房仙穎，周江蓮，王靖秋，湯鋒，趙林果*

(1.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京 210037；2.國(guó)際竹藤中心，北京 100102)

桂花 (Osmanthusfragrans)是我國(guó)傳統(tǒng)的名花，兼具觀賞性、食用性、生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。根據(jù)桂花開(kāi)花季節(jié)的不同，分為四季桂和秋桂兩類(lèi)；根據(jù)桂花花色的不同，分為金桂、丹桂和銀桂3個(gè)品種群[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為桂花入藥可活血化瘀、補(bǔ)脾益腎，用于治療胃痛、扭傷、牙痛以及風(fēng)濕麻木等病癥。然而，目前桂花的開(kāi)發(fā)主要集中在浸膏、精油的提取和食材應(yīng)用(桂花茶、桂花酒等)上。由于桂花浸膏和桂花精油的提取率極低[2]，如果將桂花浸膏/精油提取后的桂花渣粕拋棄將造成桂花資源的浪費(fèi)。另一方面，桂花中含有黃酮類(lèi)化合物、酚類(lèi)化合物、葉綠素、綠原酸、毛蕊花糖苷等非揮發(fā)性成分，這些成分均具有廣泛的生物活性[3]，特別是黃酮類(lèi)化合物[4]。然而，關(guān)于桂花黃酮類(lèi)化合物的應(yīng)用研究非常少，也未見(jiàn)相關(guān)產(chǎn)品，原因可能與桂花提取物的活性成分研究不夠細(xì)致或粗提物活性不高有關(guān)[5]。因此，這些活性物質(zhì)是否殘留在提取渣中、如何進(jìn)一步提高黃酮類(lèi)化合物的生物活性都是值得深入研究的課題。

天然黃酮多以糖苷形式存在，桂花黃酮亦是如此，包括蘆丁、柚皮苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等[6]。Xiao等[7]研究表明，O-糖基化數(shù)目的減少能增強(qiáng)黃酮抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗菌和抗腫瘤等活性。如果通過(guò)糖苷酶對(duì)桂花黃酮進(jìn)行催化，有望增強(qiáng)其生物活性，進(jìn)而提高應(yīng)用價(jià)值[8]。通過(guò)分析桂花黃酮主要成分的種類(lèi)及結(jié)構(gòu)可知，其糖苷主要有葡萄糖苷，以及少量的鼠李糖苷[6]。利用優(yōu)良的β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶可以選擇性切斷其中O-糖苷上的糖基[9]。

筆者以桂花及其渣粕為原料，用乙醇熱回流法提取并用蘆丁法檢測(cè)其中的桂花黃酮含量；通過(guò)生物酶催化，比較催化前后桂花黃酮的生物活性。研究結(jié)果可為桂花資源的綜合高效利用提供新思路，為制備生物活性更強(qiáng)的桂花黃酮提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

桂花采摘于南京林業(yè)大學(xué)校園，品種由南京林業(yè)大學(xué)桂花登錄中心鑒定，分別為金桂、銀桂、丹桂和四季桂；蘆丁、毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司；大孔樹(shù)脂HPD400購(gòu)于南京姜華化玻有限公司；Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)、 Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；對(duì)硝基苯酚-β-D-葡萄糖、對(duì)硝基苯酚-α-L-鼠李糖苷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和二甲亞砜(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；胰酶消化液、NO檢測(cè)試劑盒、噻唑藍(lán)(MTT)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Cell signaling technology(CST)抗體cleaved-Caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)3, 6, 7, 9、cleaved-PARP和GAPDH購(gòu)于上海優(yōu)寧維生物科技有限公司。其他常規(guī)化學(xué)試劑均購(gòu)于南京化學(xué)試劑有限公司。

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞、人HepG2肝癌細(xì)胞和小鼠CT26結(jié)腸癌細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞的培養(yǎng)條件為RPMI-1640完全培養(yǎng)基(添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS)，37 ℃，5%CO2；HepG2和CT26細(xì)胞的培養(yǎng)條件為DMEM完全培養(yǎng)基(添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS)，37 ℃，5%CO2。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SpectraMax190型酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；1260型HPLC，美國(guó)Agilent公司；SJIA-10N-50A 型小型臺(tái)式冷凍干燥機(jī)，寧波市雙嘉儀器有限公司；RV 05 Basic旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA公司；CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；垂直平板電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光成像儀，美國(guó)Gene公司。

1.3 桂花黃酮的提取及含量測(cè)定

將新鮮桂花洗凈于60 ℃下干燥48 h，至含水率<5%。以干燥花朵或桂花渣粕為原料，采用乙醇回流提取法提取活性成分。提取工藝為80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液， 料液比1∶50(g∶mL)，70 ℃回流提取3次，每次2 h，合并濾液，用80%乙醇溶液定容至600 mL。取5 μL提取液，按照蘆丁法[3]測(cè)定總黃酮含量。

1.4 桂花渣粕制備

取干燥桂花粉末適量，加入5倍于粉末質(zhì)量的蒸餾水，連接揮發(fā)油提取裝置，采用水蒸氣蒸餾法提取桂花精油[10]，回流提取5～6 h，收集揮發(fā)油。將燒瓶中的桂花-水混懸液進(jìn)行減壓濃縮并干燥，得到桂花渣粕。

1.5 桂花黃酮的HPLC檢測(cè)條件

色譜柱為XDB-C18柱[4.6 mm×250 mm(直徑×長(zhǎng)度), 填料顆粒直徑5 μm]；柱溫40 ℃；流動(dòng)相為甲醇(A)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液(B)：0～30 min內(nèi)VA∶VB從50∶50升至80∶20， 30～37 min內(nèi)VA∶VB從80∶20降至50∶50；檢測(cè)波長(zhǎng)為280，320和360 nm；進(jìn)樣量為10 μL；流速為0.8 mL/min。

1.6 桂花黃酮的純化

對(duì)桂花黃酮提取液進(jìn)行減壓濃縮，得到水濃縮液。濃縮液經(jīng)HPD400大孔樹(shù)脂柱純化，依次用3倍柱體積的水、20%(體積分?jǐn)?shù))乙醇和80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫，收集80%洗脫部分，減壓濃縮除去乙醇后，冷凍干燥，備用。

1.7 糖苷酶的制備

β-葡萄糖苷酶由重組大腸桿菌pET-20b-Tpebgl3高效表達(dá)獲得，Tpebgl3基因來(lái)源于嗜熱菌ThermotogapetrophilaRKU-1。α-L-鼠李糖苷酶由重組酵母菌pPICZαA-AtRha高效表達(dá)獲得，AtRha基因來(lái)源于AspergillusterreusCCF 3059。上述兩種基因重組菌均為南京林業(yè)大學(xué)微生物技術(shù)研究室研發(fā)，酶制劑制備及酶活力測(cè)定參照文獻(xiàn)[11-13]。

1.8 桂花總黃酮的酶法催化

對(duì)照組：向1 000 μL反應(yīng)體系中加入100 μL 100 mg/mL 的桂花黃酮儲(chǔ)備液，900 μL純水，再加入1 000 μL甲醇。酸水解組：向1 000 μL反應(yīng)體系中加入100 μL 100 mg/mL的桂花總黃酮儲(chǔ)備液，900 μL酸水解液(甲醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%HCl，體積比為 4∶1)，80 ℃反應(yīng)2 h后，冷卻反應(yīng)液，再加入1 000 μL甲醇。

β-葡萄糖苷酶(BG)/α-L-鼠李糖苷酶(Rha)催化：向1 000 μL反應(yīng)體系中加入100 μL 100 mg/mL的桂花總黃酮儲(chǔ)備液，加入90 U BG 或者25 U Rha，最后補(bǔ)加去離子水至1 000 μL。BG組于90 ℃反應(yīng)1 h，Rha組于65 ℃反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束冷卻反應(yīng)液，加入1 000 μL甲醇終止反應(yīng)。

雙酶聯(lián)用Rha-BG：向1 000 μL反應(yīng)體系中加入100 μL 100 mg/mL的桂花總黃酮儲(chǔ)備液，加入25 U Rha，65 ℃反應(yīng)1 h，隨后加入90 U BG，待90 ℃反應(yīng)1 h，加入去離子水使反應(yīng)體系為1 000 μL。冷卻反應(yīng)液，加入1 000 μL甲醇終止反應(yīng)。

雙酶聯(lián)用BG-Rha：同上，改變加酶順序。

將酶解前和單獨(dú)使用酸水解液、Rha和BG催化、雙酶聯(lián)用催化后的樣品分別進(jìn)行HPLC分析。

向上述水解體系中加入過(guò)量乙醇，待酶沉淀后過(guò)濾除去，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓干燥，制成粉末，用DMSO配成100 mg/mL的儲(chǔ)備液，用于生物活性的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

1.9 Griess法測(cè)定抗炎活性

按照NO檢測(cè)試劑盒(Griess法)說(shuō)明進(jìn)行：取對(duì)數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以2×105個(gè)/mL 的密度接種于96孔板中，每孔100 μL；培養(yǎng)24 h后，以不同質(zhì)量濃度的化合物(1，10和100 μg/mL，每孔50 μL)及500 ng/mL 脂多糖(LPS，每孔50 μL)處理細(xì)胞。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以含DMSO的培養(yǎng)液作對(duì)照?；衔镒饔?8 h后，吸取細(xì)胞上清100 μL至酶標(biāo)板中，加入混勻后的Griess試劑100 μL，顯色10 min后540 nm處測(cè)吸光度。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±誤差值。

1.10 DPPH自由基清除試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[14]中的方法，將樣品用甲醇配制成一系列質(zhì)量濃度，取100 μL樣品(100，300和900 μg/mL)加入100 μL DPPH溶液(0.15 mg/mL，純甲醇為溶劑)，混勻，避光放置30 min后測(cè)定514 nm處吸光度。每份樣品平行操作3 次，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±誤差值。計(jì)算公式如下:

清除率=[(AC-AS)/AC]×100%

(1)

式中：AC為0.1 mL DPPH溶液與0.1 mL甲醇混合后的吸光度；AS為0.1 mL DPPH溶液與0.1 mL樣品混合后的吸光度。

1.11 MTT法測(cè)定抗腫瘤活性

以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后，在96孔板中每孔接種3×103個(gè)細(xì)胞100 μL，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入不同質(zhì)量濃度化合物(1，10和100 μg/mL，每孔100 μL)共培養(yǎng)，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)72 h。終止培養(yǎng)前4 h加入20 μL MTT(4 mg/mL)培養(yǎng)基溶液。4 h后吸去上清，每孔加入200 μL DMSO，振蕩，使沉淀完全溶解，540 nm處測(cè)吸光度，并記錄讀數(shù)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±誤差值。

1.12 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

在6孔板中按每孔5×105個(gè)HepG2細(xì)胞種板，待細(xì)胞貼壁后加入指定濃度的化合物，培養(yǎng)24 h后，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗一遍，消化、收集細(xì)胞。取(5～10)×104個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，先加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。接著加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，混勻，室溫下避光孵育10～20 min，置于冰浴中，隨即用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)。

1.13 免疫印跡分析(Western Blotting，WB)

收集經(jīng)不同質(zhì)量濃度化合物處理后的HepG2細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌一次，細(xì)胞計(jì)數(shù)。各取1×106個(gè)細(xì)胞，加入150 μL的蛋白裂解液得到總細(xì)胞蛋白，用BCA法定量。以50 μg的蛋白量上樣，聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。按抗體說(shuō)明書(shū)孵育一抗和二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色并于化學(xué)發(fā)光成像儀中拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 桂花原料及桂花渣粕中總黃酮含量的測(cè)定

分別以金桂、銀桂、丹桂和四季桂的花瓣為原料，用熱回流提取法提取并計(jì)算桂花中的總黃酮含量。結(jié)果表明，金桂的總黃酮含量最高，約為42.6%，且4種桂花中的總黃酮含量差異不大。采用水蒸氣蒸餾法提取金桂中的桂花精油，收集桂花渣粕，采用熱回流提取法對(duì)桂花渣總黃酮進(jìn)行提取，測(cè)定其總黃酮含量約為38.6%，較原料花瓣中總黃酮僅有少量損失。此外，用HPLC法對(duì)桂花黃酮提取物中的毛蕊花糖苷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷在桂花渣粕中的含量約為5.50%。毛蕊花糖苷屬于苯丙素苷類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、促進(jìn)傷口愈合、神經(jīng)保護(hù)等生物活性[15]。研究結(jié)果表明桂花提取渣是一種值得精深加工的寶貴資源。

2.2 桂花黃酮的純化及酶法催化

由于天然產(chǎn)物的醇提物中除了黃酮類(lèi)物質(zhì)，還有大量的多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)[16]。因此，用中極性的HPD400大孔樹(shù)脂對(duì)桂花黃酮進(jìn)行了純化，除去多糖、蛋白等成分。天然黃酮多以糖苷形式存在，有研究表明，糖基數(shù)量的減少有利于抗炎、氧化、抗腫瘤等活性的提升。因此，采用Rha和/或BG對(duì)桂花黃酮進(jìn)行酶解處理，結(jié)果如圖1所示。桂花渣粕黃酮提取物經(jīng)BG催化后，在HPLC特征圖譜的11.667，16.153，17.498，18.022，19.512和23.104 min位置出現(xiàn)峰面積的大幅增加，在10 min內(nèi)出現(xiàn)的峰則發(fā)生了顯著的峰面積減少，說(shuō)明該酶僅能特異性地切掉糖苷物質(zhì)末端的葡萄糖。前期研究結(jié)果顯示，桂花黃酮糖苷在該檢測(cè)條件下出峰時(shí)間在10 min之前，而苷元在9 min后，由此說(shuō)明有一部分桂花黃酮可能被β-葡萄糖苷酶水解為苷元了，而Rha催化前后的圖譜變化較小，表明桂花黃酮糖苷的末端幾乎沒(méi)有可被Rha切斷的鼠李糖。BG和雙酶聯(lián)合催化的結(jié)果相似，并且雙酶聯(lián)合催化的加酶順序?qū)Υ呋Y(jié)果影響較小，說(shuō)明桂花黃酮苷中末端或者次末端為葡萄糖基的較多，幾乎沒(méi)有鼠李糖基。

此外，通過(guò)與酸水解組的結(jié)果比較可知，糖苷酶水解具有專(zhuān)一性，僅會(huì)切斷黃酮母核上連接的糖苷鍵，不會(huì)破壞黃酮母核；而酸水解無(wú)選擇性，可以切斷所有糖苷鍵甚至?xí)茐狞S酮的母核結(jié)構(gòu)。毛蕊花糖苷的糖基分子不在末端，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這2個(gè)糖苷酶不會(huì)改變其結(jié)構(gòu)(圖1)。因此，桂花渣粕黃酮提取物經(jīng)Rha和BG催化后，總黃酮和毛蕊花糖苷的含量不會(huì)改變，說(shuō)明利用生物酶水解黃酮糖苷具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖1 桂花黃酮酶法催化前后的HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of Osmanthus flavonoids before and after enzymatic conversion

2.3 桂花黃酮酶法催化前后抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性比較

用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥模型，通過(guò)Griess試劑顯色法檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞NO的釋放量，其抗炎活性結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，桂花黃酮對(duì)照組在低濃度下幾乎沒(méi)有抗炎活性；在10 μg/mL時(shí)，經(jīng)BG催化和BG-Rha雙酶催化后抗炎活性較對(duì)照組顯著提高；在高濃度下，酶催化后樣品的抗炎活性顯著高于對(duì)照組，抑制率均達(dá)95%以上。由IC50值可看出，要達(dá)到50%抗炎抑制率，經(jīng)BG催化后的桂花黃酮所需要的質(zhì)量濃度最低，為8.26 μg/mL。

圖2 桂花黃酮酶法催化前后對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的抑制作用Fig. 2 Inhibition on LPS-induced NO production of RAW 264.7 cells by Osmanthus flavonoids before and after enzymatic conversion

桂花黃酮酶法催化前后對(duì)DPPH自由基清除作用的結(jié)果如圖3所示，5組樣品在低濃度時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除能力都比較弱，隨著濃度的升高，清除DPPH自由基能力均逐漸增強(qiáng)，其中經(jīng)酶處理后的樣品的抗氧化活性明顯高于未經(jīng)處理的對(duì)照組樣品。經(jīng)BG處理后樣品的抗氧化活性最高，達(dá)到50%清除率(IC50)所需的質(zhì)量濃度最低，為493.44 μg/mL。

圖3 桂花黃酮酶法催化前后對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig. 3 DPPH radical-scavenging activity of Osmanthus flavonoids before and after enzymatic conversion

圖4 桂花黃酮酶法催化前后抗腫瘤活性Fig. 4 Antitumor activity of ethanol extract from Osmanthus flavonoids before and after enzymatic conversion

酶法催化前后桂花黃酮對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞和小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞體外增殖的影響如圖4所示。在高濃度下，酶法催化可顯著提高桂花黃酮的抗腫瘤活性。BG處理后的桂花黃酮對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率可高達(dá)85%，IC50值為51.32 μg/mL；對(duì)CT26細(xì)胞增值的抑制率可達(dá)到80%，IC50值為55.81 μg/mL。由此可知，單獨(dú)使用BG催化對(duì)桂花黃酮抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性的提高作用最強(qiáng)。根據(jù)HPLC圖譜的分析，有一部分桂花黃酮可能被BG水解為苷元，黃酮母核上連接的糖基數(shù)的減少有利于增加上述3種活性。雙酶聯(lián)用雖然同樣能減少黃酮母核上連接的糖基數(shù)，但部分結(jié)構(gòu)的改變未能體現(xiàn)在HPLC圖譜上，需要借助分辨度更高的檢測(cè)方法才能分析出差異；Rha催化對(duì)桂花黃酮組成的影響則相對(duì)較小。因此，綜合考慮酶法催化前后桂花黃酮的HPLC檢測(cè)圖譜變化情況、活性變化情況以及生產(chǎn)成本，比較適宜的方案是單獨(dú)使用β-葡萄糖苷酶對(duì)桂花黃酮進(jìn)行催化。通常對(duì)體內(nèi)炎癥的抑制和氧化水平的控制有助于腫瘤的治療[17]，酶法催化后的桂花黃酮對(duì)人源HepG2細(xì)胞的IC50值比對(duì)小鼠源的CT26細(xì)胞還低，說(shuō)明桂花黃酮在防治肝癌方面有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

2.4 桂花黃酮對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡的影響

凋亡是清除腫瘤細(xì)胞的主要途徑，不會(huì)給正常的細(xì)胞或周邊組織帶來(lái)過(guò)度損傷[18]。以BG催化后的桂花黃酮為原料，考察其抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。細(xì)胞凋亡早期的特征之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，用FITC-Annexin V可檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS；PI可以穿透凋亡晚期和死細(xì)胞的破損細(xì)胞膜，嵌入雙鏈DNA并使細(xì)胞核染紅。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V/PI雙染的細(xì)胞可以觀察細(xì)胞凋亡情況，并區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡/壞死的細(xì)胞，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，桂花總黃酮能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡，在100 μg/mL的質(zhì)量濃度下細(xì)胞早期凋亡率為14.90%，總凋亡率為23.88%。

圖5 β-葡萄糖苷酶催化后的桂花黃酮對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig. 5 Effects of Osmanthus flavonoids transformed by β-glucosidase on apoptosis of HepG2 cells

圖6 桂花黃酮對(duì)細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effects of Osmanthus flavonoids on the expression of related proteins in cell apoptotic pathway

Caspase家族蛋白的活化是凋亡中的關(guān)鍵步驟，哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡主要分為2個(gè)途徑：一是線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性通路，發(fā)生Caspase 9的剪切；另一個(gè)是死亡受體介導(dǎo)的外源性通路，發(fā)生Caspase 8的剪切[19]。筆者通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了桂花黃酮對(duì)凋亡通路相關(guān)的級(jí)聯(lián)剪切蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖6所示。桂花黃酮在100 μg/mL的質(zhì)量濃度下可以導(dǎo)致Caspase 9的剪切，進(jìn)而導(dǎo)致Caspase 7和Caspase 3的剪切，最終促進(jìn)多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的剪切。結(jié)果表明，桂花黃酮可能通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡。

3 結(jié) 論

1)金桂花瓣以水蒸氣蒸餾法提取精油后，桂花渣中的總黃酮含量還高達(dá)38.7%，與未提取精油前相比損失未超過(guò)5%，并且桂花渣中毛蕊花糖苷的含量為5.5%，故提取渣具有很好的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

2)利用β-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶和雙酶聯(lián)用對(duì)純化后的桂花黃酮進(jìn)行催化，桂花黃酮有相當(dāng)一部分以糖苷形式存在，其末端多為葡萄糖基，但末端為鼠李糖基的糖苷存在很少。

3)酶法催化后桂花黃酮的抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性均得到了不同程度的提高。其中，經(jīng)β-葡萄糖苷酶催化得到的桂花黃酮活性最好，對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型的IC50值由34.55 μg/mL 下降到8.26 μg/mL；對(duì)DPPH自由基清除作用的IC50值由大于900.00 μg/mL下降到493.44 μg/mL；對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的IC50值由大于100.00 μg/mL降至51.32 μg/mL；對(duì)小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞增殖的IC50值由大于100.00 μg/mL降至55.81 μg/mL。

4) 抑制體內(nèi)炎癥和降低細(xì)胞氧化水平有助于腫瘤的治療，而桂花黃酮對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞體外增殖表現(xiàn)出顯著的抑制作用，提示桂花黃酮在防治肝癌方面具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。通過(guò)流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，桂花黃酮能夠在早期誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡，并且可能是通過(guò)線粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，桂花提取精油后的渣不應(yīng)直接作為廢棄物處理，值得對(duì)桂花渣中的活性物質(zhì)深入開(kāi)發(fā)，實(shí)現(xiàn)桂花資源的綜合高效利用。