2 cm 處結(jié)扎遠(yuǎn)心端，并用動(dòng)脈夾夾閉近心端。用肝素鈉生理鹽水溶液（100 U/mL）充滿(mǎn)22 G 靜脈留置針后，將其插入股動(dòng)脈，松開(kāi)動(dòng)脈夾，用絲線(xiàn)結(jié)扎并固定針管和股動(dòng)脈近心端，針管另一端則與肝素化的壓力換能器相連，通過(guò)RZ-6240E四通道生物信號(hào)采集系統(tǒng)讀取并記錄平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）。而后，從正中切口進(jìn)腹，將肝臟上翻，沿腸系膜找到門(mén)靜脈主干，將PE-50 導(dǎo)管平行刺入門(mén)靜脈1.5 cm 左右，其另一端與肝素化的壓力換能器相連。平衡10 min 后，通過(guò)RZ-6240E 四通道生物信號(hào)采集系統(tǒng)讀取并記錄PP。

1.2.3 大鼠SMA 獲取 取出所有大鼠的肝臟組織，雙手游離暴露整段腸系膜環(huán)。用血管鉗鉗夾腸系膜與后腹壁連接處，在鉗夾處遠(yuǎn)端剪下腸系膜及整段腸管，并將其迅速置入生理鹽水溶液中。隨后，用針頭將其固定于培養(yǎng)皿中的硅膠板上，最大程度地暴露SMA 及其分支。去除淋巴結(jié)和脂肪后，緩慢分離SMA，并將中段SMA 置于4%多聚甲醛中，以備后續(xù)行免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測(cè)；剩余部分SMA 保存于液氮中，以備后續(xù)行蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測(cè)。

1.2.4 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 取上述肝臟組織制備石蠟切片，而后分別行蘇木精- 伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H-E staining，H-E 染色）、Masson 染色和Sirius Red 染色，以觀察肝臟結(jié)構(gòu)。取上述獲取的SMA 組織制備冰凍切片后行H-E 染色，觀察其血管直徑、血管壁厚度和血管面積。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)中段SMA 中鈣調(diào)蛋白的表達(dá)。采用免疫熒光法檢測(cè)中段SMA 中彈性蛋白、cleaved caspase-3 蛋白及Ki-67 蛋白的表達(dá)，并采用Western blotting 檢測(cè)保存于液氮中SMA 的鈣調(diào)蛋白和彈性蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Image J 軟件定量分析SMA 的血管直徑、血管壁厚度和血管面積等參數(shù)，免疫組織化學(xué)結(jié)果和Western blotting 結(jié)果。應(yīng)用Zessi 2.6 軟件分析免疫熒光結(jié)果，并用Image J 軟件定量分析。應(yīng)用SPSS 20.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝硬化PHT 模型的建立

本研究通過(guò)對(duì)3 組大鼠進(jìn)行不同方式的處理后發(fā)現(xiàn)：①正常對(duì)照組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，毛發(fā)有光澤，抓持時(shí)皮膚有彈性，掙脫力較大；而CCl4吸入8 周和12 周的肝硬化PHT 組大鼠，隨著吸入時(shí)間的增加，毛發(fā)變得稀疏，精神逐漸發(fā)生萎靡，掙脫力明顯減弱，且部分大鼠產(chǎn)生了明顯的腹水（圖1A）。②正常對(duì)照組大鼠肝臟形態(tài)規(guī)則，表面光滑，顏色紅潤(rùn)且質(zhì)地柔軟；CCl4吸入8 周的肝硬化PHT 組大鼠肝臟顏色變灰黃，表面多不規(guī)則；而CCl4吸入12 周大鼠的肝臟整體縮小，形態(tài)不規(guī)則，表面可見(jiàn)顆粒狀結(jié)節(jié)，顏色變至暗灰色，質(zhì)地較硬，失去光澤（圖1B）。③經(jīng)CCl4吸入誘導(dǎo)建模后，與正常對(duì)照組相比，CCl4吸入8 周和12 周的肝硬化PHT 組大鼠的PP 升高、MAP 降低（均P＜0.05）（圖1C、D）。

圖1 大鼠肝硬化PHT 模型的建立Fig 1 Establishment of PHT model of liver cirrhosis in rats

對(duì)3 組大鼠的肝臟組織的石蠟切片行H-E 染色，結(jié)果顯示：3 組組織的細(xì)胞核呈藍(lán)色、細(xì)胞質(zhì)呈紅色。正常對(duì)照組大鼠肝臟組織形態(tài)正常，以小葉中央靜脈為中心排列成放射狀細(xì)胞條索。CCl4吸入8 周和12 周組大鼠肝臟可見(jiàn)彌漫性肝竇和肝小葉結(jié)構(gòu)的破壞，纖維和膠原組織在匯管區(qū)，圓形或類(lèi)圓形的假小葉形成；其中，CCl4吸入12 周組較8 周組更甚，假小葉內(nèi)肝細(xì)胞成團(tuán)排列，未見(jiàn)正常肝竇結(jié)構(gòu)，血管及假小葉周?chē)醒准?xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)Masson 染色后，結(jié)果顯示：3 組肝臟組織的膠原纖維呈藍(lán)色。Sirius Red 染色后結(jié)果顯示：3 組肝臟組織的膠原纖維呈紅色，背景黃色。相較于正常對(duì)照組，CCl4吸入8 周組和12 周組大鼠的肝臟組織切片可見(jiàn)彌漫性膠原纖維組織廣泛增生，主要分布于假小葉周?chē)?；其中，CCl4吸入12周組較8 周組硬化更加嚴(yán)重，同時(shí)在肝竇、門(mén)脈、肝動(dòng)脈和中央靜脈周?chē)写罅康哪z原纖維沉積（圖1E）。綜上，大鼠肝硬化PHT 模型構(gòu)建成功。

2.2 大鼠SMA 重構(gòu)分析

SMA 冰凍切片經(jīng)H-E 染色后發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組大鼠SMA 彈性較好，鏡下結(jié)構(gòu)正常，分為內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）層、平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cell，SMC）層和動(dòng)脈外壁層。EC 層表面光滑，基底膜完整，細(xì)胞間隙之間連接緊密；SMC 層呈梭形排列成束，胞質(zhì)中可見(jiàn)明顯肌絲；動(dòng)脈外壁層可見(jiàn)彈性纖維、膠原纖維以及疏松結(jié)締組織排列規(guī)則。CCl4吸入8 周組大鼠的動(dòng)脈結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損壞，整體血管層次不清，有變薄傾向。在CCl4吸入12 周組，大鼠的血管EC 層基底膜不完整，細(xì)胞間隙連接較疏松，SMC 明顯減少，胞質(zhì)中肌絲少且紊亂，部分肌絲出現(xiàn)斷裂，SMA 明顯變?。▓D2A、B）。經(jīng)Image J 軟件定量后結(jié)果（圖2C ～F）顯示：與正常對(duì)照組相比，CCl4吸入12 周組大鼠的SMA 管壁厚度變?。≒=0.000）、管壁厚度和直徑比率下降（P=0.002）及整體血管壁面積減少（P=0.009）；3 組大鼠的SMA 管腔直徑間差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但CCl4吸入12 周組和吸入8 周組較正常對(duì)照組略有增加。

2.3 大鼠SMA 中鈣調(diào)蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)中段SMA 結(jié)構(gòu)中鈣調(diào)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果（圖3A ～C）顯示，CCl4吸入12 周組較正常對(duì)照組的棕色區(qū)域明顯減少，即鈣調(diào)蛋白表達(dá)下降；經(jīng)Image J 軟件定量后顯示，該差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。采用Western blotting 檢測(cè)剩余SMA 亦得到了同樣的結(jié)果（圖3D）。

2.4 大鼠SMA 中彈性蛋白表達(dá)的檢測(cè)

圖2 大鼠SMA 重構(gòu)分析Fig 2 Analysis of SMA reconstruction in rats

采用免疫熒光法檢測(cè)中段SMA 結(jié)構(gòu)中平滑肌層重要組成成分彈性蛋白的表達(dá)。結(jié)果（圖4A ～C）顯示：與正常對(duì)照組和CCl4吸入8 周組相比，CCl4吸入12 周組大鼠的陽(yáng)性信號(hào)（紅色）較弱，即彈性蛋白表達(dá)減少；經(jīng)Image J 軟件定量后顯示，CCl4吸入12 周組與正常對(duì)照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018）。采用Western blotting檢測(cè)剩余SMA 亦得到了同樣的結(jié)果（圖4D）。

圖3 免疫組織化學(xué)法和Western blotting 檢測(cè)3 組大鼠SMA 中鈣調(diào)蛋白的表達(dá)水平Fig 3 Expression levels of caldesmon in SMA among the three groups of rats by immunohistochemistry and Western blotting

2.5 大鼠SMA 中cleaved caspase-3 蛋白、Ki-67 蛋白表達(dá)的檢測(cè)

圖4 免疫熒光法檢測(cè)3 組大鼠SMA 中彈性蛋白的表達(dá)水平Fig 4 Expression levels of elastin in SMA among the three groups of rats by immunofluorescence

以cleaved caspase-3 蛋白水平作為凋亡信號(hào)，采用免疫熒光法檢測(cè)其在3 組大鼠中段SMA 中的表達(dá)，結(jié)果（圖5A、B）顯示：與正常對(duì)照組相比，CCl4吸入12 周組大鼠的中段SMA 中的EC 層、SMC 層和動(dòng)脈外壁層中的cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)細(xì)胞均有所增加（均P=0.000），即凋亡信號(hào)增強(qiáng)，其中以SMC 層增加最為明顯。以Ki-67蛋白水平作為增殖信號(hào)，采用上述方法檢測(cè)其在各組中段SMA 中的表達(dá)，結(jié)果（圖5C、D）顯示：與正常對(duì)照組 相比，CCl4吸入12 周組大鼠的中段SMA 中各層增殖信號(hào)均有所增加，且在EC 層和動(dòng)脈外壁層中較為顯著（均P=0.000）。

3 討論

圖5 免疫熒光法檢測(cè)3 組大鼠SMA 中cleaved caspase-3 蛋白和Ki-67 蛋白的表達(dá)水平Fig 5 Expression levels of cleaved caspase-3 and Ki-67 protein in SMA among the three groups of rats by immunofluorescence

肝硬化PHT 的基礎(chǔ)研究主要集中在肝內(nèi)和肝外兩部分。對(duì)于肝內(nèi)部分，研究旨在緩解肝硬化的進(jìn)一步發(fā)展，減少肝內(nèi)的纖維生成，降低肝內(nèi)血管阻力，從而降低PP；對(duì)于肝外部分，研究則主要致力于減少內(nèi)臟血管高動(dòng)力循環(huán)，改善SMA 的血管擴(kuò)張以及對(duì)血管舒張物質(zhì)的低反應(yīng)性。本研究結(jié)果表明：CCl4誘導(dǎo)的肝硬化PHT 模型不僅存在較高的PP，肝臟結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)了硬化改變；同時(shí)除了SMA 存在上述血管擴(kuò)張等功能性改變外，該模型亦存在血管重構(gòu)等結(jié)構(gòu)性改變。

不僅如此，本研究還發(fā)現(xiàn)肝硬化PHT 大鼠SMA 中的鈣調(diào)蛋白表達(dá)下降，而研究[12]發(fā)現(xiàn)依賴(lài)鈣調(diào)蛋白的肌球蛋白磷酸化作用即粗肌絲調(diào)節(jié)是血管平滑肌收縮的重要環(huán)節(jié)。鈣調(diào)蛋白是一種多功能的鈣結(jié)合蛋白質(zhì)，含150 個(gè)氨基酸，結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，對(duì)鈣具有高度親和性；該蛋白能結(jié)合肌動(dòng)蛋白共存于細(xì)肌絲中，還可通過(guò)可逆的磷酸化、去磷酸化反應(yīng)抑制肌球蛋白ATP 活力[13]。在本研究中，SMA 變薄主要發(fā)生在血管SMC 層，因此鈣調(diào)蛋白表達(dá)下降可能是導(dǎo)致血管SMC 層結(jié)構(gòu)和功能變化的關(guān)鍵點(diǎn)。上調(diào)鈣調(diào)蛋白的表達(dá)可引起SMA 鈣信號(hào)增強(qiáng)以及下游基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)血管恢復(fù)收縮功能，減緩血管擴(kuò)張，減輕血管重構(gòu)對(duì)肝硬化PHT 帶來(lái)的不利影響。

彈性蛋白是一種既耐酸又耐堿的細(xì)胞外高分子基質(zhì)蛋白[14]。目前已經(jīng)證明其在腦血管疾病中有重要作用，如腦動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、煙霧病等。彈性蛋白是構(gòu)成彈性膜或彈性纖維的成分之一，亦是動(dòng)脈壁的主要成分，具有動(dòng)脈伸縮、舒張功能，在正常壓力下可支撐血管以拮抗管壁塌陷。同時(shí)，該蛋白可減緩血流對(duì)血管的沖擊力，從而降低血流阻力、剪切力、循環(huán)應(yīng)變力等，在彈性動(dòng)脈中起到穩(wěn)定血流的作用[15]。此外，彈性蛋白還具有調(diào)控SMC 和穩(wěn)定動(dòng)脈構(gòu)筑的功能[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)，大鼠的主動(dòng)脈彈力層由6 ～10 層彈性蛋白構(gòu)成，而人主動(dòng)脈則由40 ～70 層構(gòu)成。離體和在體實(shí)驗(yàn)[18]表明，物理因素（包括血壓、血流、外傷等）、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、藥物和激素等均可影響動(dòng)脈彈性蛋白的合成。本研究發(fā)現(xiàn)其在肝硬化PHT 的SMA 中同樣發(fā)生大面積減少，繼而提示SMA 重構(gòu)與彈性蛋白相關(guān)。所以，肝硬化PHT 大鼠SMA中彈性蛋白的合成減少，將會(huì)引起血管壁的變薄、收縮功能的減弱，從而加劇PHT 的發(fā)展。因此，增加以彈性蛋白為主要結(jié)構(gòu)的平滑肌層，應(yīng)當(dāng)成為改善PHT 動(dòng)脈重構(gòu)的關(guān)鍵。

本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化PHT 的SMA 血管壁存在不同程度的凋亡和增殖，但SMC 層凋亡信號(hào)較強(qiáng)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常血管與淋巴管一樣，由EC 層、SMC 層和血管外壁層共同組成，存在一定的滲透壓，能夠維護(hù)組織穩(wěn)態(tài)，具有較好的屏障作用。而在本研究中，肝硬化PHT大鼠SMA 的動(dòng)脈血管的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，與正常對(duì)照組間存在較大差異。因此，動(dòng)脈壁的變薄，尤其是凋亡增多導(dǎo)致SMC 層的急劇減少，各功能蛋白和收縮蛋白表達(dá)下降，肝外SMA 形態(tài)和結(jié)構(gòu)逐步類(lèi)似淋巴管，均可能是肝硬化PHT 患者腹水增多的原因。

綜上所述，肝硬化PHT 的肝外SMA 存在血管重構(gòu)變薄現(xiàn)象，且相關(guān)收縮結(jié)構(gòu)蛋白如鈣調(diào)蛋白、彈性蛋白的表達(dá)均急劇下降，平滑肌層凋亡增多，受損嚴(yán)重。因此，如何調(diào)控PHT 的動(dòng)脈重構(gòu)對(duì)其血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，從而降低PP、緩解肝硬化PHT 的發(fā)生與發(fā)展將是我們未來(lái)研究的重點(diǎn)；同時(shí)，對(duì)該方向的深入探討也或可為肝硬化PHT 患者的外科綜合治療提供新的思路。

參·考·文·獻(xiàn)

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